MỞ ĐẦU Trong lịch sử phát triển, con người đã biết sử dụng thực vật và sáng tạo các bài thuốc từ thực vật để nâng cao sức khoẻ, đẩy lùi bệnh tật. Trong số các hợp chất thực vật có hoạt tính sinh học đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu, alkaloid được xem là nhóm chất đóng vai trò chính. Một số alkaloid có giá trị y học cao trong điều trị ung thư như taxol, podophyllotoxin, vinblastine, vincristine, camptothecin. Trong số đó, camptothecin được xem là một hợp chất chữa ung thư tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng sâu rộng hơn nửa thế kỷ qua.
Camptothecin (CPT) có nguồn gốc từ cây Hỷ thụ- một loài cây đặc hữu của Trung Quốc. Người Trung Quốc xưa đã sử dụng các bộ phận của loài cây này để chữa ung thư. CPT được chứng minh có khả năng ức chế sự tăng trưởng và tái phát ở một số bệnh ung thư như ung thư vú, dạ dày, buồng trứng và khối u ác tính ở mô hình chuột xenograft [24]. Cây Hỷ thụ (Camptotheca acuminata) phân bố chủ yếu ở phía nam Trung Quốc, vỏ cây và lá non là nguồn cung cấp CPT chủ yếu tuy nhiên số lượng cây ngoài tự nhiên ước tính chỉ còn khoảng bốn nghìn cây trong khi nhu cầu thị trường lên đến một trăm triệu cây [45].
Ngoài tăng cường nuôi cấy ngoài tự nhiên, các nhà khoa học cũng đã tiến hành vi nhân giống C.acuminata trong phòng thí nghiệm bằng các kĩ thuật hiện đại như nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy rễ tơ hay nhân giống phôi vô tính tuy nhiên hiệu suất sản xuất CPT thấp, thời gian kéo dài (tính theo tháng); vì vậy việc tìm ra nguồn sản xuất CPT thay thế cây Hỷ thụ là rất quan trọng. Giới khoa học đã chú ý tới sản xuất CPT bằng vi sinh vật, đặc biệt là các vi sinh vật nội sinh. Trong đó vi nấm nội sinh là một nguồn cung cấp các dẫn xuất tự nhiên quan trọng của nhiều chất, hợp chất được dùng trong Y học hiện đại (penicillin, cyclosporine, statin,…). Với ưu điểm thời gian sinh trưởng nhanh và có khả năng nhân sinh khối lớn, việc sử dụng vi nấm thay cho nuôi trồng và khai thác các loài thực vật khác nói riêng và cho các hợp chất tự nhiên nói chung sẽ giúp làm giảm gánh nặng lên môi trường trước nhu cầu ngày càng lớn của con người.
CPT và các 1 chất có cấu trúc tương tự CPT được tìm thấy ở nhiều họ thực vật với vị trí địa lý cách biệt trong các điều kiện khí hậu khác so với cây Hỷ thụ khiến nhiều nhóm nghiên cứu đặt giả thuyết rằng CPT có nguồn gốc từ các loài vi nấm nội sinh đã xâm nhập vào các cây ở vùng nhiệt đới. Giới khoa học đã phát hiện được nhiều loài vi nấm nội sinh có khả năng sản xuất camptothecin trên nhiều đối tượng ký chủ thực vật khác nhau vì vậy cần có nghiên cứu mới sàng lọc nhằm tìm ra CPT và các dẫn xuất của nó từ vi nấm sống trong các hệ thực vật sẵn có ở Việt Nam. Năm 1998, Latha PG và Panikkar KR đã báo cáo khả năng kháng u và gây độc khối u của dịch chiết hoa mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L khi tiêm màng bụng chuột mang Dalton's lymphoma và chuột mang khối u biểu mô cổ trướng Ehrlich. Từ đó đã có nhiều nghiên cứu với nỗ lực xác định sự có mặt của CPT trong loài cây này.
Năm 2011, Saravanan và cộng sự đã công bố thành phần CPT trong mẫu lá non và lá trưởng thành của Ixora coccinea L là 2,8% [68]. Nhận định Vườn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai, Việt Nam) có thảm thực vật phong phú và đa dạng là điều kiện tốt để hệ vi nấm phát triển, đồng thời khí hậu và thời tiết nơi đây có sự chênh khác biệt lớn trong năm và có xuất hiện các kiểu thời tiết cực đoan như sương muối, băng tuyết,. phù hợp với cơ chế sản sinh các hợp chất thứ cấp. Chúng tôi quyết định tiến hành thu thập mẫu cây mẫu đơn đỏ tại đây để thực hiện đề tài “Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin từ cây mẫu đơn đỏ (Ixora coccinea L) tại Việt Nam” với những mục tiêu nghiên cứu sau: 1.
Phân lập các chủng vi nấm nội sinh trong cây Mẫu đơn đỏ Ixora coccinea L. Định danh các chủng vi nấm nội sinh phân lập được bằng giải trình tự đoạn ITS1-5,8S rRNA-ITS2. Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp Camptothecin trong môi trường lên men. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Camptothecin và các hợp chất có cấu trúc tƣơng tự Camptothecin 1. Cấu trúc của Camptothecin (CPT), lịch sử phát hiện CPT có công thức hoá học là C20H10N2O4, khối lượng phân tử 348.352 g/mol, tên IUPAC là : (S)-4- ethyl-4-hydroxy-1H-pyrano[3′,4′:6,7] indolizino[1,2- b]quinoline-3,14-(4H,12H)- dione]. CPT là một monoterpenoid indole alkaloid. Cấu trúc hoá học của CPT(1) và CPT dạng muối hoá với natri (2) CPT có một đặc tính là khó tan trong nước, có độc tính cao và nhanh bị mất hoạt tính do bị thuỷ phân vòng lactone ở ngay điều kiện pH sinh lý.
Để khắc phục tính khó tan, CPT được muối hoá với natri (Hình 1) tuy nhiên muối này có hiệu quả kém hơn so với CPT ban đầu [27]. Lịch sử phát hiện Camptothecin Vào những năm 50, số ca tử vong do các bệnh truyền nhiễm đặc biệt là viêm phổi có chiều hướng giảm nhờ thành tựu phát hiện ra thuốc kháng sinh, từ đó bệnh tim và ung thư chính thức trở thành hai mối nguy cơ sức khỏe lớn nhất đối với con người. Bệnh ung thư phổ biến và có thể gặp ở nhiều bộ phận khác nhau của cơ thể, chúng cũng không phân biệt tuổi tác, giới tính do đó giới khoa học đã thúc đẩy nghiên cứu ung thư, đặc biệt là hoá trị liệu. Trong khi đó, Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) do Monroe Wall đứng đầu đang sàng lọc thực vật để tìm phytosteroid dùng để làm tiền chất sản xuất cortisone- hợp chất đang có nhu cầu thị trường lớn lúc bấy giờ nhưng nguồn cung hạn chế.
Trong quá trình thử nghiệm khả năng chống ung thư trên quy mô hàng nghìn chiết xuất từ thực vật tại Viện ung thư quốc gia (NCI), 3 chiết xuất từ Taxus baccata và Camptotheca acuminata thể hiện hoạt tính đáng kể. Từ đó chúng được nghiên cứu rộng rãi, ngày nay hợp chất CPT đã được ứng dụng trong điều trị ung thư buồng trứng và ung thư vú. Trong số hàng nghìn dịch chiết bằng dung môi Ethanol, dịch chiết của C.acuminata đã thể hiện khả năng gây độc tế bào tuyệt vời khi thử nghiệm trên tế bào L. Wall đã rất kỳ vọng có thể xác định được hợp chất có hoạt tính kháng khối u có mặt trong dịch chiết C.
Dịch chiết thô của C.acuminata đã được phân đoạn bằng nhiều dung môi khác nhau và CPT đã được tìm thấy vào năm 1966. Nhóm nghiên cứu phát hiện ra rằng CPT không chỉ có khả năng kháng lại các tế bào L1210 leukemia mà còn có hiệu quả đối với các tế bào p338 leukemia. CPT và các dẫn xuất của nó đã được chứng minh có hoạt tính kháng virus, hoạt tính trừ sâu, hoạt tính chống ký sinh trùng, hoạt tính chữa vảy nến và khả năng kháng nấm. Hoạt tính kháng virus CPT và các dẫn xuất của nó thể hiện hoạt tính kháng virus khá tốt.
Hoạt động của enzyme Topoisomerase 1 liên quan đến các retrovirus như HIV [55]. Ngoài ra các chất có cấu trúc tương tự CPT cũng đã được đánh giá là có hoạt tính kháng virus. Topotecan đã được chứng minh mang lại hiệu quả khi điều trị bệnh não đa ổ tiến triển liên quan đến AIDS [71]. Nghiên cứu của Sadaie và cộng sự công bố năm 1999 cho thấy 9-nitrocamptothecin ức chế sự nhân bản của virus HIV-1 các tế bào monocytoid U937 mới lây nhiễm [64].
Hoạt tính trừ sâu Thời Trung Quốc cổ đại, dịch chiết thô của C.acuminata có chứa CPT đã được dân gian sử dụng để kiểm soát côn trùng gây hại trong suốt nhiều thế kỉ, các nghiên cứu về sau đã báo cáo rằng CPT là một loại thuốc trừ sâu mạnh đối với ruồi nhà và sâu bướm bắp cải [10,28]. Nó cũng thể hiện hoạt động ức chế đáng kể đối với một 4 số loài gây hại nông nghiệp như Empoasca vitis, Mythimna separata, Brevicoryne brassicae, Nilaparvata lugens, Chilo suppressalis [10,16,74]. Một nghiên cứu năm 2010 đã chỉ ra CPT có thể gây ra những biến đổi trong cấu trúc ruột giữa của côn trùng lepidopteran như mất lớp tế bào đơn trong tế bào biểu bì và phá vỡ màng phúc mạc [46]. Ngoài ra một số hợp chất bao gồm 7-CH2C6H5-CPT, 7-CHO-CPT, 7- CH2OCOC6H5-CPT, 10-O-CH2OCOC6H5-CPT, 20-CH2OCOC6H5-CPT và 20-F- CPT có khả năng diệt tuyến trùng Bursaphelenchus xylophilus mạnh hơn CPT.
Hoạt tính chống ký sinh trùng African trypanosomes (thuộc loài Trypanosoma brucei) là một động vật nguyên sinh ký sinh gây chết đối với người và gia súc. Các nghiên cứu đã chỉ ra CPT gây độc tế bào đối với African trypanosomes và các sinh vật ký sinh đường máu gây bệnh liên quan [19]. Hoạt tính chống vảy nến Vảy nến là một bệnh viêm da mãn tính do các tế bào sừng biểu bì tăng sinh và biệt hoá bất thường. Từ đầu những năm 1970, một số nghiên cứu đã công bố các chế phẩm bôi ngoài da chứa CPT để điều trị vảy nến [15].
Những nghiên cứu ban đầu này cho thấy CPT trong vai trò là một chất ức chế topoisomerase có hiệu quả trong điều trị bệnh vẩy nến. Năm 2001, nhóm nghiên cứu của Wang báo cáo rằng 10-hydroxy-CPT cũng thể hiện hiệu quả chữa vảy nến đáng kể [77]. Sau đó nhóm nghiên cứu của Lin [42,43] tiết lộ rằng CPT và iso-CPT ức chế sự phát triển của tế bào sừng trưởng thành ở người được nuôi cấy trong ống nghiệm bằng cách gây ra quá trình apoptosis. Đến năm 2006,2008, các nghiên cứu của Lin đã chứng minh rằng cơ chế điều trị vẩy nến của CPT liên quan đến khả năng chống tăng sinh và cảm ứng quá trình apoptosis các tế bào sừng thông qua việc điều hoà hoạt động của telomerase [41].
Hoạt tính kháng nấm Từ năm 1999, Del Poeta et al đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của CPT và các analog của nó đối với các chủng Saccharomyces cerevisiae, bao gồm cả chủng dại, 5 chủng đột biến erg6, chủng đột biến erg6 top 1 biểu hiện topoisomerase 1 của Cryptococcus neoformans [18]. Họ phát hiện ra rằng một số dẫn xuất thể hiện khả năng kháng nấm mạnh khi các chủng biểu hiện quá mức Topo-1 đặc biệt là cấu trúc vòng A có 10,11-methylenedioxy có khả năng tăng tương tác với enzyme Topo-1 của nấm.