Nghiên cứu phân lập nấm acidophilic và chịu acid từ môi trường tại Việt Nam

• Tác giả: Nguyen Bao Ngoc
• Người hướng dẫn: Assoc. Nguyen Van Giang
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Isolation of Acidophilic and Acid-Tolerant Fungi from Diverse Environments in Vietnam
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hanoi

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENTS
• TABLE OF CONTENTS
• 1. Introduction of acidophilic fungi
• 1.1. Origin and characteristics of acidophilic fungi
• 1.2. Some representative group of acidophilic fungi
• 1.2.1. Acidomyces acidophilus
• 1.2.2. Acidothrix acidophila
• 1.2.3. Acidea extrema
• 1.2.4. Hortaea acidophila
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Chemicals, equipment and machines
• 2.2. Method of isolation. Purification and maintenance of strains
• 2.3. Observation of colonies and cells
• 2.4. DNA extraction and purification method for mold cells. Methods of PCR fingerprinting (Maheshwari, 2011)
• 2.5. Staining the gel and read the result
• 2.6. Method to classify based on rDNA sequencing (Maheshwari, 2011). Growth at different acid concentrations
• 2.7. Enzyme production and extraction (Maheshwari, 2011)
• 2.8. Determination Enzyme Activity Assays by agar diffusion method (Maheshwari, 2011)
• 2.9. Protein electrophoresis by SDS-PAGE method and Zymogram method SDS-PAGE method (Maheshwari, 2011)
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Observation of colonies and cells
• 3.2. Classification of acidophilic fungi strains based on rDNA sequence analysis
• 3.3. The growth of strains at different acid concentrations
• 3.4. Qualitative lignocellulose hydrolysis enzyme
• 3.5. Determination of starch hydrolysis and cellulose degradation by disk diffusion method
• 3.6. Determination of protein, CMCase and xylanase
• 4. CONCLUSION AND PROPOSAL
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• ABBREVIATIONS
• ABSTRACT

I. Giới thiệu về nấm acidophilic

Nấm acidophilic là những loại nấm có khả năng phát triển trong môi trường có độ pH thấp, thường dưới 3. Chúng được tìm thấy trong các môi trường đa dạng như đất axit, mỏ than, và các khu vực có nồng độ kim loại cao. Nấm acidophilic không chỉ có khả năng chịu đựng điều kiện axit mà còn có thể sản xuất các enzyme có giá trị công nghiệp. Các loại nấm này đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới, nhưng ở Việt Nam, nghiên cứu về chúng vẫn còn hạn chế. Bài viết này tập trung vào việc phân lập nấm acidophilic và nấm chịu acid từ các môi trường đa dạng tại Việt Nam, nhằm khám phá tiềm năng ứng dụng của chúng trong công nghiệp và sinh học.

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm của nấm acidophilic

Nấm acidophilic có nguồn gốc từ các môi trường cực đoan như đất axit, mỏ than, và các khu vực có nồng độ kim loại cao. Chúng có khả năng phát triển trong điều kiện pH thấp, thường dưới 3, và có thể chịu đựng được nồng độ kim loại cao. Nấm acidophilic thường có cấu trúc tế bào đặc biệt, chứa melanin trong thành tế bào, giúp bảo vệ chúng khỏi các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Một số loại nấm acidophilic tiêu biểu bao gồm Acidomyces acidophilus và Hortaea acidophila, được tìm thấy trong các môi trường axit cực đoan.

1.2. Một số nhóm nấm acidophilic tiêu biểu

Các nhóm nấm acidophilic tiêu biểu bao gồm Acidomyces acidophilus, Acidothrix acidophila, và Hortaea acidophila. Acidomyces acidophilus là loại nấm được nghiên cứu nhiều nhất, có khả năng phát triển trong môi trường có pH thấp và sản xuất các enzyme có giá trị công nghiệp. Acidothrix acidophila là loại nấm sống trong đất axit, có khả năng chịu đựng nồng độ kim loại cao. Hortaea acidophila được tìm thấy trong than nâu, có khả năng phát triển trong môi trường có pH cực thấp. Các loại nấm này đều có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp và sinh học.

II. Phân lập nấm acidophilic và chịu acid

Quá trình phân lập nấm acidophilic và nấm chịu acid từ các môi trường đa dạng tại Việt Nam đã được thực hiện với mục tiêu khám phá sự đa dạng sinh học của các loại nấm này. Các mẫu được thu thập từ các khu vực có điều kiện axit cao, bao gồm đất axit, mỏ than, và các khu vực có nồng độ kim loại cao. Quá trình phân lập bao gồm việc sử dụng các phương pháp nuôi cấy, quan sát hình thái, và phân tích DNA để xác định các chủng nấm. Kết quả cho thấy sự đa dạng cao của các loại nấm acidophilic và chịu acid tại Việt Nam, với nhiều chủng mới được phát hiện.

2.1. Phương pháp phân lập nấm

Phương pháp phân lập nấm bao gồm việc thu thập mẫu từ các môi trường đa dạng, nuôi cấy trên môi trường có độ pH thấp, và quan sát hình thái của các khuẩn lạc. Các chủng nấm được tinh chế và duy trì trong điều kiện phòng thí nghiệm. Phương pháp PCR và phân tích trình tự rDNA được sử dụng để xác định các chủng nấm. Kết quả cho thấy sự đa dạng cao của các loại nấm acidophilic và chịu acid tại Việt Nam, với nhiều chủng mới được phát hiện.

2.2. Kết quả phân lập và phân loại

Kết quả phân lập cho thấy sự đa dạng cao của các loại nấm acidophilic và chịu acid tại Việt Nam. Các chủng nấm được phân loại dựa trên hình thái và phân tích trình tự rDNA. Một số chủng nấm mới thuộc các chi Talaromyces và Penicillium đã được phát hiện. Các chủng nấm này có khả năng sản xuất các enzyme có giá trị công nghiệp, bao gồm xylanase, CMCase, và amylase. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng của các loại nấm acidophilic và chịu acid trong công nghiệp và sinh học.

III. Ứng dụng của nấm acidophilic và chịu acid

Các loại nấm acidophilic và chịu acid có tiềm năng ứng dụng cao trong công nghiệp và sinh học. Chúng có khả năng sản xuất các enzyme có giá trị, bao gồm xylanase, CMCase, và amylase, được sử dụng trong các quá trình phân hủy sinh học và sản xuất nhiên liệu sinh học. Nấm acidophilic cũng có thể được sử dụng trong xử lý môi trường, đặc biệt là trong các khu vực có nồng độ kim loại cao. Nghiên cứu này đã khám phá tiềm năng ứng dụng của các loại nấm acidophilic và chịu acid tại Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

3.1. Enzyme từ nấm acidophilic

Các enzyme được sản xuất bởi nấm acidophilic có giá trị cao trong công nghiệp. Chúng bao gồm xylanase, CMCase, và amylase, được sử dụng trong các quá trình phân hủy sinh học và sản xuất nhiên liệu sinh học. Các enzyme này có khả năng hoạt động trong điều kiện axit và nhiệt độ cao, làm tăng hiệu quả của các quá trình công nghiệp. Nghiên cứu này đã xác định được các chủng nấm có khả năng sản xuất các enzyme này, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp.

3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường

Nấm acidophilic có tiềm năng ứng dụng trong xử lý môi trường, đặc biệt là trong các khu vực có nồng độ kim loại cao. Chúng có khả năng hấp thụ và chuyển hóa các kim loại nặng, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu này đã khám phá tiềm năng ứng dụng của các loại nấm acidophilic và chịu acid trong xử lý môi trường, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

Tổng quan nghiên cứu

Acidophilic và acid-tolerant fungi là nhóm vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH rất thấp, thậm chí đến pH 1.0, với tiềm năng ứng dụng lớn trong công nghiệp nhờ khả năng sản xuất enzyme hoạt động ổn định trong điều kiện axit. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và khảo sát đa dạng sinh học của các chủng nấm acidophilic và acid-tolerant tại Việt Nam, với tổng cộng 103 mẫu thu thập từ nhiều vùng khác nhau như Hà Nội, Thái Nguyên, Hưng Yên, Bắc Giang, Thái Bình, Sơn La, Hải Dương. Kết quả thu được 109 chủng nấm acidophilic và acid-tolerant, trong đó 20 chủng đại diện được chọn để phân tích trình tự rDNA nhằm xác định vị trí phân loại và đánh giá hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose.

Mục tiêu nghiên cứu bao gồm: (1) phân lập các chủng nấm acidophilic từ các mẫu thu thập tại Việt Nam; (2) xác định vị trí phân loại của các chủng nấm này dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích phân tử; (3) đánh giá hoạt tính lignocellulolytic enzyme và đặc tính enzyme do các chủng nấm này sản xuất. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ tháng 7/2019 đến 2/2020, tại các phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Công nghiệp Thực phẩm và Đại học Nông nghiệp Việt Nam.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc mở rộng hiểu biết về đa dạng sinh học của nấm acidophilic tại Việt Nam, đồng thời cung cấp nguồn gen quý giá cho phát triển enzyme công nghiệp hoạt động trong môi trường axit, góp phần thúc đẩy các ngành công nghiệp giấy, dệt nhuộm, thực phẩm và xử lý môi trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh thái học vi sinh vật cực đoan (extremophiles), đặc biệt là acidophilic fungi – nhóm nấm có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường có pH rất thấp (pH < 3). Các khái niệm chính bao gồm:

• Acidophilic fungi: Nấm có khả năng phát triển tối ưu ở pH khoảng 3 hoặc thấp hơn, có thể tồn tại ở pH 1.0.
• Lignocellulolytic enzymes: Hệ enzyme thủy phân lignocellulose gồm cellulase, xylanase, amylase, có vai trò phân giải cellulose, hemicellulose và tinh bột trong sinh khối thực vật.
• PCR fingerprinting và rDNA sequencing: Phương pháp phân tích phân tử để phân loại và xác định chủng nấm dựa trên trình tự vùng ITS và D1/D2 của rDNA.
• SDS-PAGE và zymogram electrophoresis: Kỹ thuật điện di protein để phân tích hệ enzyme ngoại bào và hoạt tính thủy phân cơ chất lignocellulose.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 103 mẫu đất, lá cây, quả và hoa thu thập từ nhiều tỉnh thành Việt Nam. Từ các mẫu này, 109 chủng nấm acidophilic và acid-tolerant được phân lập trên môi trường Malt-Glucose 2Bx có bổ sung 1% H2SO4 (pH 1.0). Các chủng được nuôi cấy, làm sạch và bảo quản tại Viện Nghiên cứu Công nghiệp Thực phẩm.

Phân tích hình thái được thực hiện bằng kính hiển vi ánh sáng với độ phóng đại ×40, ghi nhận đặc điểm thuộc tính thuộc về bề mặt và cấu trúc tế bào. Phân loại phân tử dựa trên PCR fingerprinting sử dụng mồi (GAC)5 và giải trình tự vùng ITS của rDNA với cỡ mẫu 20 chủng đại diện, được chọn từ 20 nhóm phân loại dựa trên kết quả fingerprinting.

Khả năng sinh trưởng được đánh giá trên môi trường có các nồng độ axit khác nhau (pH 5.7, 0.01%, 0.1%, 1% H2SO4). Hoạt tính enzyme lignocellulolytic được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán agar với cơ chất CMC và tinh bột, đo đường kính vòng thủy phân. SDS-PAGE và zymogram electrophoresis được sử dụng để phân tích hệ enzyme ngoại bào, xác định các protein enzyme có hoạt tính phân giải cellulose và xylan.

Thời gian nghiên cứu kéo dài từ tháng 7/2019 đến tháng 2/2020, với các bước chính: thu thập mẫu, phân lập và làm sạch chủng, phân tích hình thái và phân tử, đánh giá sinh trưởng và hoạt tính enzyme.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đa dạng sinh học và phân lập chủng: Từ 103 mẫu, 109 chủng nấm acidophilic và acid-tolerant được phân lập, trong đó 79% mẫu chứa nấm acidophilic, với tỷ lệ cao nhất ở mẫu đất (92%) và lá cây (86.5%). Các chủng thuộc 13 loài, bao gồm Acrodontium griseum, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Aspergillus turcosus, Penicillium chermesinum, Penicillium citreonigrum, Penicillium georgiense, Talaromyces atroroseus, Talaromyces diversus, cùng 4 loài mới chưa được mô tả trước đây.

2. Khả năng sinh trưởng ở pH thấp: 90 chủng có khả năng phát triển tốt trên môi trường pH 1.0 (1% H2SO4), 7 chủng phát triển yếu và 12 chủng không phát triển. Các loài Talaromyces sp1., Penicillium citreonigrum và Penicillium sp2. thể hiện khả năng sinh trưởng tốt nhất ở pH 1.0, trong khi Aspergillus terreus và Penicillium georgiense không phát triển ở điều kiện này.

3. Hoạt tính enzyme lignocellulolytic: Qua phương pháp khuếch tán agar, các chủng thể hiện vòng thủy phân CMC dao động từ 8 đến 28 mm, chứng tỏ khả năng phân giải cellulose mạnh. Hoạt tính amylase thấp hoặc không phát hiện được ở hầu hết các chủng. SDS-PAGE và zymogram cho thấy hệ enzyme ngoại bào đa dạng, với các protein enzyme có khả năng phân giải cellulose và xylan được xác định rõ ràng.

4. Phân tích phân tử và phân loại: PCR fingerprinting phân nhóm 67 chủng thành 20 nhóm khác nhau, tương ứng với 13 loài được xác định qua giải trình tự ITS. Độ tương đồng trình tự với các loài đã biết dao động từ 96.48% đến 100%, cho thấy sự đa dạng di truyền cao và phát hiện các loài mới.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy môi trường đất và lá cây tại Việt Nam là nguồn phong phú của các chủng nấm acidophilic và acid-tolerant, phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về sự phân bố rộng rãi của acidophilic fungi trong các môi trường đa dạng. Khả năng sinh trưởng ở pH cực thấp của nhiều chủng chứng minh tiềm năng ứng dụng trong các quy trình công nghiệp yêu cầu enzyme hoạt động ổn định trong môi trường axit.

Hoạt tính enzyme lignocellulolytic mạnh mẽ, đặc biệt là cellulase và xylanase, phù hợp với các báo cáo về enzyme acidophilic có ứng dụng trong công nghiệp giấy, dệt nhuộm và xử lý sinh khối. Sự đa dạng về hệ enzyme ngoại bào được SDS-PAGE và zymogram minh chứng cho khả năng sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau, mở ra cơ hội phát triển enzyme chuyên biệt cho từng ứng dụng.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, việc phát hiện các loài mới và khả năng sinh trưởng trên môi trường pH 1.0 là bước tiến quan trọng, bổ sung kiến thức về đa dạng sinh học acidophilic fungi tại Việt Nam. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố chủng theo loại mẫu, bảng so sánh hoạt tính enzyme và cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự rDNA.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi cấy và bảo quản chủng acidophilic nhằm duy trì và mở rộng nguồn gen quý giá phục vụ nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp, ưu tiên các chủng có hoạt tính enzyme cao, trong vòng 1-2 năm, do các viện nghiên cứu và trung tâm vi sinh vật.

2. Nghiên cứu sâu về đặc tính enzyme acidophilic như tính ổn định nhiệt, pH, cơ chế hoạt động và tối ưu hóa điều kiện sản xuất enzyme, nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng trong công nghiệp giấy, dệt nhuộm, xử lý sinh khối, trong 2-3 năm, phối hợp giữa các trường đại học và doanh nghiệp.

3. Ứng dụng enzyme acidophilic trong quy trình công nghiệp xanh thay thế các phương pháp hóa học truyền thống, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, tăng hiệu quả sản xuất, với mục tiêu giảm chi phí và tăng năng suất enzyme lên 20-30% trong 3-5 năm, do các doanh nghiệp công nghiệp phối hợp với viện nghiên cứu.

4. Mở rộng khảo sát đa dạng acidophilic fungi tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam, đặc biệt là các môi trường cực đoan chưa được nghiên cứu, nhằm phát hiện thêm các chủng mới có tiềm năng công nghiệp, trong 3 năm tới, do các nhóm nghiên cứu sinh thái và vi sinh vật.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vi sinh vật học và sinh học phân tử: Tài liệu cung cấp dữ liệu đa dạng sinh học acidophilic fungi, phương pháp phân lập và phân loại hiện đại, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu về vi sinh vật cực đoan.

2. Chuyên gia phát triển enzyme công nghiệp: Thông tin về hoạt tính enzyme lignocellulolytic trong môi trường axit giúp phát triển enzyme mới phù hợp với các quy trình công nghiệp đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt.

3. Doanh nghiệp công nghiệp giấy, dệt nhuộm, xử lý sinh khối: Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để ứng dụng enzyme acidophilic thay thế hóa chất, nâng cao hiệu quả và thân thiện môi trường.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về quy trình nghiên cứu khoa học, kỹ thuật phân lập, phân loại và đánh giá enzyme acidophilic fungi.

Câu hỏi thường gặp

1. Acidophilic fungi là gì và tại sao chúng quan trọng?
   Acidophilic fungi là nhóm nấm có khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH rất thấp (dưới 3). Chúng quan trọng vì sản xuất enzyme hoạt động ổn định trong môi trường axit, có ứng dụng trong công nghiệp giấy, dệt nhuộm và xử lý sinh khối.

2. Phương pháp phân lập acidophilic fungi trong nghiên cứu này như thế nào?
   Nấm được phân lập từ mẫu đất, lá cây, quả, hoa trên môi trường Malt-Glucose 2Bx bổ sung 1% H2SO4 (pH 1.0), nuôi cấy ở 30°C trong 30 ngày, sau đó làm sạch và bảo quản để nghiên cứu tiếp.

3. Làm thế nào để xác định chủng nấm acidophilic?
   Chủng được xác định dựa trên đặc điểm hình thái, PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 và giải trình tự vùng ITS của rDNA, giúp phân loại chính xác đến mức loài.

4. Các enzyme lignocellulolytic được khảo sát gồm những loại nào?
   Nghiên cứu tập trung vào cellulase (CMCase), xylanase và amylase, trong đó cellulase và xylanase có hoạt tính mạnh, còn amylase hoạt tính thấp hoặc không phát hiện.

5. Ứng dụng thực tiễn của các chủng acidophilic fungi này là gì?
   Các chủng có thể được sử dụng để sản xuất enzyme hoạt động trong môi trường axit, phục vụ công nghiệp giấy, dệt nhuộm, chế biến thực phẩm, xử lý sinh khối và môi trường, góp phần phát triển công nghệ xanh, bền vững.

Kết luận

• Đã phân lập và xác định 109 chủng acidophilic và acid-tolerant fungi từ nhiều môi trường khác nhau tại Việt Nam, thuộc 13 loài, trong đó có 4 loài mới.
• Phần lớn chủng có khả năng sinh trưởng tốt ở pH 1.0, chứng minh tính acidophilic hoặc acid-tolerant rõ rệt.
• Hoạt tính enzyme lignocellulolytic, đặc biệt cellulase và xylanase, được phát hiện mạnh mẽ, mở ra tiềm năng ứng dụng công nghiệp.
• Phương pháp phân loại kết hợp hình thái, PCR fingerprinting và giải trình tự rDNA cho kết quả chính xác và đa dạng sinh học phong phú.
• Đề xuất nghiên cứu tiếp tục phát triển enzyme acidophilic, mở rộng khảo sát và ứng dụng trong công nghiệp xanh, góp phần nâng cao giá trị khoa học và kinh tế.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp phát triển quy trình sản xuất enzyme acidophilic quy mô công nghiệp, đồng thời mở rộng nghiên cứu đa dạng sinh học acidophilic fungi tại Việt Nam.