Luận Án Tiến Sĩ: Nghiên Cứu Vi Khuẩn Chuyển Hóa Nitơ Trong Nền Đáy Vùng Nuôi Tôm Hùm Panulirus Sp

Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm Panulirus sp, ứng dụng hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản.

• Tác giả: Trương Phước Thiên Hoàng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Phú Hòa
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nền đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) phục vụ nuôi trồng thủy sản
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Tóm tắt
• SUMMARY
• MỤC LỤC
• Danh sách chữ viết tắt
• Danh sách các bảng
• Danh sách các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan tình hình nuôi tôm hùm lồng bè
• 1.2. Hiện trạng ô nhiễm môi trường nước vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài
• 1.3. Vi sinh vật trong môi trường nước mặn
• 1.4. Sơ đồ chu trình chuyển hóa nitơ trong hệ sinh thái biển
• 1.5. Các quá trình chuyển hoá nitơ và vai trò các nhóm vi khuẩn tham gia chuyển hóa
• 1.6. Đặc điểm của các nhóm vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hóa Nitơ
• 1.7. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
• 1.8. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Rhodococcus
• 1.9. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Pseudomonas
• 1.10. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Stenotrophomonas
• 1.11. Đặc điểm sinh học của các nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ khác
• 1.12. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn
• 1.13. Nguồn khoáng và vitamin
• 1.14. Thời gian nuôi cấy
• 1.15. Động học của quá trình vi sinh vật
• 1.16. Sơ lược về ma trận Plackett - Burman và Box - Behnken
• 1.17. Giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
• 1.18. Ma trận Plackett - Burman
• 1.19. Ma trận Box-Behnken (BBD)
• 1.20. Các yếu tố ảnh hưởng đến môi trường nước nuôi tôm thẻ chân trắng
• 1.21. Ammonia tổng cộng (TAN - Total Ammonia Nitrogen)
• 1.22. Nitrite và Nitrate
• 1.23. Tình hình nghiên cứu ứng dụng của vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản
• 1.24. Tình hình ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trong nước
• 1.25. Tình hình ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp thu mẫu bùn đáy
• 2.3. Vị trí thu mẫu
• 2.4. Phương pháp phân tích hóa lý của mẫu bùn:
• 2.5. Nội dung 1: Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm
• 2.6. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus sp
• 2.7. Phân lập vi khuẩn Bacillus sp
• 2.8. Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn Bacillus sp
• 2.9. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn Bacillus sp
• 2.10. Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB)
• 2.11. Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia (phụ lục 1. Các bước phân lập nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia
• 2.12. Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn AOB
• 2.13. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn AOB
• 2.14. Phương pháp phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB)
• 2.15. Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite
• 2.16. Các bước phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB)
• 2.17. Phương pháp định danh sinh hóa vi khuẩn NOB
• 2.18. Phương pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn NOB
• 2.19. Khảo sát quá trình chuyển hóa ammonium, nitrite, nitrate của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
• 2.20. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
• 2.21. Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng và dạng bột
• 2.22. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men tạo chế phẩm dạng lỏng của các chủng vi khuẩn
• 2.23. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối ba chủng vi khuẩn
• 2.24. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm dạng lỏng
• 2.25. Tối ưu hóa các thành phần môi trường nhân sinh khối của 3 chủng vi khuẩn bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RMS)
• 2.26. Chế tạo chế phẩm vi sinh dạng bột
• 2.27. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sản xuất của các chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn
• 2.28. Bảo quản chế phẩm vi sinh dạng bột
• 2.29. Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản
• 2.30. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở qui mô phòng thí nghiệm
• 2.31. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống ở qui mô bể xi-măng 1m3
• 2.32. Chỉ tiêu đánh giá
• 2.33. Xử lý thống kê
• 3. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm
• 3.2. Các chỉ tiêu môi trường trong mẫu bùn được thu ở Vùng Vịnh Xuân Đài
• 3.3. Nhóm vi khuẩn Bacillus sp
• 3.4. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus chuyển hóa ammonia
• 3.5. Chọn lọc khả năng xử lý ammonia của các vi khuẩn phân lập được
• 3.6. Kết quả định danh sinh hóa của các chủng vi khuẩn Bacillus sp
• 3.7. Kết quả định danh sinh học phân tử các chủng vi khuẩn Bacillus sp
• 3.8. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa ammonia của các chủng vi khuẩn Bacillus sp
• 3.9. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB) từ mẫu bùn
• 3.10. Kết quả xác định vi khuẩn chuyển hóa ammonia có trong mẫu bùn
• 3.11. Kết quả đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.12. Kết quả xác định khả năng chuyển hóa NH3 của các chủng vi khuẩn
• 3.13. Kết quả định danh sinh hóa các chủng vi khuẩn
• 3.14. Kết quả định danh bằng giải trình tự vùng 16S – rRNA
• 3.15. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa ammonia của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.16. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite từ mẫu bùn
• 3.17. Kết quả xác định vi khuẩn chuyển hóa nitrite có trong mẫu bùn
• 3.18. Kết quả đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.19. Kết quả xác định khả năng chuyển hóa NO2- của các chủng vi khuẩn
• 3.20. Kết quả định danh sinh hóa các chủng vi khuẩn
• 3.21. Định danh vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rRNA
• 3.22. Kết quả đánh giá khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.23. Khảo sát khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và khả năng chịu mặn của các nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus, AOB và NOB
• 3.24. Khảo sát khả năng chuyển hóa NO2-, NO3- và khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn AOB
• 3.25. Khảo sát khả năng chuyển hóa NH4- và NO3- và khả năng chịu mặn của nhóm vi khuẩn NOB
• 3.26. Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng và bột
• 3.27. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng nuôi cấy và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men tạo chế phẩm dạng lỏng của các chủng vi khuẩn
• 3.28. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối ba chủng vi khuẩn
• 3.29. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm dạng lỏng
• 3.30. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn
• 3.31. Tối ưu hóa các thành phần môi trường nhân sinh khối của 3 chủng vi khuẩn bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RMS)
• 3.32. Tạo chế phẩm vi sinh dạng bột
• 3.33. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sản xuất của các chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn
• 3.34. Tạo chế phẩm vi khuẩn dạng bột
• 3.35. Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản
• 3.36. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nước nuôi tôm thẻ chân trắng (không có tôm) ở qui mô phòng thí nghiệm
• 3.37. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn
• 3.38. Đánh giá mật độ vi sinh vật khi bổ sung chế phẩm vi sinh
• 3.39. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong bể nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống ở qui mô bể xi-măng 1m3
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
• TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong nuôi tôm hùm Panulirus sp

Luận án tập trung vào nghiên cứu vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ trong môi trường nuôi tôm hùm Panulirus sp. Mục tiêu chính là phân lập và định danh các chủng vi khuẩn từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm tại Vịnh Xuân Đài, Phú Yên. Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng chuyển hóa ammonia và nitrite, đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước và quản lý môi trường nuôi trồng. Kết quả nghiên cứu đã xác định được ba chủng vi khuẩn hiệu quả nhất: Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, và Rhodococcus rhodochrous T9.

1.1. Phân lập và định danh vi khuẩn

Quá trình phân lập vi khuẩn được thực hiện từ các mẫu bùn đáy thu thập trong 12 tháng. Các chủng vi khuẩn được định danh thông qua phương pháp sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA. Kết quả cho thấy ba chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonia và nitrite hiệu quả nhất. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của chúng trong công nghệ sinh học và nuôi trồng thủy sản.

1.2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu đã tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy cho ba chủng vi khuẩn. Sử dụng phương pháp Box-Behnken, các yếu tố như mật rỉ đường, cao nấm men, và NaCl được điều chỉnh để đạt mật độ vi khuẩn cao nhất. Kết quả cho thấy môi trường tối ưu giúp tăng sinh khối vi khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi cho sản xuất chế phẩm vi sinh.

II. Ứng dụng chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản

Luận án đã phát triển chế phẩm vi sinh dạng lỏng và bột từ ba chủng vi khuẩn trên. Chế phẩm được đánh giá hiệu quả trong việc kiểm soát hàm lượng TAN, NO2, và NO3 trong mô hình nuôi tôm thẻ chân trắng. Kết quả cho thấy chế phẩm giúp duy trì chất lượng nước ổn định, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, và tăng hiệu quả nuôi trồng thủy sản.

2.1. Đánh giá hiệu quả xử lý môi trường

Chế phẩm vi sinh được thử nghiệm trong bể xi măng 1m3 với mật độ 108 CFU/g. Kết quả cho thấy khả năng kiểm soát tốt hàm lượng ammonia, nitrite, và nitrate khi sử dụng định kỳ 6 ngày/lần. Điều này chứng minh tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm trong quản lý môi trường nuôi trồng.

2.2. Bảo quản chế phẩm vi sinh

Chế phẩm dạng bột được bảo quản ở hai nhiệt độ: 4-8°C và 28-32°C. Kết quả cho thấy bảo quản ở nhiệt độ lạnh giúp duy trì mật độ vi khuẩn cao hơn. Sau 360 ngày, mật độ vi khuẩn giảm nhẹ, nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả sử dụng. Điều này khẳng định tính ổn định và khả năng bảo quản lâu dài của chế phẩm.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Luận án đã đóng góp quan trọng vào lĩnh vực công nghệ sinh học và nuôi trồng thủy sản. Việc phát hiện và ứng dụng các chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ giúp cải thiện chất lượng nước, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, và tăng hiệu quả nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu cũng mở ra hướng phát triển mới trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụ quản lý môi trường nuôi trồng.

3.1. Giá trị khoa học

Nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu khoa học quan trọng về vi khuẩn chuyển hóa nitơ và quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh. Đây là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ nuôi trồng thủy sản.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Chế phẩm vi sinh từ nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, giúp cải thiện chất lượng nước và tăng năng suất nuôi trồng. Điều này góp phần phát triển bền vững ngành thủy sản tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Nghề nuôi tôm hùm lồng bè tại khu vực ven biển miền Trung Việt Nam trong giai đoạn 2010 - 2019 ghi nhận tốc độ tăng trưởng nhanh: số lượng lồng nuôi tăng bình quân 18,2%/năm, thể tích lồng nuôi tăng 16,2%/năm và sản lượng tăng 6,2%/năm. Hai tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa là trung tâm nuôi trọng điểm, chiếm 97,8% tổng số lồng (ước tính đạt 185.166 lồng vào năm 2019) và 95% sản lượng tôm hùm của cả nước (đạt 2.273 tấn). Tuy nhiên, nghề nuôi chủ yếu dựa vào nguồn thức ăn tươi như cá tạp, giáp xác và nhuyễn thể với hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) cao. Theo nghiên cứu của Lại Văn Hùng và Phạm Đức Hùng (2010), FCR của tôm hùm (Panulirus homarus) khi sử dụng cá tạp dao động từ 26,00 ± 1,41 đến 26,60 ± 5,02; để tạo ra 1 kg tôm thương phẩm cần thải ra môi trường khoảng 15 kg chất thải rắn. Lượng chất thải phát sinh trong nuôi lồng công nghiệp chứa trên 45% nitơ và 22% chất hữu cơ khác. Sự tích tụ các hợp chất này gây ra hiện tượng phú dưỡng, làm gia tăng hàm lượng ammonia (TAN), nitrite ($\text{NO}_2^-$) và khí độc ở tầng đáy, đe dọa trực tiếp đến môi trường sinh thái và sự phát triển bền vững của vùng vịnh (Hoàng Thị Mỹ Hương và ctv, 2018). Nhằm thực hiện các định hướng của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn theo Quyết định số 4431/QĐ-BNN-TCTS về kiểm soát môi trường nuôi và quy hoạch phát triển bền vững, việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh xử lý nitơ từ nguồn vi sinh vật bản địa chịu mặn là một yêu cầu cấp thiết.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định là: phần lớn các chế phẩm vi sinh thương mại hiện nay chưa được phân lập trực tiếp từ trầm tích đáy nước mặn vùng nuôi tôm hùm vịnh mở, dẫn đến khả năng thích nghi và hiệu quả chuyển hóa các dạng nitơ độc hại (ammonia, nitrite) trong điều kiện độ mặn cao còn nhiều hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm ở Vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên có khả năng chuyển hóa nitơ (ammonia, nitrite, nitrate) và chịu mặn.
2. Xây dựng môi trường lên men tối ưu để tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng và dạng bột từ các chủng tuyển chọn.
3. Đánh giá hiệu quả xử lý các hợp chất nitơ của chế phẩm vi sinh trong nước nuôi tôm thẻ chân trắng ở quy mô phòng thí nghiệm và mô hình bể xi măng 1 $\text{m}^3$ giai đoạn ương giống postlarvae 5.

Nội dung nghiên cứu:

• Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn và định danh các nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia và nitrite từ bùn ở nền đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài, Phú Yên.
• Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi khuẩn dạng lỏng và chế phẩm vi khuẩn dạng bột từ các chủng đã tuyển chọn.
• Nội dung 3: Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ ở nước nuôi tôm thẻ chân trắng trong phòng thí nghiệm và mô hình ương giống tôm thẻ chân trắng giai đoạn post 5 ở quy mô bể 1 $\text{m}^3$.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonia và nitrite (bao gồm vi khuẩn chi Bacillus, nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia - AOB, nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite - NOB); chế phẩm sinh học dạng lỏng và dạng bột; nước nuôi và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giai đoạn postlarvae 5.
• Phạm vi không gian: Mẫu bùn đáy được thu thập tại 11 lồng nuôi tôm hùm (lồng treo và lồng chìm) tại Vịnh Xuân Đài, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên; các thử nghiệm nuôi cấy, lên men và đánh giá thực nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường) và Trại thực nghiệm Khoa Thủy sản thuộc Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Mẫu bùn thu thập định kỳ 12 tháng từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017; toàn bộ các nội dung nghiên cứu thực nghiệm và đánh giá hoàn thành trong giai đoạn 2016 - 2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa cơ sở lý luận về chu trình chuyển hóa nitơ trong hệ sinh thái biển (Đoàn Bộ, 1997, 1998; Boyd, 1998; Nguyễn Ngọc Tiến và ctv, 2011), bao gồm 5 hợp phần: thực vật nổi (PHY), động vật nổi (ZOO), chất hữu cơ hòa tan (DOM), ammonium (AMO), nitrite (NIT) và nitrate (NAT). Trong thủy vực, chu trình này vận hành qua các khâu chính: quá trình amôn hóa phân giải protein và kitin nhờ vi sinh vật hoại sinh; quá trình nitrite hóa chuyển $\text{NH}_4^+$ thành $\text{NO}_2^-$ do nhóm AOB (Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira...); quá trình nitrate hóa oxy hóa $\text{NO}_2^-$ thành $\text{NO}_3^-$ nhờ nhóm NOB (Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus...); và quá trình phản nitrate hóa khử $\text{NO}_3^-$ về $\text{N}_2$ trong điều kiện yếm khí do các nhóm vi khuẩn như Pseudomonas, Achromobacter, Paracoccus.

Tác giả đã điểm lại các công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản trong nước và quốc tế:

Nghiên cứu trong nước:

• Lại Thúy Hiền (2008) sản xuất chế phẩm Nitrobact 1 và 2 xử lý ô nhiễm nước nuôi tôm tại Thừa Thiên Huế.
• Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) phân lập từ bùn đáy ao tôm sú các chủng Bacillus cereus (B8, B9, B37, B38), Bacillus amyloliquefaciens B41, Bacillus subtilis B67, Nitrosomonas nitrosa (S8, S12), và Nitrobacter winogradskyi (N10, N12).
• Lê Thanh Huyền và ctv (2014) phân lập vi khuẩn oxy hóa ammonium tại Hải Phòng với tốc độ loại bỏ ammonium 18,72 - 25,34 $\text{g/m}^3\text{/ngày}$.
• Trần Đình Vũ Nguyên và ctv (2014) tuyển chọn các chủng Bacillus từ tôm hùm bông có hoạt tính sinh protease và kháng khuẩn Vibrio owensii DY05.
• Phương Thị Hương và Vũ Văn Hạnh (2017) tối ưu hóa môi trường lên men sinh khối Bacillus subtilis BSVN15 đạt $6,33 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$.
• Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv (2020) tuyển chọn chủng vi khuẩn TB7.2 (hiệu suất oxy hóa ammonia 39,02%) và chủng 2.2 (oxy hóa nitrite 27,8%) từ bùn ao nuôi tôm thẻ.
• Cao Ngọc Điệp và ctv (2009, 2012) ứng dụng Pseudomonas stutzeri loại bỏ nitơ trong nước ao cá tra và nước rác thải hữu cơ.
• Hoàng Phương Hà và ctv (2017) tạo chế phẩm vi khuẩn nitrate hóa duy trì hàm lượng TAN dưới 0,1 mg/L tại Thanh Hóa và Sóc Trăng.

Nghiên cứu quốc tế:

• Grommen và ctv (2002, 2004) ứng dụng sản phẩm ABIL chứa Nitrosomonas và Nitrobacter loại bỏ TAN và $\text{NO}_2^-$ trong hệ thống lọc tuần hoàn nước ngọt và nước lợ.
• Meunpol và ctv (2003) sử dụng Bacillus S11 nâng tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú lên 75% so với 18% ở đối chứng.
• Deeseenthum và ctv (2007) và Mujeeb và ctv (2010) chứng minh hiệu quả cải thiện tăng trưởng, tỷ lệ sống và giảm nồng độ ammonia/nitrate của các chủng Bacillus (KKU02, KKU03, NL110) trên ấu trùng tôm càng xanh.
• Zhang và ctv (2011) công bố chủng Pseudomonas stutzeri YZN-001 có khả năng chuyển hóa cả ammonium, nitrite ($275,08\text{ mg/L }\text{NO}_2^-$ sau 24 giờ) và nitrate ($171,4\text{ mg/L }\text{NO}_3^-$ sau 18 giờ).
• Lucy Towers (2014) thử nghiệm men vi sinh Sanolife Bacillus trên tôm hùm Panulirus ornatus tại Vịnh Cam Ranh, ghi nhận khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio và nâng cao chỉ số tăng trưởng.
• Sarmila Muthukrishnan và ctv (2015), Lei Yang và ctv (2016) và Hastuti (2019) nghiên cứu các chủng Acinetobacter junii, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pantoea calida, Pseudomonas stutzeri trong chuyển hóa các dạng nitơ nước thải và nước nuôi thủy sản.

Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết: Kế thừa các công trình đi trước, luận án tập trung giải quyết khoảng trống về nguồn giống vi sinh vật bản địa tại vùng nuôi tôm hùm lồng bè Vịnh Xuân Đài (tỉnh Phú Yên) - nơi có điều kiện độ mặn cao và áp lực ô nhiễm hữu cơ nền đáy đặc thù. Luận án thực hiện phân lập đồng thời ba nhóm vi khuẩn (Bacillus, AOB, NOB), chuẩn hóa quy trình phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tối ưu hóa môi trường lên men bằng mô hình toán học bề mặt đáp ứng và đánh giá khả năng ứng dụng thực tế thông qua việc tạo chế phẩm sinh học dạng bột có mật số cao, phục vụ xử lý nước nuôi trồng thủy sản.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu dựa trên cơ chế sinh hóa của quá trình oxy hóa sinh học các hợp chất chứa nitơ vô cơ trong môi trường nước biển và đặc tính sinh học của các nhóm vi sinh vật:

• Chi Bacillus: Trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt và áp suất thẩm thấu cao, tiết enzyme phân giải hữu cơ (protease, amylase) và chuyển hóa ammonia.
• Chi Pseudomonas: Vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao, hóa dị dưỡng, sở hữu hệ enzyme tham gia vào quá trình phản nitrate hóa và chuyển hóa các hợp chất nitơ trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.
• Chi Rhodococcus: Vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử, có hệ enzyme phong phú phân giải nhiều nguồn carbon và chuyển hóa nitơ.
• Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM): Sử dụng ma trận Plackett - Burman để sàng lọc các biến đầu vào có ảnh hưởng ý nghĩa thống kê và ma trận Box - Behnken (BBD) kết hợp phân tích phương sai (ANOVA) trên hàm đa thức bậc hai để tìm điểm cực trị tối ưu cho môi trường lên men.

Phương pháp nghiên cứu

Mẫu bùn nền đáy lồng tôm hùm (132 mẫu, 12 tháng)

Phương pháp thu thập và phân tích hóa lý mẫu bùn đáy

• Địa điểm và tần suất: Thu mẫu định kỳ 1 tháng/lần trong 12 tháng (từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017) tại 11 lồng nuôi (lồng treo BT và lồng chìm BC) ở Vịnh Xuân Đài. Tổng số thu 132 mẫu bùn.
• Cách thức: Tại mỗi lồng, mẫu bùn được lấy ở 3 vị trí (M1, M2, M3) bằng ống PVC tiệt trùng cồn 70%, bảo quản lạnh ở 4°C và đưa về phòng thí nghiệm xử lý trong vòng 12 - 24 giờ (tuân thủ TCVN 6663-3:2016, TCVN 6663-15:2004).
• Phương pháp phân tích hóa lý: Độ mặn đo bằng khúc xạ kế thang đo 100; pH đo bằng máy đo pH; Ammonia phân tích theo phương pháp trắc quang 4500 $\text{NH}_3\text{ - F}$ (APHA, 2012); Nitrite phân tích theo phương pháp 4500 $\text{NO}_2^-\text{ B}$; Nitrate phân tích theo phương pháp 4500 $\text{NO}_3^-\text{ D}$; Nitơ tổng số phân tích bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 6638:2000.

Phương pháp phân lập, tuyển chọn và định danh vi sinh vật

1. Nhóm Bacillus sp.: Phân lập trên môi trường Tripticase Soya Agar (TSA) có bổ sung NaCl từ 1,5% đến 3,5%, kết hợp xử lý mẫu bùn ở nhiệt độ trên 80°C để loại trừ tế bào sinh dưỡng không sinh bào tử. Tuyển chọn khả năng xử lý ammonia bằng môi trường Ammonium - Calcium - Carbonate agar (ACC) và bộ test kit Sera $\text{NH}_4\text{/NH}_3$. Định danh sinh hóa theo khóa phân loại Bergey (Sharmin và Rahman, 2007).
2. Nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia (AOB): Phân lập trên môi trường lỏng ACC có bổ sung NaCl ở các dải nồng độ 1,5% - 3,5% (Ehrlich, 1975; Lewis và Pramer, 1958; MacDonad và Spokes, 1980). Kiểm tra sự chuyển hóa $\text{NH}_4^+$ thành $\text{NO}_2^-$ bằng thuốc thử Griess - Ilosway; xác định mật độ vi khuẩn theo phương pháp MPN (Most Probable Number) tra bảng MacCrady. Làm thuần giống trên môi trường thạch ACC và kiểm tra độ thuần bằng môi trường TSA bổ sung muối.
3. Nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB): Phân lập trên môi trường chọn lọc chuyên biệt cho vi khuẩn oxy hóa nitrite, xác định hoạt tính chuyển hóa $\text{NO}_2^-$ sang $\text{NO}_3^-$.
4. Định danh sinh hóa bằng kit API: Sử dụng kit API 20E (cho vi khuẩn Gram âm oxidase âm tính), API 20NE (cho vi khuẩn Gram âm oxidase dương tính) và API Coryne (Biomerieux, Pháp).
5. Định danh sinh học phân tử (16S rRNA): Tách chiết ADN bằng kit AccuPrep Genomic ADN extraction (Bioneer, Hàn Quốc). Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F ($5'\text{-AGATTTGATCCTGGCTCAG-}3'$) và 1492R ($5'\text{-GGTTACCTTGTTACGACTT-}3'$) đối với chi Bacillus, hoặc cặp mồi 27F và 515R ($5'\text{-TACCGCGGCTGCTGG CAC-}3'$) đối với nhóm AOB (Schuurman và ctv, 2004). Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,5% (đệm TBE 0,5X, điện thế 100V trong 35 phút), nhuộm Gel Red. Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger tại Công ty Nam Khoa. Xử lý trình tự bằng phần mềm fastPCR, so sánh độ tương đồng bằng BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank. Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA X theo phương pháp Neighbor - Joining với hệ số bootstrap 1000 lần lặp.
6. Khảo sát đặc tính sinh lý: Đánh giá khả năng chịu mặn ở các dải nồng độ NaCl khác nhau và khả năng chuyển hóa $\text{NH}_4^+$, $\text{NO}_2^-$, $\text{NO}_3^-$ của các chủng tuyển chọn.

Phương pháp tạo chế phẩm sinh học và đánh giá thực nghiệm

• Tối ưu hóa môi trường lên men lỏng: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đơn lẻ (nguồn carbon, nguồn nitơ, khoáng, tỷ lệ nạp giống, thời gian, nhiệt độ, pH). Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng chính bằng ma trận Plackett - Burman. Tối ưu hóa nồng độ các thành phần bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) theo ma trận Box - Behnken (BBD) sử dụng phần mềm Design - Expert (DX).
• Sản xuất chế phẩm dạng bột: Khảo sát các điều kiện lên men trên môi trường cơ chất bán rắn (tỷ lệ giống nạp, độ ẩm, thời gian nuôi cấy), sau đó tiến hành sấy khô và nghiền mịn để thu chế phẩm vi sinh dạng bột đạt mật số tiêu chuẩn $10^9\text{ CFU/g}$.
• Thử nghiệm bảo quản: Bảo quản chế phẩm dạng bột ở 2 dải nhiệt độ: nhiệt độ lạnh ($4 - 8^\circ\text{C}$) và nhiệt độ phòng ($28 - 32^\circ\text{C}$) trong thời gian 360 ngày, định kỳ kiểm tra mật số vi sinh vật sống sót.
• Thử nghiệm xử lý môi trường nước nuôi tôm:
  • Quy mô phòng thí nghiệm: Đánh giá tốc độ suy giảm TAN, $\text{NO}_2^-$, $\text{NO}_3^-$ trong nước nuôi tôm thẻ chân trắng (không có tôm).
  • Quy mô bể xi măng 1 $\text{m}^3$: Đánh giá trên mô hình ương giống tôm thẻ chân trắng giai đoạn postlarvae 5. Theo dõi định kỳ hàng ngày và sau các chu kỳ bổ sung chế phẩm các chỉ tiêu: pH, TAN, $\text{NO}_2^-$, $\text{NO}_3^-$, mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí, mật độ Vibrio, mật độ AOB và mật độ NOB.
• Xử lý thống kê: Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng, phân tích ANOVA và kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất $p < 0,05$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày bối cảnh gia tăng quy mô nuôi tôm hùm tại các tỉnh duyên hải miền Trung (đặc biệt là Vịnh Xuân Đài, Phú Yên) và những hệ lụy môi trường do thức ăn tươi gây ra. Tác giả nêu rõ tính cấp thiết của việc tìm kiếm giải pháp sinh học xử lý ô nhiễm nitơ từ nền đáy biển, xác định mục tiêu, đối tượng, phạm vi nghiên cứu, 3 nội dung thực hiện, ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn và tính mới của luận án.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các kiến thức nền tảng và tài liệu liên quan đến đề tài:

• Hiện trạng ngành nuôi tôm hùm lồng bè và nguy cơ ô nhiễm trầm tích đáy do phân tôm, thức ăn dư thừa mang hàm lượng nitơ cao tại Vịnh Xuân Đài.
• Đặc điểm vi sinh vật nước mặn và ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái biển (áp suất, nhiệt độ, độ mặn, dinh dưỡng).
• Cơ chế chu trình nitơ trong môi trường biển và vai trò sinh lý của từng nhóm vi khuẩn tham gia vào các quá trình amôn hóa, nitrite hóa, nitrate hóa và khử nitrate.
• Đặc tính sinh học chi tiết của các chi/loài vi khuẩn: Bacillus (đặc biệt là B. licheniformis), Rhodococcus (R. rhodochrous), Pseudomonas (P. stutzeri), Stenotrophomonas, Nitrosomonas, Nitrobacter, Nitrospira, Providencia stuartii, Alcaligenes faecalis.
• Các yếu tố dinh dưỡng (C, N, khoáng chất, vitamin) và điều kiện vật lý (nhiệt độ, pH, mật độ giống, thời gian) tác động đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn; động học sinh trưởng của vi sinh vật.
• Cơ sở toán học của phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), nguyên lý thiết kế ma trận Plackett - Burman trong sàng lọc yếu tố và ma trận Box - Behnken (BBD) trong tối ưu hóa quy trình.
• Các tiêu chuẩn chất lượng nước trong nuôi tôm thẻ chân trắng, giới hạn nồng độ an toàn của TAN, nitrite và nitrate.
• Tổng hợp các công trình ứng dụng chế phẩm sinh học xử lý môi trường trong nuôi trồng thủy sản trong nước và quốc tế.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết phương pháp luận, địa điểm, thời gian và các bước thực nghiệm của 3 nội dung nghiên cứu:

• Thiết kế sơ đồ tiến trình nghiên cứu tổng quát.
• Quy trình thu thập 132 mẫu bùn tại 11 lồng nuôi ở Vịnh Xuân Đài trong 12 tháng và phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý mẫu bùn (độ mặn, pH, TAN, $\text{NO}_2^-$, $\text{NO}_3^-$, nitơ tổng số).
• Phương pháp phân lập, sàng lọc, định danh sinh hóa (bằng kit API 20E, API 20NE, API Coryne) và sinh học phân tử (tách chiết ADN, phản ứng PCR khuếch đại vùng gen 16S rRNA với các cặp mồi chuyên biệt, giải trình tự Sanger, dựng cây phả hệ bằng MEGA X) cho các nhóm vi khuẩn Bacillus, AOB và NOB.
• Các bước khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nuôi cấy, thiết kế ma trận Plackett - Burman và ma trận Box - Behnken để tối ưu hóa môi trường lỏng trên phần mềm Design - Expert.
• Quy trình lên men bán rắn, sấy nghiền tạo chế phẩm vi sinh dạng bột ($10^9\text{ CFU/g}$) và bố trí theo dõi độ bền sinh học khi bảo quản ở $4 - 8^\circ\text{C}$ và $28 - 32^\circ\text{C}$ trong 360 ngày.
• Thiết kế thí nghiệm đánh giá hiệu quả chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nước ao nuôi tôm quy mô phòng thí nghiệm và trong bể xi măng 1 $\text{m}^3$ ương tôm thẻ chân trắng giai đoạn postlarvae 5; các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xử lý thống kê ANOVA.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được theo 3 nội dung:

• Nội dung 1: Kết quả biến động các chỉ tiêu hóa lý môi trường và mật độ vi sinh vật trong mẫu bùn Vịnh Xuân Đài qua 12 tháng. Kết quả phân lập và định danh 13 chủng vi khuẩn Bacillus sp., các nhóm vi khuẩn AOB và 16 chủng vi khuẩn NOB. Dựa trên khả năng phân giải ammonia, nitrite và khả năng sinh trưởng ở các nồng độ muối khác nhau, nghiên cứu đã chọn lọc được 3 chủng có hoạt tính cao nhất gồm: Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 và Rhodococcus rhodochrous T9.
• Nội dung 2: Kết quả sàng lọc và tối ưu hóa thành phần môi trường lên men lỏng cho 3 chủng bằng mô hình Box - Behnken. Tác giả công bố các phương trình hồi quy đa thức bậc hai, đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn tương tác giữa các yếu tố dinh dưỡng và kết quả kiểm định ANOVA. Kết quả xác lập thành phần môi trường và mật độ tế bào cực đại:
  • Bacillus licheniformis B85 đạt mật số $3,14 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ với môi trường gồm 3,94 g/L mật rỉ đường, 15,56 g/L cao nấm men và 1,13 g/L NaCl.
  • Pseudomonas stutzeri KL15 đạt mật số $2,37 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ với môi trường gồm 4,95 g/L mật rỉ đường, 19,08 g/L cao nấm men và 1,13 g/L $\text{MgSO}_4$.
  • Rhodococcus rhodochrous T9 đạt mật số $2,52 \times 10^{10}\text{ CFU/mL}$ với môi trường gồm 7,93 g/L glucose, 6,1 g/L pepton và 2,95 g/L NaCl.
  • Kết quả lên men bán rắn, sấy nghiền tạo chế phẩm bột đạt $10^9\text{ CFU/g}$. Sau 360 ngày bảo quản: ở $4 - 8^\circ\text{C}$, mật số B. licheniformis B85 giảm còn $10^7\text{ CFU/g}$, R. rhodochrous T9 giảm còn $10^6\text{ CFU/g}$; ở $28 - 32^\circ\text{C}$, chủng sinh bào tử B. licheniformis B85 giảm còn $10^6\text{ CFU/g}$, trong khi P. stutzeri KL15 và R. rhodochrous T9 giảm còn $10^5\text{ CFU/g}$.
• Nội dung 3: Kết quả thử nghiệm xử lý nitơ trong nước nuôi tôm ở quy mô phòng thí nghiệm và bể xi măng 1 $\text{m}^3$ ương giống tôm thẻ chân trắng post 5. Nghiệm thức sử dụng chế phẩm vi sinh với tỷ lệ 0,5% (mật độ $10^8\text{ CFU/g}$), bổ sung định kỳ 6 ngày/lần đã kiểm soát tốt các chỉ tiêu TAN, $\text{NO}_2^-$ và $\text{NO}_3^-$, duy trì môi trường nước ổn định, tăng mật độ vi khuẩn có lợi và hạn chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio.

Kết luận và đề nghị

Tác giả đúc kết các kết quả đạt được về phân lập chủng giống, xây dựng công thức môi trường lên men tối ưu, công nghệ sản xuất và bảo quản chế phẩm dạng bột, cũng như hiệu quả làm sạch môi trường nước ương tôm; đồng thời đưa ra các đề xuất triển khai ứng dụng thực tế.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về lý luận và khoa học

• Phân lập và bổ sung vào ngân hàng dữ liệu vi sinh vật bản địa vùng biển Việt Nam ba chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ hiệu quả cao từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài (Phú Yên): Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 và Rhodococcus rhodochrous T9.
• Xây dựng quy trình phân lập, tuyển chọn và định danh đồng bộ các nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia, nitrite và vi khuẩn Bacillus từ môi trường trầm tích nước mặn bằng phương pháp sinh hóa kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự vùng gen 16S rRNA.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu động học sinh trưởng và các phương trình toán học mô tả ảnh hưởng tương tác giữa các nguồn dinh dưỡng (carbon, nitơ, khoáng) đến khả năng tích lũy sinh khối của các chủng vi khuẩn thông qua mô hình bề mặt đáp ứng Box - Behnken.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Xác định được công thức môi trường lên men dạng lỏng tối ưu từ các nguồn nguyên liệu dễ tiếp cận, chi phí thấp (mật rỉ đường, cao nấm men, glucose, pepton, muối khoáng), cho phép thu nhận sinh khối vi khuẩn ở mật độ rất cao:

Chủng vi khuẩn	Thành phần môi trường lên men tối ưu	Mật số sinh khối tối ưu
Bacillus licheniformis B85	3,94 g/L mật rỉ đường + 15,56 g/L cao nấm men + 1,13 g/L NaCl	$3,14 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$
Pseudomonas stutzeri KL15	4,95 g/L mật rỉ đường + 19,08 g/L cao nấm men + 1,13 g/L $\text{MgSO}_4$	$2,37 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$
Rhodococcus rhodochrous T9	7,93 g/L glucose + 6,1 g/L pepton + 2,95 g/L NaCl	$2,52 \times 10^{10}\text{ CFU/mL}$

• Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh dạng bột trên cơ chất bán rắn đạt mật số ban đầu $10^9\text{ CFU/g}$.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về độ ổn định và thời hạn bảo quản chế phẩm bột: bảo quản ở nhiệt độ lạnh $4 - 8^\circ\text{C}$ giúp duy trì mật độ vi khuẩn tốt hơn so với nhiệt độ phòng $28 - 32^\circ\text{C}$ sau 360 ngày (nhóm sinh bào tử B. licheniformis B85 giữ mật số $10^6 - 10^7\text{ CFU/g}$; nhóm không sinh bào tử P. stutzeri KL15 và R. rhodochrous T9 giữ mật số $10^5 - 10^6\text{ CFU/g}$).
• Xác lập phác đồ ứng dụng chế phẩm xử lý nước trong hệ thống ương giống tôm thẻ chân trắng giai đoạn postlarvae 5: sử dụng chế phẩm với tỷ lệ 0,5% ở mật độ $10^8\text{ CFU/g}$, định kỳ 6 ngày/lần giúp kiểm soát tốt các thông số TAN, $\text{NO}_2^-$ và $\text{NO}_3^-$.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm sinh học xử lý nitơ trong luận án mới chỉ được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô mô hình bể xi măng 1 $\text{m}^3$ đối với tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống postlarvae 5 trong điều kiện có kiểm soát; chưa được khảo nghiệm trực tiếp ngoài hiện trường các lồng bè nuôi tôm hùm thương phẩm trên biển tại Vịnh Xuân Đài hoặc các ao nuôi thương phẩm quy mô lớn.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng khảo nghiệm hiệu quả xử lý môi trường của chế phẩm vi sinh ở quy mô ao nuôi thương phẩm và lồng bè nuôi tôm hùm ngoài tự nhiên.
  • Nghiên cứu các chất mang, chất bảo vệ sinh học hoặc kỹ thuật vi bao nhằm nâng cao tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn không sinh bào tử (P. stutzeri, R. rhodochrous) trong chế phẩm dạng bột khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.
  • Tiếp tục hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ở quy mô pilot và công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình phân lập, tuyển chọn vi khuẩn chịu mặn từ môi trường biển; phương pháp kết hợp giữa sinh hóa (kit API 20E, 20NE, Coryne) và sinh học phân tử (giải trình tự 16S rRNA, phân tích phylogenetic trên MEGA X); phương pháp tối ưu hóa môi trường lên men bằng mô hình bề mặt đáp ứng Plackett - Burman và Box - Behnken.
• Đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học: Luận án cung cấp các thông số công nghệ rõ ràng về thành phần dinh dưỡng rẻ tiền, điều kiện nuôi cấy bán rắn, kỹ thuật sấy nghiền tạo bột và các số liệu theo dõi độ bền bảo quản thực tế trong 360 ngày.
• Đối với cán bộ quản lý môi trường và kỹ sư nuôi trồng thủy sản: Cung cấp giải pháp kỹ thuật cụ thể về liều lượng và chu kỳ sử dụng chế phẩm vi sinh nhằm kiểm soát nồng độ các khí độc nitơ (ammonia, nitrite) trong quá trình ương nuôi giống thủy sản nước mặn và nước lợ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Ba chủng vi khuẩn tối ưu được tuyển chọn trong luận án là những chủng nào và có nguồn gốc từ đâu?
Ba chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bùn thu thập tại nền đáy dưới các lồng bè nuôi tôm hùm ở Vịnh Xuân Đài (thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên) và được tuyển chọn dựa trên hoạt tính chuyển hóa nitơ và khả năng chịu mặn, bao gồm: Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 và Rhodococcus rhodochrous T9.

2. Thành phần môi trường lỏng tối ưu hóa bằng mô hình Box - Behnken của 3 chủng vi khuẩn cho mật độ tế bào đạt bao nhiêu?

• Chủng Bacillus licheniformis B85 đạt mật số $3,14 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ (thành phần: 3,94 g/L mật rỉ đường, 15,56 g/L cao nấm men, 1,13 g/L NaCl).
• Chủng Pseudomonas stutzeri KL15 đạt mật số $2,37 \times 10^{11}\text{ CFU/mL}$ (thành phần: 4,95 g/L mật rỉ đường, 19,08 g/L cao nấm men, 1,13 g/L $\text{MgSO}_4$).
• Chủng Rhodococcus rhodochrous T9 đạt mật số $2,52 \times 10^{10}\text{ CFU/mL}$ (thành phần: 7,93 g/L glucose, 6,1 g/L pepton, 2,95 g/L NaCl).

3. Mật độ vi khuẩn trong chế phẩm dạng bột biến động như thế nào sau 360 ngày bảo quản?
Chế phẩm bột có mật số ban đầu là $10^9\text{ CFU/g}$. Sau 360 ngày:

• Ở nhiệt độ lạnh ($4 - 8^\circ\text{C}$): B. licheniformis B85 giảm còn $10^7\text{ CFU/g}$; R. rhodochrous T9 và P. stutzeri KL15 giảm còn $10^6\text{ CFU/g}$.
• Ở nhiệt độ phòng ($28 - 32^\circ\text{C}$): Chủng sinh bào tử B. licheniformis B85 giảm còn $10^6\text{ CFU/g}$; hai chủng không sinh bào tử P. stutzeri KL15 và R. rhodochrous T9 giảm còn $10^5\text{ CFU/g}$.

4. Phác đồ sử dụng chế phẩm vi sinh trong mô hình ương giống tôm thẻ chân trắng giai đoạn post 5 được khuyến nghị như thế nào?
Trong mô hình bể xi măng 1 $\text{m}^3$ ương tôm thẻ chân trắng giai đoạn postlarvae 5, chế phẩm vi sinh được sử dụng với tỷ lệ 0,5% ở mật độ $10^8\text{ CFU/g}$, bổ sung định kỳ 6 ngày/lần giúp kiểm soát hiệu quả hàm lượng TAN, $\text{NO}_2^-$ và $\text{NO}_3^-$.

5. Các phương pháp nào đã được sử dụng để định danh các chủng vi khuẩn trong luận án?
Nghiên cứu kết hợp kiểm tra đặc điểm hình thái tế bào, quan sát khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa bằng các bộ kit API 20E, API 20NE, API Coryne, và phương pháp sinh học phân tử: tách chiết ADN, khuếch đại vùng gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR với các cặp mồi 27F/1492R và 27F/515R, giải trình tự Sanger, so sánh BLAST trên NCBI và dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA X.

---

Kết luận

Luận án đã phân lập, tuyển chọn và định danh thành công ba chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng chuyển hóa nitơ cao từ nền đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài gồm Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 và Rhodococcus rhodochrous T9. Bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Box - Behnken, nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công môi trường lên men lỏng thu sinh khối cao ($10^{10} - 10^{11}\text{ CFU/mL}$) và sản xuất chế phẩm vi sinh dạng bột ($10^9\text{ CFU/g}$) có khả năng bảo quản ổn định trong 360 ngày. Thử nghiệm thực tế trên mô hình bể xi măng 1 $\text{m}^3$ ương giống tôm thẻ chân trắng giai đoạn post 5 đã chứng minh hiệu quả kiểm soát tốt hàm lượng TAN, nitrite và nitrate khi sử dụng chế phẩm định kỳ 6 ngày/lần, tạo cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc cho việc ứng dụng vi sinh vật bản địa phục vụ nuôi trồng thủy sản bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan tình hình nuôi tôm hùm lồng bè Theo nguồn cung cấp của FAO (2014) lượng tôm hùm của các nước như Philippine, Indosesia, Australia liên tục tăng trưởng trong vòng 10 năm liên tục từ 2004-2014, từ vài chục tấn tăng lên gần 1000 tấn/năm. Hầu hết nghiên cứu về nuôi tôm hùm được thực hiện ở Nhật Bản, Úc, Mỹ, New Zealand, Mexico, Nam Phi, Ấn Độ và Việt Nam. Nguồn giống tôm hùm thả nuôi có thể từ khai thác tự nhiên hoặc nhân tạo.

Do giai đoạn biến thái của ấu trùng tôm hùm quá dài, nên quá trình sản xuất giống tương đối phức tạp, chi phí cao; vì vậy nguồn giống (giai đoạn ấu trùng puerulus và tôm con nhỏ) do khai thác tự nhiên vẫn chiếm ưu thế (Võ Văn Nha, 2006; Phillips và Matsuda, 2011). Nuôi tôm hùm gai đã được nhiều nước quan tâm, nhưng chỉ có vài nước nuôi thương phẩm thành công. Trong khu vực Đông Nam Á, nuôi thương phẩm tôm hùm gai chủ yếu tập trung vào 7 loài: tôm hùm bông P. ornatus, tôm hùm đá P.

homarus, tôm hùm sen P. versicolor, tôm hùm đỏ P. longipes, tôm hùm ma P.penicillatus, tôm hùm sỏi P. stimpsoni và tôm hùm tre P.

Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm hùm gai phát triển đáng kể, phần lớn dựa vào nguồn giống tự nhiên. Nghề khai thác tôm hùm có sản lượng dưới 100 tấn mỗi năm (Thuy và Ngoc, 2004), chủ yếu từ nghề lặn và cung cấp cho thị trường nội địa. Tỉnh Phú Yên có hàng loạt vũng vịnh kín, hoặc nửa kín có mũi đá, đảo che chắn các tác động sóng và nước đủ sâu nên rất phù hợp cho nuôi tôm hùm (đầm Cù Mông, Vịnh Xuân Đài, Vũng Rô) (Tống Phước Hoàng Sơn, 2015). Theo kết quả báo cáo của Tổng cục thủy sản (2015), sản lượng tôm hùm dao động từ 20 tấn (Bình Định) với 500 lồng, 450 tấn (Phú Yên) đến 650 tấn (Khánh Hòa).

Thị xã Sông Cầu có khoảng 1.000 ha diện tích mặt biển được sử dụng để nuôi tôm hùm, sản lượng tôm hùm thương phẩm vào khoảng 400-500 tấn/năm, chiếm gần 70% sản lượng của toàn tỉnh (Tổng cục thủy sản, 2015). Nghề nuôi tôm hùm ở Vịnh Xuân Đài có 3 hình thức là nuôi trong lồng treo, lồng chìm và kết hợp cả hai hình thức (Hoàng Thị Mỹ Hương 6 và ctv, 2018). Hiện trạng ô nhiễm môi trường nước vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài Vịnh Xuân Đài thuộc thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên có diện tích mặt nước hơn 13. Đây là vùng chứa đựng hệ sinh thái đa dạng, phong phú và là vùng nước lý tưởng phát triển nghề nuôi tôm hùm bằng lồng, bè với sản lượng hàng năm vài trăm tấn.

Tuy nhiên, trong những năm gần đây, tình trạng phát triển quá nhanh diện tích nuôi trồng thuỷ sản trên vịnh kết hợp với các hoạt động sản xuất và đời sống của con người đã gây sức ép lên môi trường vịnh Xuân Đài. Chất thải từ lồng, bè nuôi trồng thủy sản thải ra, đổ vào Vịnh. Lượng chất thải này tích tụ qua nhiều năm tháng sẽ ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước nơi đây. Các hoạt động khai thác và đánh bắt thủy sản trên Vịnh cũng gây ô nhiễm và suy thoái môi trường.

Số tàu thuyền hiện có trên Vịnh khi hoạt động thường xuyên sẽ thải ra một lượng chất thải đáng kể như váng dầu, mỡ từ động cơ. Một số hoạt động khai thác trái phép như khai thác san hô, sử dụng phương tiện khai thác hủy diệt hàng loạt, gây nguy cơ ô nhiễm biển, ô nhiễm vùng nuôi và giảm đa dạng sinh học (Bùi Hồng Long, 2001).