Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn streptomyces chống nấm mốc gây bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt capsicum frutescens l

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn streptomyces chống nấm mốc gây bệnh, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề xuất

• Tác giả: Đoàn Thị Thục Anh
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thu Hà
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Khoa Sinh – Môi Trường
• Đề tài: Nghiên Cứu Xạ Khuẩn Streptomyces Chống Nấm Mốc Gây Bệnh Thán Thư Và Héo Vàng Trên Cây Ớt Capsicum Frutescens
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Đà Nẵng

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về xạ khuẩn
• 1.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
• 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
• 1.1.2.1. Khuẩn lạc
• 1.1.2.2. Khuẩn ty
• 1.1.2.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
• 1.1.3. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
• 1.2. Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn
• 1.2.1. Định nghĩa chất kháng sinh
• 1.2.2. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
• 1.2.3. Các cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật
• 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn
• 1.2.4.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
• 1.2.4.1.1. Nhiệt độ
• 1.2.4.1.2. pH môi trường
• 1.2.4.1.3. Thời gian
• 1.2.4.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men
• 1.2.4.2.1. Nguồn cacbon
• 1.2.4.2.2. Nguồn nitơ
• 1.2.4.2.3. Nguồn photphat vô cơ
• 1.2.4.2.4. Các yếu tố vi lượng
• 1.3. Xạ khuẩn sinh kháng sinh trong bảo vệ thực vật

Tóm tắt

I. Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces

Xạ khuẩn (XK) thuộc lớp Actinobacteria, có vai trò quan trọng trong nông nghiệp nhờ khả năng sinh chất kháng sinh. Trong số đó, Streptomyces là chi nổi bật nhất với khả năng sản xuất nhiều loại kháng sinh tự nhiên có tác dụng chống lại các nấm mốc gây hại cho cây trồng. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên rất rộng rãi, chủ yếu tập trung ở đất, nơi mà chúng chiếm từ 20-40% tổng số vi sinh vật. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn rất đa dạng, với hệ sợi phát triển mạnh và khả năng hình thành bào tử. Điều này giúp chúng tồn tại và phát triển trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Theo nghiên cứu, khoảng 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh, điều này cho thấy tiềm năng lớn của chúng trong việc bảo vệ thực vật.

1.1. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển mạnh, không có vách ngăn, và có khả năng hình thành bào tử. Khuẩn lạc của chúng thường có dạng xù xì, chắc chắn và có màu sắc đa dạng. Đặc biệt, Streptomyces có khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh khác nhau, giúp ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hại. Nghiên cứu cho thấy, các yếu tố như nhiệt độ, pH và thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học của xạ khuẩn sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp.

II. Nghiên cứu về khả năng chống nấm mốc của xạ khuẩn Streptomyces

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng Streptomyces có khả năng chống lại các nấm mốc gây bệnh như Colletotrichum và Fusarium, hai tác nhân chính gây ra bệnh thán thư và héo vàng trên cây ớt (Capsicum frutescens). Việc phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh mạnh là rất cần thiết để phát triển các biện pháp phòng trừ sinh học hiệu quả. Các thí nghiệm cho thấy, dịch kháng sinh thô từ các chủng xạ khuẩn này có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc, từ đó bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh hại. Điều này không chỉ giúp nâng cao năng suất cây trồng mà còn giảm thiểu việc sử dụng hóa chất trong nông nghiệp.

2.1. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu đã tiến hành phân lập các chủng xạ khuẩn từ mẫu đất và thử nghiệm khả năng kháng nấm của chúng. Kết quả cho thấy, một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh mạnh, có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum và Fusarium. Các thí nghiệm lâm sàng cho thấy, việc sử dụng dịch kháng sinh từ xạ khuẩn không chỉ làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh mà còn cải thiện sức khỏe của cây ớt. Điều này chứng tỏ rằng Streptomyces có thể trở thành một giải pháp tiềm năng trong việc bảo vệ thực vật, góp phần vào việc phát triển nông nghiệp bền vững.

III. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu về Streptomyces và khả năng chống nấm mốc mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp. Việc ứng dụng các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh mạnh không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường do hóa chất. Các chế phẩm này có thể được sử dụng trong sản xuất nông nghiệp hữu cơ, giúp nâng cao chất lượng nông sản và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Hơn nữa, việc phát triển các sản phẩm sinh học từ xạ khuẩn còn góp phần vào việc bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển bền vững trong nông nghiệp.

3.1. Tương lai của nghiên cứu xạ khuẩn trong nông nghiệp

Tương lai của nghiên cứu về xạ khuẩn trong nông nghiệp rất hứa hẹn. Các nhà khoa học đang tiếp tục tìm kiếm và phân lập thêm nhiều chủng xạ khuẩn mới có khả năng sinh kháng sinh mạnh. Việc phát triển các công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất các chế phẩm sinh học, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh hại cho cây trồng. Sự kết hợp giữa nghiên cứu khoa học và thực tiễn sản xuất sẽ tạo ra những sản phẩm chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường nông sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về xạ khuẩn 1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (XK) thuộc lớp Actinobacteria, dưới lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [35].

XK phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể tìm thấy chúng ở trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Nhiều vùng trên thế giới, số lượng xạ khuẩn trong đất chiếm 20- 40% tổng số các vi sinh vật (VSV) đất. Theo Waksman, trong đất xạ khuẩn chiếm 9- 45% tổng số VSV, trong 1 gam đất có khoảng 29.000 mầm xạ khuẩn [64]. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật.

XK là những VSV hiếu khí, phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, XK có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu khoảng 6,8 – 7,5, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [34]. Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60– 70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh. Đặc biệt là các xạ khuẩn hiếm cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, nước, dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza, xenluloza … một số axit amin và axit hữu cơ.

Một số loại xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người và động vật [8]. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào tử), có đường kính thay đổi trong khoảng 0,2- 3µm, chiều dài có thể đạt tới vài cm [10]. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định, phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Các loài XK khác nhau Luan van đều có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở chỗ hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng hoặc rất ít phân nhánh, có loài có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng hoặc xoắn.

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường xù xì, chắc, có dạng da, vôi, nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng nâu, xám, trắng.tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh và loài. Kích thước và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có các sợi khuẩn ty bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. * Khuẩn ty Trên môi trường (MT) đặc, hệ sợi của XK có 2 loại: loại cắm sâu vào MT gọi là hệ sợi cơ chất (HSCC), với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng.

Một loại khác phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (HSKS) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại XK chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng. Độ dài của khuẩn ty XK trong giai đoạn phát triển là 11µm/ giờ [64] và chất nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi.

Một số XK có sinh ra nang bào tử bên trong có chứa các bào tử nang [8]. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh, gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [5].

Bào tử XK được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300- 400A0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… Luan van 1. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943 [64]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất.

Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1-10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1- 5mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước.

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Cuống sinh bào tử có những dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, có vòng…Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn.tùy thuộc vào loại xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy. Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ.

Nhiệt độ tối ưu là 25- 30OC, pH tối ưu 6,5- 8,0. Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Hiện nay có rất nhiều cách để phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn 1.

Định nghĩa chất kháng sinh Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về chất kháng sinh, theo định nghĩa của Viện sĩ Outchinikov (1987), CKS là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng ức chế tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở nồng độ thấp (10-3- 10-2 g/ml) [44]. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Có nhiều quan điểm khác nhau về sự hình thành chất kháng sinh (CKS). Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong môi trường tự nhiên. Số khác lại cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh là do sự cạnh tranh trong MT dinh dưỡng.

Thường thì CKS không có chức năng rõ rệt đối với tế bào sinh sản ra chúng. Mất khả năng hình thành CKS không làm mất khả năng sinh trưởng. Lại có quan điểm chất kháng sinh là sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào. Theo quan điểm này CKS là sản phẩm trao đổi thứ Luan van cấp, chúng chỉ được tổng hợp sau khi sinh trưởng của VSV đạt đến trạng thái cân bằng sau pha logarit và vật liệu tổng hợp nên chúng là các chất trao đổi sơ cấp [5].

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định. - CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym. - CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau. - CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor. Các cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện chúng. Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu.

Tính đặc hiệu đó gắn liền với cơ chế tác động, vì vậy không thể có cơ chế tác động chung của CKS đối với VSV. Cơ chế tác động của CKS có thể chia thành các nhóm cơ bản sau: - Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của VSV. - Ức chế chức năng của màng tế bào VSV. - Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.

- Ức chế quá trình sinh tổng hợp axit nucleic. - Ức chế cạnh tranh. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn 1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy * Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn.

Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28– 30oC, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18– 280C [22]. Luan van * pH môi trường Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [39],[65].

* Thời gian Việc tổng hợp CKS cũng phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất cao nhất thường là 24 giờ tuổi. Lượng giống cấy truyền vào khoảng từ 2 đến 10 % [13]. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng.

Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N, các chất khoáng. * Nguồn cacbon Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột [60]. Ngoài ra các chủng XK còn có thể sử dụng các loại đường là khác nhau như glucoza, mannoza, fructoza. acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong quá trình lên men sinh CKS.

* Nguồn nitơ Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ.