Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về cây dừa cạn 1. Nguồn gốc và phân loại cây dừa cạn Giống Catharanthus có nguồn gốc ở đảo Madagasca thuộc châu Phi với 8 loài (trừ loài C. Don tìm thấy ở Ấn Độ).
Vào giữa thế kỉ 18, dừa cạn được trồng nhiều ở Paris, sau đó được di nhập sang nhiều nước nhiệt đới Nam Á cũng như Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam - Trung Quốc. Được biết đến phổ biến nhất là loài Madagasca Periwinkle hay còn gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ở Việt Nam, dừa cạn xuất hiện ở nhiều địa phương (nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển) do tính chất dễ trồng và phát triển nhanh của cây này. Dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên.
Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [17]. Cây dừa cạn có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L. Don, tên đồng nghĩa là Vinca rosea L.
Hay còn được gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, tứ thời hoa, cây sừng dê, cây nhật tân, trường xuân hoa, thuộc Họ: Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus roseus. Don là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole được biết đến với 3 giống cây khác nhau: ‘roseus’ với hoa màu hồng tím; ‘ocellatus’ với hoa màu trắng, nhụy đỏ; ‘albus’ với hoa màu trắng. Trong đó giống hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [16], [30].1: Ba giống Catharanthus roseus [30] 1. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60cm, phân nhiều cành, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên.
Thân hình trụ có 4 khía dọc, có lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím. Cây có bộ rễ phát triển và mọc thành bụi dày. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4 - 7cm, rộng 2 - 3cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3 - 5cm.
Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên. Hoa trắng hoặc đỏ tím, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5.
Cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hây hồng tím, trắng,.
ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm; miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị rời đính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy.
Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn rời ở bầu nhưng dính ở vòi và 4 đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên. Vòi nhụy dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng.
Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. 2 đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn [17]. Quả gồm 2 đại, dài 2 - 4cm, rộng 2 - 3cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm [17].
Thành phần hóa học và một số công dụng của cây dừa cạn Dừa cạn trồng ở Việt Nam chứa khoảng 0,1 - 0,2% alkaloid toàn phần. Trong đó, loại hoa màu hồng tím có tỷ lệ hoạt chất cao nhất. Có nhiều loại alkaloid được tìm thấy trong dừa cạn, chủ yếu là vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicin… Trong đó, ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine và vincristine có liên kết đặc hiệu với tubulin, protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa.
Vì thế, chúng được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [17]. Chiết xuất alkaloid trong dừa cạn được dùng dưới dạng muối sulfat để chữa bệnh ung thư. Vinblastine sulfat được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận. Vinblastine sulfat cũng dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da.
Vincristine sulfat là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Đây là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt 5 cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân. Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp, vincristine sulfat còn được dùng cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Nhân dân ta đã có bài thuốc chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân lá khô/ngày) [27].
Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô, sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, chữa bệnh ngoài da [17]. Alkaloid chính trong cây dừa cạn Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base. Alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [19].
Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 - 1,15%, ở thân 0,40%, rễ chính 0,7 - 2,4%, rễ phụ 0,9 - 3,7%, hoa 0,14 - 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18%. Có khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ Catharanthus roseus. Trong số đó đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric, là những nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vinblastine và vincristine. Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013 - 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23% (cây bị bệnh asteryllow-virus thì không có vinblastine).
Vincristine với hàm lượng thấp hơn 0,0003 - 0,0015% [23]. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng 1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện 6 các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
Gen chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen phải thể hiện được chức năng sinh học [11]. Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hóa cho các tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông qua chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học có thể nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen. Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun). Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông. Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí thiết bị đắt tiền và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững. Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát hiện ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển gen thực vật với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen chuyển ít bị đào thải; (ii) Số lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii) 7 Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir; (iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Mặc dù vậy, phương pháp này mới chỉ được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với cây một lá mầm còn thấp (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm).