Tổng quan nghiên cứu

Camptothecin (CPT) là một alkaloid monoterpenoid indole có công thức hóa học C({20})H({10})N({2})O({4}), được biết đến với hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ. Từ khi được phát hiện vào năm 1966 trong cây Hỷ thụ (Camptotheca acuminata), CPT đã trở thành hợp chất quan trọng trong điều trị các loại ung thư như ung thư vú, dạ dày, buồng trứng và khối u ác tính. Tuy nhiên, nguồn cung CPT từ thực vật tự nhiên rất hạn chế, với số lượng cây Hỷ thụ ngoài tự nhiên ước tính chỉ khoảng 4.000 cây trong khi nhu cầu thị trường lên đến hàng trăm triệu cây. Do đó, việc tìm kiếm nguồn sản xuất CPT thay thế là cấp thiết.

Vi nấm nội sinh, sinh vật cư trú bên trong mô thực vật, được xem là nguồn tiềm năng để sản xuất CPT do khả năng sinh trưởng nhanh và dễ dàng mở rộng quy mô nuôi cấy. Nghiên cứu này tập trung phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp CPT từ cây mẫu đơn đỏ (Ixora coccinea L) tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Việt Nam – một khu vực có thảm thực vật phong phú và điều kiện khí hậu đặc thù thuận lợi cho sự phát triển của vi nấm nội sinh.

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập các chủng vi nấm nội sinh từ các bộ phận khác nhau của cây mẫu đơn đỏ, định danh các chủng bằng giải trình tự gen ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CPT trong môi trường lên men. Nghiên cứu có phạm vi thực hiện tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên trong năm 2022, góp phần mở rộng hiểu biết về nguồn vi nấm nội sinh sản xuất CPT tại Việt Nam, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho phát triển công nghệ sinh học sản xuất CPT bền vững, giảm áp lực khai thác thực vật hoang dã.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Lý thuyết về vi nấm nội sinh (endophytes): Vi nấm nội sinh là các vi sinh vật sống bên trong mô thực vật mà không gây bệnh, có khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng, bao gồm các alkaloid như CPT. Vi nấm nội sinh có thể sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp tương tự hoặc khác biệt so với cây chủ.

  • Mô hình sinh tổng hợp Camptothecin: CPT được tổng hợp qua con đường monoterpene indole alkaloid (MIA), bắt đầu từ tiền chất tryptamine và secologanin, qua các bước enzymatic phức tạp, trong đó strictosidine là chất trung gian quan trọng. Tuy nhiên, một số enzyme trong con đường này vẫn chưa được xác định đầy đủ, đặc biệt trong vi nấm nội sinh.

  • Khái niệm mã vạch DNA (DNA barcode): Sử dụng trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 làm mã vạch để định danh chính xác các chủng vi nấm nội sinh, giúp phân loại và xác định nguồn gốc loài.

  • Phương pháp sắc ký và khối phổ: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ phân giải cao được sử dụng để phát hiện và định lượng CPT trong cao chiết dịch nuôi cấy và sinh khối vi nấm.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu cây mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L được thu thập từ sáu cây khỏe mạnh tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai, Việt Nam. Các bộ phận thu hái gồm rễ, thân, lá và hoa, tổng cộng 48 mẫu vật.

  • Phương pháp thu thập và xử lý mẫu: Mẫu được bảo quản lạnh, khử trùng bề mặt bằng ethanol 70% và dung dịch sodium hypochlorite với nồng độ phù hợp từng bộ phận để loại bỏ nấm biểu sinh mà không làm tổn thương vi nấm nội sinh.

  • Phân lập vi nấm nội sinh: Mẫu được cắt nhỏ, cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh penicillin và streptomycin, ủ tối ở 28℃ trong 5-7 ngày. Các chủng nấm phát triển được phân lập thuần chủng.

  • Định danh vi nấm nội sinh: DNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp CTAB, kiểm tra chất lượng bằng điện di gel agarose và máy đo Nanodrop. Khuếch đại đoạn ITS1-5,8S rRNA-ITS2 bằng PCR với cặp mồi ITS4-ITS5, sau đó tinh sạch và giải trình tự Sanger. Dữ liệu trình tự được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI và phân tích xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA X.

  • Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp CPT: Các chủng vi nấm được nuôi cấy trong môi trường lỏng, thu cao chiết từ dịch nuôi và sinh khối bằng dung môi Dichloromethane: Methanol (9:1). Phát hiện CPT bằng sắc ký lớp mỏng TLC dưới bước sóng UV 254nm và 366nm, định lượng bằng HPLC với detector UV bước sóng 366nm, thời gian lưu CPT khoảng 17 phút. Xác nhận cấu trúc bằng khối phổ phân giải cao.

  • Đánh giá đặc điểm sinh học: Quan sát hình thái, kích thước bào tử, màu sắc khuẩn ty khí sinh và cơ chất, tốc độ sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau bằng kính hiển vi quang học.

  • Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập vi nấm trong 3 tháng đầu năm 2022; định danh và giải trình tự trong 3 tháng tiếp theo; sàng lọc CPT và phân tích hóa học trong 4 tháng; đánh giá đặc điểm sinh học và tổng hợp báo cáo trong 2 tháng cuối năm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và đa dạng vi nấm nội sinh: Từ 48 mẫu vật thu thập, đã phân lập được 48 chủng vi nấm nội sinh, trong đó 16 chủng từ lá, 19 chủng từ thân, 7 chủng từ hoa và 6 chủng từ rễ. Điều này cho thấy sự phân bố đa dạng của vi nấm nội sinh trên các bộ phận cây mẫu đơn đỏ.

  2. Định danh bằng giải trình tự ITS: Các chủng vi nấm được định danh chính xác dựa trên trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2, cho phép phân loại vào các chi phổ biến như Colletotrichum, Diaporthe, Fusarium, Xylaria,... Một số chủng như Colletotrichum siamense I3L1 và Diaporthe cf heveae I8T3 được xác định rõ ràng.

  3. Khả năng sinh tổng hợp CPT: Qua phương pháp TLC và HPLC, phát hiện CPT trong cao chiết dịch nuôi và sinh khối của một số chủng vi nấm nội sinh. Nồng độ CPT trong dịch nuôi cấy của chủng I3L1 đạt khoảng 42,9 µg/L, trong khi chủng I8T3 đạt khoảng 33,1 µg/L. So với các nghiên cứu trước, đây là mức CPT có ý nghĩa, chứng tỏ tiềm năng sản xuất CPT từ vi nấm nội sinh cây mẫu đơn đỏ.

  4. Xác nhận cấu trúc CPT: Kết quả khối phổ phân giải cao cho thấy các ion phân tử có tỉ lệ khối lượng/điện tích (m/z) phù hợp với CPT chuẩn, khẳng định sự hiện diện của CPT trong các mẫu cao chiết.

Thảo luận kết quả

Sự đa dạng vi nấm nội sinh trên cây mẫu đơn đỏ phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vi nấm nội sinh trên các loài thực vật dược liệu. Việc phát hiện CPT trong một số chủng vi nấm nội sinh cho thấy khả năng tổng hợp hợp chất này không chỉ giới hạn ở cây chủ mà còn có thể do vi nấm nội sinh sản xuất, hỗ trợ giả thuyết CPT có nguồn gốc từ vi nấm nội sinh xâm nhập vào cây nhiệt đới.

Nồng độ CPT thu được từ vi nấm nội sinh tuy thấp hơn so với cây Hỷ thụ tự nhiên (dao động 0,012–0,236%) nhưng vượt trội về thời gian sinh trưởng nhanh và khả năng nuôi cấy quy mô lớn. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế về vi nấm nội sinh sản xuất CPT, đồng thời mở ra hướng phát triển công nghệ sinh học sản xuất CPT bền vững.

Việc thu đồng thời cao chiết từ dịch nuôi và sinh khối tế bào giúp không bỏ sót nguồn CPT tiềm năng, cải thiện độ chính xác trong sàng lọc. Các đặc điểm sinh học của chủng Colletotrichum siamense I3L1 và Diaporthe cf heveae I8T3 cũng được đánh giá, cung cấp thông tin cần thiết cho việc tối ưu điều kiện nuôi cấy.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố chủng vi nấm theo bộ phận cây, biểu đồ nồng độ CPT trong các chủng vi nấm và bảng so sánh đặc điểm sinh học các chủng tuyển chọn, giúp minh họa rõ ràng kết quả nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Phát triển quy trình nuôi cấy vi nấm nội sinh quy mô công nghiệp: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, dinh dưỡng) nhằm tăng sản lượng CPT, hướng tới mục tiêu nâng cao nồng độ CPT lên ít nhất gấp 2 lần trong vòng 12 tháng. Chủ thể thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học, các doanh nghiệp công nghệ sinh học.

  2. Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật sàng lọc và định danh vi nấm nội sinh: Áp dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để mở rộng phạm vi phát hiện các chủng tiềm năng, rút ngắn thời gian sàng lọc xuống còn 6 tháng. Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu sinh học phân tử.

  3. Xây dựng ngân hàng chủng vi nấm nội sinh có khả năng sản xuất CPT: Lưu giữ và bảo tồn các chủng vi nấm có hiệu suất cao, phục vụ nghiên cứu và sản xuất lâu dài. Chủ thể thực hiện: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

  4. Hợp tác nghiên cứu đa ngành: Kết hợp giữa công nghệ sinh học, hóa học phân tích và dược lý để đánh giá hiệu quả sinh học và an toàn của CPT từ vi nấm nội sinh, hướng tới phát triển sản phẩm thuốc điều trị ung thư trong vòng 3-5 năm. Chủ thể thực hiện: Các trường đại học, viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và vi sinh vật: Luận văn cung cấp phương pháp phân lập, định danh và sàng lọc vi nấm nội sinh sản xuất CPT, hỗ trợ phát triển nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học.

  2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và hợp chất sinh học: Thông tin về tiềm năng sản xuất CPT từ vi nấm nội sinh giúp doanh nghiệp phát triển quy trình sản xuất CPT bền vững, giảm phụ thuộc vào nguồn thực vật tự nhiên.

  3. Chuyên gia trong lĩnh vực dược liệu và y học cổ truyền: Nghiên cứu mở rộng hiểu biết về nguồn gốc và khả năng sản xuất hợp chất chống ung thư từ cây mẫu đơn đỏ và vi nấm nội sinh, hỗ trợ phát triển các sản phẩm dược liệu mới.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, hóa sinh: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về kỹ thuật phân lập, định danh vi nấm nội sinh, phương pháp phân tích hóa học và ứng dụng trong nghiên cứu hợp chất sinh học.

Câu hỏi thường gặp

  1. Vi nấm nội sinh là gì và tại sao lại quan trọng trong sản xuất Camptothecin?
    Vi nấm nội sinh là các vi nấm sống bên trong mô thực vật mà không gây hại. Chúng có khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng như CPT, giúp tạo nguồn sản xuất bền vững, giảm áp lực khai thác thực vật tự nhiên.

  2. Phương pháp nào được sử dụng để định danh các chủng vi nấm nội sinh?
    Phương pháp định danh dựa trên giải trình tự gen ITS1-5,8S rRNA-ITS2, sử dụng PCR và giải trình tự Sanger, cho phép phân loại chính xác các chủng vi nấm nội sinh.

  3. Làm thế nào để phát hiện và định lượng Camptothecin trong vi nấm nội sinh?
    CPT được phát hiện bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) dưới ánh sáng UV và định lượng chính xác bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV bước sóng 366nm, xác nhận cấu trúc bằng khối phổ phân giải cao.

  4. Tại sao cần thu cao chiết từ cả dịch nuôi cấy và sinh khối tế bào?
    Thu đồng thời giúp không bỏ sót CPT có thể hòa tan trong dịch nuôi hoặc tích tụ trong sinh khối tế bào, đảm bảo đánh giá đầy đủ khả năng sản xuất CPT của vi nấm.

  5. Khó khăn chính trong việc sử dụng vi nấm nội sinh để sản xuất CPT là gì?
    Khó khăn bao gồm nồng độ CPT thấp, sự suy giảm khả năng sản xuất qua các thế hệ cấy chuyển, và cần tối ưu điều kiện nuôi cấy để nâng cao hiệu suất sản xuất.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công 48 chủng vi nấm nội sinh từ các bộ phận khác nhau của cây mẫu đơn đỏ tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên.
  • Định danh các chủng vi nấm bằng giải trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 cho phép xác định đa dạng chủng loại, trong đó có các chủng tiềm năng sản xuất CPT.
  • Phát hiện và định lượng CPT trong cao chiết dịch nuôi và sinh khối của một số chủng vi nấm nội sinh, với nồng độ CPT đạt đến khoảng 42,9 µg/L.
  • Kết quả nghiên cứu mở ra hướng phát triển công nghệ sinh học sản xuất CPT bền vững từ vi nấm nội sinh, giảm áp lực khai thác thực vật hoang dã.
  • Đề xuất các giải pháp phát triển quy trình nuôi cấy, sàng lọc và ứng dụng vi nấm nội sinh trong sản xuất CPT trong vòng 1-3 năm tới.

Luận văn này là cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về sản xuất hợp chất chống ung thư từ vi nấm nội sinh tại Việt Nam. Để thúc đẩy ứng dụng thực tiễn, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích hợp tác phát triển công nghệ và mở rộng quy mô sản xuất.