Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Và Gây Bệnh Của Virus PEDV Trên Lợn Tại Việt Nam

Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus PEDV từ lợn Yorkshire tại Hà Nội, cung cấp thông tin quan trọng cho ngành chăn nuôi.

• Tác giả: Dương Thị Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Trần Anh Đào
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Và Gây Bệnh Của Virus Gây Dịch Tiêu Chảy Trên Lợn
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Thesis Abstract
• 1.8. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.9. Mục tiêu đề tài
• 1.10. Phạm vi nghiên cứu
• 1.11. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.12. Tổng quan tài liệu
• 1.12.1. Tình hình nghiên cứu về dịch tiêu chảy ở lợn Yorkshire (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) trên thế giới và Việt Nam
• 1.12.2. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên thế giới
• 1.12.3. Tình hình nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) ở Việt Nam
• 1.13. Hiểu biết về căn bệnh
• 1.13.1. Hình thái cấu trúc
• 1.13.2. Tính chất nuôi cấy
• 1.13.3. Sức đề kháng
• 1.14. Hiểu biết về bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
• 1.14.1. Loài mắc bệnh
• 1.14.2. Lứa tuổi mắc bệnh
• 1.14.3. Đường xâm nhập
• 1.14.4. Cơ chế sinh bệnh
• 1.14.5. Triệu chứng lâm sàng
• 1.14.6. Phòng và kiểm soát bệnh
• 1.15. Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức
• 1.16. Định lượng virus
• 1.17. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 1.17.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.17.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.17.3. Đặc tính sinh học
• 1.17.4. Đặc điểm gây bệnh
• 1.17.5. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 1.17.6. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc
• 1.17.7. Phương pháp nghiên cứu
• 1.17.7.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
• 1.17.7.2. Phương pháp mổ khám
• 1.17.7.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
• 1.17.7.4. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
• 1.17.7.5. Phương pháp xử lý mẫu cho phân lập virus
• 1.17.7.6. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 1.17.7.7. Phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào
• 1.17.7.8. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50
• 1.17.7.9. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
• 1.17.7.10. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
• 1.18. Kết quả và thảo luận
• 1.18.1. Đặc tính sinh học
• 1.18.2. Xác định các mẫu lợn Yorkshire dương tính với virus PEDV
• 1.18.3. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trường tế bào
• 1.18.4. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập được
• 1.18.5. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV
• 1.18.6. Đặc điểm gây bệnh chủ yếu của lợn mắc PEDV
• 1.18.7. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV
• 1.18.8. Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV
• 1.18.9. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV
• 1.19. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Virus Gây Dịch Tiêu Chảy Ở Lợn

Ngành chăn nuôi lợn đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam, cung cấp nguồn thực phẩm thiết yếu. Tuy nhiên, dịch tiêu chảy ở lợn do virus gây ra là một thách thức lớn, gây thiệt hại kinh tế đáng kể. Bệnh lây lan nhanh, đặc biệt ở lợn con, ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả chăn nuôi. Việc nghiên cứu về virus gây tiêu chảy ở lợn là vô cùng cần thiết để tìm ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Các nghiên cứu tập trung vào việc xác định các chủng virus lưu hành, đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của chúng. Từ đó, có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, cũng như các loại vaccine phòng bệnh hiệu quả. Theo FAO (2009), rủi ro và chi phí cho thiệt hại tiềm ẩn thông qua các sản phẩm động vật ngày càng tăng cao trong nền chăn nuôi tập trung.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Virus Gây Bệnh Ở Lợn

Nghiên cứu về virus gây bệnh ở lợn, đặc biệt là virus gây tiêu chảy, có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ ngành chăn nuôi lợn. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học, dịch tễ học và cơ chế gây bệnh của virus giúp các nhà khoa học và bác sĩ thú y đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Điều này góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi và đảm bảo an ninh lương thực quốc gia. Nghiên cứu này cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại vaccine và thuốc điều trị bệnh hiệu quả hơn.

1.2. Tình Hình Dịch Bệnh Tiêu Chảy Ở Lợn Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, dịch bệnh tiêu chảy ở lợn do virus PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) gây ra đã được ghi nhận từ năm 2008. Bệnh thường xuyên xảy ra và có mặt ở nhiều tỉnh thành, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi. Tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, với sự xuất hiện của nhiều chủng virus khác nhau và các bệnh ghép, làm tăng nguy cơ lây lan và khó kiểm soát. Do đó, việc nghiên cứu về tình hình dịch bệnh tiêu chảy ở lợn tại Việt Nam là vô cùng cấp thiết để có thể đưa ra các giải pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh phù hợp.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Dịch Tiêu Chảy Ở Lợn Hiện Nay

Việc kiểm soát dịch tiêu chảy ở lợn gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp của virus và các yếu tố liên quan. Virus gây tiêu chảy ở lợn có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới với độc lực và khả năng lây lan khác nhau. Bên cạnh đó, việc chẩn đoán bệnh sớm và chính xác cũng là một thách thức, đặc biệt là trong điều kiện thực tế tại các trang trại chăn nuôi. Các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiện nay, như vaccine và vệ sinh chuồng trại, đôi khi không đạt hiệu quả mong muốn do sự kháng thuốc của virus và các yếu tố môi trường. Vì vậy, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra các giải pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

2.1. Sự Biến Đổi Của Virus Gây Tiêu Chảy Ở Lợn

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc kiểm soát dịch tiêu chảy ở lợn là sự biến đổi liên tục của virus gây bệnh. Virus có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới với độc lực và khả năng lây lan khác nhau. Điều này làm giảm hiệu quả của các loại vaccine hiện có và gây khó khăn cho việc chẩn đoán bệnh. Các nghiên cứu về sự biến đổi của virus là rất quan trọng để có thể phát triển các loại vaccine và phương pháp chẩn đoán mới, đáp ứng với sự thay đổi của virus.

2.2. Khó Khăn Trong Chẩn Đoán Bệnh Tiêu Chảy Ở Lợn

Việc chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn sớm và chính xác là rất quan trọng để có thể áp dụng các biện pháp điều trị và kiểm soát dịch bệnh kịp thời. Tuy nhiên, việc chẩn đoán bệnh gặp nhiều khó khăn do triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể giống với các bệnh khác, và các phương pháp chẩn đoán truyền thống thường tốn thời gian và đòi hỏi trang thiết bị hiện đại. Do đó, cần có các nghiên cứu để phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác và dễ dàng áp dụng tại các trang trại chăn nuôi.

2.3. Hạn Chế Của Các Biện Pháp Phòng Ngừa Hiện Tại

Các biện pháp phòng ngừa dịch tiêu chảy ở lợn hiện nay, như vaccine và vệ sinh chuồng trại, đôi khi không đạt hiệu quả mong muốn do nhiều yếu tố. Virus có thể kháng thuốc, và các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm và mật độ chăn nuôi cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của các biện pháp phòng ngừa. Do đó, cần có các nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng ngừa hiện tại và tìm ra các giải pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Virus Gây Dịch Tiêu Chảy Ở Lợn

Nghiên cứu về virus gây dịch tiêu chảy ở lợn đòi hỏi sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau, từ phân lập và xác định virus đến nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của chúng. Các phương pháp phân tích dịch tễ học cũng được sử dụng để theo dõi sự lây lan của dịch bệnh và xác định các yếu tố nguy cơ. Ngoài ra, các nghiên cứu về miễn dịch học cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các loại vaccine phòng bệnh hiệu quả. Các phương pháp nghiên cứu này giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về virus và tìm ra các giải pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

3.1. Phân Lập Và Xác Định Virus Gây Tiêu Chảy

Phân lập và xác định virus gây tiêu chảy là bước đầu tiên quan trọng trong nghiên cứu về dịch bệnh. Quá trình này bao gồm việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ lợn bị bệnh, nuôi cấy virus trong môi trường tế bào và sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định chủng virus. Việc phân lập và xác định virus giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về đặc điểm di truyền và kháng nguyên của virus, từ đó có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán và vaccine phù hợp.

3.2. Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Của Virus Lợn

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của virus lợn bao gồm việc xác định khả năng lây nhiễm, độc lực và sự biến đổi của virus. Các nghiên cứu này được thực hiện bằng cách sử dụng các mô hình thí nghiệm trên động vật hoặc tế bào. Kết quả của các nghiên cứu này giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của virus và tìm ra các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

3.3. Phân Tích Dịch Tễ Học Bệnh Tiêu Chảy Ở Lợn

Phân tích dịch tễ học bệnh tiêu chảy ở lợn là một công cụ quan trọng để theo dõi sự lây lan của dịch bệnh và xác định các yếu tố nguy cơ. Các phân tích này bao gồm việc thu thập dữ liệu về số lượng lợn bị bệnh, địa điểm xảy ra dịch bệnh, thời gian xảy ra dịch bệnh và các yếu tố liên quan như mật độ chăn nuôi, điều kiện vệ sinh và chủng loại vaccine được sử dụng. Kết quả của các phân tích này giúp các nhà quản lý và bác sĩ thú y đưa ra các quyết định về phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Chẩn Đoán Và Phòng Ngừa Bệnh Tiêu Chảy

Kết quả nghiên cứu về virus gây dịch tiêu chảy ở lợn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong việc chẩn đoán và phòng ngừa bệnh. Các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác giúp phát hiện bệnh sớm, từ đó có thể áp dụng các biện pháp điều trị và kiểm soát dịch bệnh kịp thời. Các loại vaccine phòng bệnh hiệu quả giúp bảo vệ lợn khỏi bị nhiễm bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Ngoài ra, các biện pháp vệ sinh chuồng trại và quản lý chăn nuôi tốt cũng đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa sự lây lan của dịch bệnh.

4.1. Phát Triển Các Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh

Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác là rất quan trọng để kiểm soát dịch tiêu chảy ở lợn. Các phương pháp chẩn đoán nhanh giúp phát hiện bệnh sớm, từ đó có thể áp dụng các biện pháp điều trị và kiểm soát dịch bệnh kịp thời. Các phương pháp chẩn đoán nhanh thường dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR (Polymerase Chain Reaction) và ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

4.2. Nghiên Cứu Và Sản Xuất Vaccine Phòng Bệnh Hiệu Quả

Vaccine là một công cụ quan trọng để phòng ngừa dịch tiêu chảy ở lợn. Các loại vaccine hiệu quả giúp bảo vệ lợn khỏi bị nhiễm bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Việc nghiên cứu và sản xuất vaccine đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về đặc điểm sinh học và kháng nguyên của virus. Các loại vaccine hiện nay thường dựa trên các chủng virus đã được làm yếu hoặc bất hoạt.

4.3. Tăng Cường Vệ Sinh Chuồng Trại Và Quản Lý Chăn Nuôi

Vệ sinh chuồng trại và quản lý chăn nuôi tốt đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa sự lây lan của dịch tiêu chảy ở lợn. Các biện pháp vệ sinh chuồng trại bao gồm việc làm sạch và khử trùng chuồng trại thường xuyên, kiểm soát côn trùng và động vật gặm nhấm, và cung cấp nước sạch và thức ăn đảm bảo chất lượng cho lợn. Quản lý chăn nuôi tốt bao gồm việc kiểm soát mật độ chăn nuôi, cách ly lợn bệnh và tiêm phòng vaccine đầy đủ.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Virus Gây Tiêu Chảy Ở Lợn

Nghiên cứu về virus gây dịch tiêu chảy ở lợn là một lĩnh vực quan trọng và đầy thách thức. Các kết quả nghiên cứu đã giúp chúng ta hiểu rõ hơn về đặc điểm sinh học, dịch tễ học và cơ chế gây bệnh của virus, từ đó có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán và phòng ngừa bệnh hiệu quả. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều câu hỏi chưa được giải đáp, và cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra các giải pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn. Các hướng nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các loại vaccine thế hệ mới, các phương pháp điều trị bệnh hiệu quả hơn và các biện pháp quản lý chăn nuôi bền vững.

5.1. Phát Triển Vaccine Thế Hệ Mới

Việc phát triển vaccine thế hệ mới là một hướng nghiên cứu quan trọng để kiểm soát dịch tiêu chảy ở lợn. Các loại vaccine thế hệ mới có thể dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến như vaccine DNA và vaccine vector. Các loại vaccine này có thể cung cấp khả năng bảo vệ tốt hơn và giảm thiểu nguy cơ tác dụng phụ.

5.2. Nghiên Cứu Các Phương Pháp Điều Trị Bệnh Hiệu Quả Hơn

Ngoài việc phòng ngừa bệnh, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị bệnh hiệu quả hơn cũng là rất quan trọng. Các phương pháp điều trị hiện nay thường tập trung vào việc giảm triệu chứng và hỗ trợ lợn phục hồi. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu để tìm ra các phương pháp điều trị có thể tiêu diệt virus và ngăn chặn sự lây lan của bệnh.

5.3. Quản Lý Chăn Nuôi Bền Vững

Quản lý chăn nuôi bền vững là một yếu tố quan trọng để ngăn ngừa dịch tiêu chảy ở lợn. Các biện pháp quản lý chăn nuôi bền vững bao gồm việc kiểm soát mật độ chăn nuôi, cung cấp thức ăn và nước uống đảm bảo chất lượng, và áp dụng các biện pháp vệ sinh chuồng trại tốt. Quản lý chăn nuôi bền vững giúp tăng cường sức đề kháng của lợn và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam đóng vai trò trụ cột khi cung cấp trên 60% tổng sản lượng thịt tiêu thụ toàn quốc. Tuy nhiên, sự phát triển theo hướng tập trung quy mô lớn đang đối mặt với thách thức nghiêm trọng từ dịch tiêu chảy cấp do virus PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) gây ra. Mầm bệnh này có tốc độ lây lan nhanh chóng qua đường tiêu hóa, gây tỷ lệ mắc bệnh lên tới 100% trong đàn và tỷ lệ tử vong dao động từ 50% đến 100% ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Thiệt hại kinh tế từ PEDV ước tính làm sụt giảm hàng chục tỷ đồng mỗi năm cho các cơ sở chăn nuôi do làm tăng tỷ lệ hao hụt đầu con, giảm hiệu quả chuyển đổi thức ăn và tiêu tốn chi phí thú y.

Mặc dù PEDV đã xuất hiện tại Việt Nam từ năm 2008, nhưng việc nghiên cứu chuyên sâu về đặc tính sinh học, khả năng thích ứng nuôi cấy trên môi trường tế bào và bệnh lý học phân tử của các chủng thực địa vẫn còn nhiều khoảng trống. Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là xác định tỷ lệ nhiễm PEDV, phân lập thành công các chủng virus thực địa trên dòng tế bào Vero, định lượng hiệu giá virus, đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào và làm rõ các biến đổi bệnh lý đại thể cũng như vi thể trên đàn lợn giống Yorkshire.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trên 15 mẫu bệnh phẩm thu thập từ các trang trại chăn nuôi lợn Yorkshire tại 4 tỉnh phụ cận Hà Nội gồm Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Vĩnh Phúc trong giai đoạn từ tháng 7 năm 2015 đến tháng 8 năm 2016. Kết quả của công trình mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp nguồn giống virus thực địa chuẩn hóa để phát triển vắc-xin phòng bệnh, đồng thời nâng cao độ chính xác cho các quy trình chẩn đoán phân tử tại thực địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết virus học hiện đại về họ Coronaviridae, giống Alphacoronavirus. Virus PEDV có cấu trúc hạt hình cầu với đường kính từ 95 đến 190 nm, sở hữu lớp vỏ bọc lipid chứa các gai glycoprotein hình dùi cui dài từ 18 đến 23 nm. Bộ gen của PEDV là phân tử RNA sợi đơn dương có kích thước khoảng 28.033 nucleotide. Trong đó, gen mã hóa Glycoprotein S với khối lượng phân tử từ 180 đến 200 kDa đóng vai trò quyết định tính kháng nguyên, khả năng bám dính vào thụ thể tế bào chủ và kích thích cơ thể sinh kháng thể trung hòa.

Khung lý thuyết bệnh sinh đường ruột giải thích cơ chế xâm nhập của virus qua đường miệng, sau đó chọn lọc và nhân lên trong tế bào biểu mô lông nhung ruột non. Quá trình này phá hủy cấu trúc nhung mao ruột, làm giảm tỷ lệ chiều cao trên độ dày của lông nhung từ 7,1 xuống 3,1. Sự mất mát các vi nhung mao dẫn đến suy giảm nghiêm trọng hoạt tính enzyme bề mặt, gây ra hội chứng kém hấp thu, mất nước cấp tính và rối loạn điện giải. Các khái niệm then chốt được chuẩn hóa trong nghiên cứu bao gồm: Bệnh tích tế bào (CPE - Cytopathogenic Effect), Liều gây nhiễm 50% môi trường nuôi cấy mô (TCID50) và Bội số lây nhiễm (MOI - Multiplicity of Infection).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 15 mẫu bệnh phẩm (ruột non và phân) thu thập từ lợn Yorkshire nghi mắc bệnh tại các ổ dịch thực địa. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm ưu tiên các cá thể lợn con theo mẹ và lợn sau cai sữa đang có triệu chứng tiêu chảy cấp tính, đảm bảo nồng độ hạt virus trong bệnh phẩm đạt mức cao nhất.

Quy trình phân tích kết hợp chặt chẽ giữa sinh học phân tử, virus học cổ điển và giải phẫu bệnh lý. Phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi xuôi PS1 và mồi ngược PS2 đặc hiệu để khuếch đại một phần gen S có kích thước 651 bp. Lý do lựa chọn đoạn gen S làm đích khuếch đại vì đây là vùng gen ổn định, có độ đặc hiệu cao giúp phân biệt chính xác PEDV với các tác nhân gây tiêu chảy khác như TGEV hay Rotavirus. Phương pháp phân lập virus được tiến hành trên tế bào thận khỉ xanh châu Phi Vero (ATCC CCL-81) với môi trường duy trì DMEM bổ sung 10 µg/ml Trypsin hoạt hóa. Hiệu giá virus được xác định trên khay 96 giếng theo công thức toán học Reed-Muench. Biến đổi vi thể được đánh giá thông qua kỹ thuật tẩm đúc paraffin, cắt lát mỏng 2 đến 3 µm và nhuộm kép Hematoxylin - Eosin (HE). Toàn bộ quá trình thực nghiệm được kiểm soát nghiêm ngặt trong 14 tháng tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phản ứng RT-PCR trên 15 mẫu bệnh phẩm ruột và phân đều cho kết quả dương tính với tỷ lệ 100%, thể hiện rõ vạch DNA kích thước 651 bp tương ứng với thang chuẩn. Tỷ lệ phát hiện virus từ mẫu ruột non đạt độ đậm nét và độ tin cậy vượt trội so với mẫu phân.

Công trình đã phân lập thành công 4 chủng virus PEDV thực địa từ ruột non lợn con tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Vĩnh Phúc (ký hiệu lần lượt là PEDV-01, PEDV-02, PEDV-03 và PEDV-04). Cả 4 chủng đều thích ứng tốt trên tế bào Vero sau 4 đời cấy truyền liên tiếp. Bệnh tích tế bào đặc trưng xuất hiện với hiện tượng tế bào phì đại, màng tế bào bị dung giải, nhân co cụm hình thành các thể hợp bào nhiều nhân (syncytium) và bong tróc hoàn toàn khỏi đáy bình nuôi cấy.

Hiệu giá virus của các chủng phân lập dao động từ 10^4,25 đến 10^5,25 TCID50/25µl. Trong đó, chủng PEDV-03 đạt hiệu giá cao nhất ở mức 10^5,25 TCID50/25µl và bắt đầu gây bệnh tích tế bào sớm nhất chỉ sau 24 giờ gây nhiễm, phá hủy 100% bề mặt đơn lớp tế bào ở thời điểm 72 đến 84 giờ. Ba chủng còn lại biểu hiện bệnh tích rõ rệt từ 36 giờ và phá hủy tế bào hoàn toàn sau 96 giờ.

Về đặc điểm gây bệnh, 100% lợn mắc bệnh có triệu chứng ủ rũ, tiêu chảy phân lỏng màu vàng, 80,00% gầy còm sút cân và 46,67% có tập tính nằm chồng đống trên bụng mẹ. Biến đổi đại thể điển hình ghi nhận 100% thành ruột mỏng căng phồng chứa dịch vàng và hơi, 100% dạ dày chứa sữa vón đông không tiêu và 86,67% gan sưng, túi mật căng đặc dịch. Về vi thể, tổn thương sung huyết chiếm 100% ở hạch ruột, 80,00% ở ruột non, dạ dày và phổi; thâm nhiễm tế bào viêm chiếm 80,00% ở phổi và 73,33% ở ruột non; thoái hóa tế bào thận ghi nhận ở mức 80,00%.

Thảo luận kết quả

Khả năng nhân lên mạnh mẽ của virus PEDV trên tế bào Vero có sự hiện diện của Trypsin phù hợp với các nghiên cứu quốc tế tại Nhật Bản và Hàn Quốc, chứng minh Trypsin là yếu tố bắt buộc để cắt mở cấu trúc protein S giúp virus xâm nhập màng tế bào. Tỷ lệ phát hiện mầm bệnh trên mẫu ruột cao hơn mẫu phân phản ánh đúng bản chất sinh bệnh học, khi virus khu trú và nhân bản tập trung tại các tế bào biểu mô nhung mao ruột non.

Các dữ liệu động học phát triển bệnh tích tế bào theo các mốc thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 84 giờ có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ đường (Line Chart) biểu diễn tốc độ hủy hoại đơn lớp tế bào nuôi cấy. Bên cạnh đó, tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể (sung huyết, xuất huyết, thoái hóa, hoại tử) trên các cơ quan đích rất thích hợp để trình bày dưới dạng biểu đồ cột nhóm (Clustered Bar Chart) hoặc bảng ma trận tương quan đa biến, giúp người đọc dễ dàng so sánh mức độ tổn thương bệnh lý giữa hệ tiêu hóa và các cơ quan nội tạng khác. Việc phân lập thành công các chủng thực địa có hiệu giá cao là bước tiến quan trọng, cung cấp nguyên liệu sinh học then chốt để nghiên cứu vắc-xin tự sinh (autogenous vaccine) và vắc-xin nhược độc phòng chống dịch PED tại các vùng chăn nuôi trọng điểm phía Bắc.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm kiểm soát hiệu quả dịch tiêu chảy cấp do PEDV và giảm thiểu tổn thất cho ngành chăn nuôi lợn, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp mang tính ứng dụng cao:

1. Thiết lập quy trình an toàn sinh học đa lớp tại trang trại: Định kỳ sát trùng chuồng trại bằng dung dịch khử trùng chuyên dụng 2 lần mỗi tuần, kiểm soát chặt chẽ phương tiện vận chuyển và cách ly người ra vào trại nhằm mục tiêu giảm tỷ lệ lây nhiễm PEDV xuống dưới 5% trong vòng 6 tháng. Giải pháp này do chủ trang trại và kỹ thuật viên thú y trực tiếp thực hiện.
2. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR định kỳ vào chẩn đoán sớm: Triển khai xét nghiệm sàng lọc bằng cặp mồi gen S (sản phẩm 651 bp) cho các đàn nái hậu bị và nái mang thai trước khi sinh 3 tuần, rút ngắn thời gian phát hiện ca bệnh xuống dưới 4 giờ nhằm mục tiêu khoanh vùng dập dịch kịp thời. Trách nhiệm thực hiện thuộc về các Chi cục Thú y vùng và các phòng xét nghiệm dịch tễ.
3. Phát triển vắc-xin phòng bệnh từ chủng virus thực địa thích ứng: Sử dụng chủng PEDV-03 có hiệu giá cao 10^5,25 TCID50/25µl để nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc-xin nhược độc hoặc vô hoạt, hướng tới mục tiêu nâng tỷ lệ bảo hộ kháng thể ở đàn lợn con sơ sinh lên trên 85% theo lộ trình nghiên cứu từ 18 đến 24 tháng. Chủ thể thực hiện là các Viện nghiên cứu thú y phối hợp cùng các doanh nghiệp dược thú y.
4. Tối ưu hóa chế độ chăm sóc và dinh dưỡng đầu đời: Đảm bảo 100% lợn con được bú đủ sữa đầu giàu kháng thể trong vòng 24 giờ đầu sau khi sinh, kết hợp duy trì nhiệt độ chuồng úm ổn định ở mức 30 đến 32 độ C để tăng sức đề kháng, giảm tỷ lệ tử vong ở lợn sơ sinh xuống dưới 10%. Giải pháp này do công nhân chăn nuôi tại chuồng đẻ trực tiếp đảm trách.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y: Cung cấp nguồn tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình phân lập, cấy truyền virus PEDV trên tế bào Vero, kỹ thuật xác định TCID50 và phương pháp chẩn đoán phân tử RT-PCR đoạn gen S.
2. Bác sĩ thú y và cán bộ chẩn đoán lâm sàng tại cơ sở: Nắm bắt bộ tiêu chí chẩn đoán phân biệt dựa trên tam giác dịch tễ học, triệu chứng phân lỏng màu vàng (tỷ lệ 100%), bệnh tích thành ruột mỏng căng phồng (tỷ lệ 100%) và tổn thương vi thể teo nhung mao ruột.
3. Chủ trang trại và nhà quản lý cơ sở chăn nuôi lợn công nghiệp: Vận dụng các kiến thức về con đường truyền lây và cơ chế bệnh sinh để thiết kế quy trình an toàn sinh học, giảm thiểu rủi ro bùng phát dịch tiêu chảy trên đàn lợn giống Yorkshire.
4. Các nhà khoa học và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y: Tiếp cận thông số động học tăng trưởng và đặc tính sinh học của các chủng thực địa, làm cơ sở nghiên cứu sản xuất kit chẩn đoán kháng nguyên nhanh hoặc sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) đặc hiệu kháng PEDV.

Câu hỏi thường gặp

Virus PEDV gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở lứa tuổi nào của đàn lợn? Virus PEDV gây tỷ lệ tử vong cao nhất từ 50% đến 100% ở nhóm lợn con dưới 7 ngày tuổi do hệ thống miễn dịch chưa hoàn thiện và lông nhung ruột non bị phá hủy nhanh chóng. Động vật mắc bệnh bị tiêu chảy cấp tính, phân lỏng màu vàng, dẫn đến mất nước trầm trọng và chết sau 3 đến 4 ngày.

Tại sao môi trường nuôi cấy tế bào Vero cần bổ sung enzyme Trypsin khi phân lập PEDV? Enzyme Trypsin đóng vai trò xúc tác cắt mở các glycoprotein gai (protein S) trên bề mặt hạt virus, tạo điều kiện cho virus bám dính và dung hợp vào màng tế bào Vero. Trong nghiên cứu, bổ sung 10 µg/ml Trypsin giúp các chủng thực địa thích ứng tốt và đạt hiệu giá cao tới 10^5,25 TCID50/25µl.

Những biến đổi bệnh tích đại thể nào mang tính đặc trưng nhất của bệnh PED? Bệnh tích mổ khám đặc trưng nhất là toàn bộ ruột non căng phồng chứa đầy dịch màu vàng và bọt khí (tỷ lệ 100%), thành ruột mỏng trong suốt do niêm mạc bị teo rụng. Dạ dày luôn chứa đầy sữa vón đông không tiêu (tỷ lệ 100%) cùng với tình trạng gan sưng và túi mật căng đầy dịch mật đặc (tỷ lệ 86,67%).

Kỹ thuật RT-PCR sử dụng đoạn gen S có ưu thế gì trong chẩn đoán virus PEDV? Kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi PS1/PS2 khuếch đại đoạn gen S kích thước 651 bp mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% trên 15 mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này cho phép phát hiện sớm vật chất di truyền của virus ngay cả khi hàm lượng kháng nguyên thấp, đồng thời phân biệt chính xác với các bệnh tiêu chảy khác.

Khi trang trại bùng phát dịch PED, biện pháp can thiệp khẩn cấp nào mang lại hiệu quả cao nhất? Biện pháp cấp thiết là cách ly tuyệt đối chuồng nhiễm, ngừng sử dụng kháng sinh đường ruột vô hiệu, tích cực bù nước và điện giải cho lợn con kết hợp nâng nhiệt độ chuồng úm lên 32 độ C. Trong thực tế, việc tạo miễn dịch đàn bằng cách cho lợn nái ăn ruột lợn con nhiễm bệnh được kiểm soát giúp tạo kháng thể sữa đầu bảo hộ đàn con sau 2 đến 3 tuần.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu đặt ra với 5 đóng góp học thuật và thực tiễn nổi bật:

• Xác định chính xác tỷ lệ nhiễm virus PEDV đạt 100% trên đàn lợn Yorkshire nghi mắc bệnh bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen S kích thước 651 bp.
• Phân lập thành công 4 chủng virus PEDV thực địa (PEDV-01 đến PEDV-04) thích ứng ổn định trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero qua 4 đời cấy truyền.
• Định lượng hiệu giá virus đạt từ 10^4,25 đến 10^5,25 TCID50/25µl, trong đó chủng PEDV-03 thể hiện độc lực và khả năng nhân lên mạnh nhất sau 24 đến 84 giờ.
• Hệ thống hóa chi tiết các tổn thương bệnh lý đại thể (thành ruột mỏng 100%) và vi thể (sung huyết hạch ruột 100%, teo nhung mao ruột 80,00%).
• Cung cấp nguồn chủng virus thực địa chuẩn hóa phục vụ trực tiếp cho công tác nghiên cứu vắc-xin và cải tiến bộ kit chẩn đoán nhanh.

Đóng góp chính của luận văn là thiết lập cơ sở dữ liệu sinh học phân tử và bệnh lý học chuẩn xác cho các chủng PEDV lưu hành tại vùng phụ cận Hà Nội. Kế hoạch tiếp theo đề xuất thực hiện giải trình tự toàn bộ gen S trong vòng 6 tháng tới và tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin nhược độc trên động vật trong 12 tháng. Các nhà khoa học và cơ sở chăn nuôi hãy kết nối, khai thác dữ liệu từ công trình này để nâng cao hiệu quả phòng ngừa dịch bệnh cho đàn lợn tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƢƠNG THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GÂY BỆNH CỦA VIRUS GÂY DỊCH TIÊU CHẢY TRÊN LỢN ( PEDV - PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS) PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC ĐÀN LỢN YORKSHIRE NUÔI TẠI VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Bùi Trần Anh Đào NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hồng ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng.

vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis Abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Tình hình nghiên cứu về dịch tiêu chảy ở lợn Yorkshire (Porcine Epidemic Diarrhea Virus - PEDV) trên thế giới và việt nam. Một số nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) trên thế giới. Tình hình nghiên cứu bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) ở Việt Nam. Hiểu biết về căn bệnh.

Hình thái cấu trúc. Tính chất nuôi cấy. Sức đề kháng. Hiểu biết về bệnh do Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV).

Loài mắc bệnh. Lứa tuổi mắc bệnh. Đƣờng xâm nhập. Cơ chế sinh bệnh.

Triệu chứng lâm sàng. Phòng và kiểm soát bệnh. Phƣơng pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức. Định lƣợng virus.

Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. Đối tƣợng nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Đặc tính sinh học.

Đặc điểm gây bệnh. Địa điểm, thời gian nghiên cứu. Nguyên liệu, hóa chất, máy móc. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng. Phƣơng pháp mổ khám. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản. Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT- PCR.

Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân lập virus. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào. Phƣơng pháp phân lập virus trên môi trƣờng tế bào. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50.

Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể. Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận. Đặc tính sinh học.

Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV. Kết quả phân lập và giám định virus PEDV trên môi trƣờng tế bào. Xác định hiệu giá của chủng virus phân lập đƣợc. Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus PEDV.

Đặc điểm gây bệnh chủ yếu của lợn mắc PEDV. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV. Bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn yorkshine mắc PEDV. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshine mắc PEDV.

Kết luận và kiến nghị. 47 Tài liệu tham khảo. 48 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Nghĩa tiếng Việt µl Micro lit CPE Cyto Pathogenic Effect DMEM Dulbecc’s Modified Eagle Medium ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal bovine serum IFA Indirect Immunofluorescense Assay IPMA Indirect Immunoperoxidase Monolayer Assay MOI Multiplicity Of Infection PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGEV Transmissible Gastro Enteritis Virus RNA Ribonucleoic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình. Kết quả của phản ứng RT-PCR ở các mẫu bệnh phẩm chẩn đoán bệnh PEDV.

Nguồn gốc của các mẫu lợn Yorkshire theo từng địa phƣơng đƣợc chẩn đoán dƣơng tính với PEDV. Kết quả phân lập virus PEDV trên môi trƣờng tế bào Vero. Kết quả giám định virus PEDV trong các mẫu phân lập đời thứ 4. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PEDV phân lập đƣợc.

Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm các chủng virus PEDV phân lập. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PEDV. Bảng kết quả biến đổi bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV. Biến đổi bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của lợn con theo mẹ mắc PEDV.

42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cấu trúc của Coronavirus (Kathryn V. Cơ chế gây bệnh của PEDV. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR.

Gen đƣợc khuếch đại một phần gen S (651bp). Tế bào Vero bình thƣờng. Tế bào Vero khi bắt đầu có bệnh tích. Bệnh tích tế bào đang phát triển.

Tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Bệnh tích tế bào ở 24h - PEDV – 03. Bệnh tích tế bào ở 48h – PEDV – 03. Bệnh tích tế bào ở 72h – PEDV – 03.

Bệnh tích tế bào ở 84h - PEDV - 03. Lợn Yorkshire gây sút cân, gầy còm. Lợn Yorkshire nôn mửa. Lợn Yorkshire nằm dồn đống.

Phân dính hậu môn, chân. Phân lỏng màu vàng. Phân màu xi măng. Ruột chứa dịch lỏng màu vàng.

Thành ruột mỏng chứa đầy hơi. Hạch bẹn nông sƣng to. Thận xuất huyết điểm. Phổi xuất huyết.

Gan sƣng, túi mật căng. Biểu mô dạ dày đứt nát (HEx10). Ruột non sung huyết, xuất huyết (HEx10). Phổi sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm (HE x 10).

Lông nhung ruột đứt nát (HE x 10). Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE x 40). Thận sƣng huyết, thâm nhiễm tế bào (HE x 10). 45 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dƣơng Thị Hồng Tên Luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh của virus gây dịch tiêu chảy trên lợn (PEDV-Porcine Epidemic Diarrhea Virus) phân lập được từ các đàn lợn Yorkshire nuôi tại vùng phụ cận Hà Nội”.

Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc một số đặc tính sinh học và gây bệnh của các chủng virus PEDV phân lập từ lợn Yorkshire mắc PEDV tại vùng phụ cận Hà Nội phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều chế vaccine phòng bệnh. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nội dung : - Đặc tính sinh học + Xác định các mẫu lợn Yorkshire dƣơng tính với virus PEDV. + Phân lập các chủng PEDV trên môi trƣờng tế bào. + Xác định hiệu giá virus của các chủng PEDV phân lập.

+ Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của chủng PEDV phân lập trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero. - Đặc điểm gây bệnh +Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus). +Xác định bệnh tích đại thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus). +Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn Yorkshire mắc PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus ).

 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu : - Vật liệu + Nguyên liệu Các lợn Yorkshire mắc bệnh PEDV nuôi ở một số trang trại tại vùng phụ cận Hà Nội. Tế bào Vero đƣợc nuôi cấy trên khay nuôi tế bào hoặc đĩa lồng ix + Hóa chất Hóa chất sử dụng trong làm tiêu bản vi thể: dung dịch focmon 10%, xylem, thuốc nhuộm HE, Baume Canada, NaHCO3 1%, focmon10%, cồn, Xylen, Ethanol (96-100°), paraffin, PBS, DAB… Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trƣờng nuôi cấy DMEM (Dulbecc’s Modified Eagle Medium), FBS (Fetal bovine serum), kháng sinh ( penicillin (100 UI/ml), streptomycin (100 pg/ml)), … + Máy móc dụng cụ Máy móc: Kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy chạy điện di, máy PCR, máy đục khuôn mẫu, máy cắt tiêu bản (Microtom), máy chụp gel, cân điện, lò vi sóng, máy PCR , box vô trùng, tủ ấm 37°C/5% CO2, tủ sấy, tủ lạnh -20°C, tủ lạnh -80°C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm lạnh, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,… Dụng cụ sử dụng : Dao, kéo, panh kẹp, khay, eppendorf, bông cồn, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, panh, dao, kéo, cƣa, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống nghiệm, lọ đựng formol 10%, bình nuôi cấy tế bào, khay 96 giếng, khay 24 giếng, đĩa lồng, pipet,… - Phƣơng pháp nghiên cứu + Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng + Phƣơng pháp mổ khám + Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản tiêu bản + Phƣơng pháp tiến hành phản ứng RT-PCR + Phƣơng pháp xử lý mẫu và phân lập virus + Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào + Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus TCID50 + Phƣơng pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể + Phƣơng pháp thống kê và xử lý số liệu Kết quả chính và kết luận 1. Đặc tính sinh học - Phân lập thành công 4 chủng virus PEDV từ 15 mẫu lợn đƣợc chẩn đoán dƣơng tính bằng với bệnh. Bệnh tích tế bào đặc trƣng đƣợc với các đám tế bào bị dung giải màng tế bào, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào, quan sát rõ bằng kính hiển vi soi ngƣợc.

- Các chủng virus PEDV phân lập đƣợc có hiệu giá từ 104. x - Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ gây nhiễm là sớm nhất. Tế bào sau gây nhiễm sẽ bị phá hủy hoàn toàn sau 84 giờ gây nhiễm.