Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu khoa học được thực hiện trong khuôn khổ luận án Tiến sĩ Hóa học, chuyên ngành Hóa lý thuyết và Hóa lý (Mã số: 62.19), hoàn thành tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Thái Hòa và TS. Nguyễn Quốc Hiến.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Vàng nano là vật liệu kích thước nanomet nhận được sự quan tâm nghiên cứu lớn nhờ các tính chất quang học, đặc biệt là hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance - SPR) cùng các khả năng ứng dụng trong xúc tác, điện hóa, cảm biến sinh học, khuếch đại tán xạ Raman bề mặt (SERS) và y học.

Trong thực tiễn chế tạo vật liệu, các phương pháp tổng hợp vàng nano dạng cầu truyền thống thường sử dụng các chất khử hóa học như $\text{NaBH}_4$ hoặc natri citrate. Nhược điểm chính của tác nhân này là tính độc hại đối với môi trường và sức khỏe sinh học, đòi hỏi sự phát triển của các "phương pháp xanh" (green methods) sử dụng các hợp chất polymer sinh học có nguồn gốc tự nhiên. Đối với vàng nano dạng thanh, phương pháp phát triển mầm được đánh giá là tối ưu để kiểm soát độ đơn phân tán và tỷ lệ dài/ngang (tỷ lệ cạnh), song quy trình này phụ thuộc chặt chẽ vào các thông số công nghệ cần được khảo sát có hệ thống.

Về mặt ứng dụng phân tích và y sinh:

  1. Nhiễm bẩn melamine trong sữa và thực phẩm là vấn đề ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Các kỹ thuật phân tích tiêu chuẩn như sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp miễn dịch gắn enzym (ELISA) có độ chính xác cao nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền, quy trình vận hành phức tạp và thời gian phân tích kéo dài. Việc sử dụng hạt vàng nano để phân tích so màu melamine mở ra hướng tiếp cận nhanh và chi phí thấp nhưng chưa được hoàn thiện đầy đủ.
  2. Phương pháp phân tích điện hóa von-ampe hòa tan truyền thống sử dụng điện cực giọt thủy ngân có độ nhạy cao nhưng bộc lộ hạn chế lớn về độc tính và hiện tượng tắc mao quản. Nhu cầu biến tính bề mặt điện cực rắn (như điện cực than thủy tinh - GCE) bằng các vật liệu nano kim loại và màng chức năng hóa nhằm phục vụ xác định axit uric trong các dịch sinh học (huyết thanh, nước tiểu) nhằm hỗ trợ chẩn đoán các bệnh lý như gout là rất cấp thiết.
  3. Tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng gia tăng đặt ra yêu cầu đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm của các dạng hình thái vàng nano khác nhau.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu chế tạo và khảo sát ứng dụng của vàng nano trước đó chưa mang tính hệ thống toàn diện về các yếu tố ảnh hưởng động học và cấu trúc. Do đó, đề tài "Nghiên cứu chế tạo vàng nano và một số ứng dụng" được thực hiện nhằm giải quyết các khoảng trống kỹ thuật và thực nghiệm này.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là: Tổng hợp vật liệu vàng nano dạng cầu, dạng thanh và khảo sát một số ứng dụng thực tiễn của các vật liệu này.

Các nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

  1. Nghiên cứu tổng hợp vàng nano dạng cầu (Gold Nanospheres - GNP) bằng phương pháp khử sử dụng chitosan tan trong nước (Water-Soluble Chitosan - WSC) đóng vai trò đồng thời là chất khử và chất ổn định.
  2. Nghiên cứu tổng hợp vàng nano dạng thanh (Gold Nanorods - GNR) bằng phương pháp phát triển mầm có sử dụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) làm chất hoạt động bề mặt và định hướng cấu trúc.
  3. Nghiên cứu ứng dụng hạt vàng nano dạng cầu để xác định định tính và định lượng melamine trong mẫu sữa thương phẩm.
  4. Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính vàng nano (GCE/L-cys/GNP) để phân tích hàm lượng axit uric trong mẫu nước tiểu và huyết thanh bằng phương pháp von-ampe hòa tan.
  5. Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của vàng nano dạng cầu và vàng nano dạng thanh đối với các chủng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Hệ vật liệu hạt vàng nano dạng cầu (GNP) và hạt vàng nano dạng thanh (GNR).
    • Tác nhân polymer sinh học chitosan tan trong nước (WSC) biến tính qua phản ứng N-acetyl hóa và cắt mạch bằng $\text{H}_2\text{O}_2$.
    • Hợp chất melamine trong các mẫu sữa tươi/sữa dinh dưỡng thương phẩm.
    • Axit uric trong các đối tượng mẫu sinh học (nước tiểu và huyết thanh người).
    • Bốn chủng vi khuẩn kiểm nghiệm: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Toàn bộ các quy trình chế tạo, khảo sát đặc trưng hóa lý, phân tích trắc quang, đo đạc điện hóa và thử nghiệm vi sinh được thực hiện tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế và các phòng thí nghiệm chuyên ngành liên kết; công trình bảo vệ năm 2015.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm luận

Luận án đã tổng quan các hướng nghiên cứu chính trong và ngoài nước liên quan đến công nghệ nano vàng và các ứng dụng phân tích:

  • Các phương pháp chế tạo vàng nano: Tác giả hệ thống hóa các nhóm phương pháp chính bao gồm phương pháp chiếu xạ ([1], [23], [65], [66]), phương pháp khử hóa học truyền thống ([4], [12], [43]), phương pháp khử sinh học ([13], [43]), phương pháp điện hóa ([63], [122]), phương pháp quang hóa ([70]) và phương pháp phát triển mầm ([10], [17], [40], [115], [127]). Trong đó, các quy trình tổng hợp "xanh" thân thiện môi trường sử dụng dịch chiết thực vật hoặc dẫn xuất polysacarit ([13], [37], [80], [92]) được ghi nhận là xu hướng giảm thiểu việc sử dụng $\text{NaBH}_4$ và natri citrate. Đối với cấu trúc dạng thanh, phương pháp phát triển mầm ([70], [93], [96]) được xác định là giải pháp kiểm soát hiệu quả tỷ lệ cạnh (aspect ratio - AR).
  • Ứng dụng hạt nano trong phát hiện melamine: Các công trình phân tích chuẩn độ melamine dựa trên GC/MS ([41]), LC/MS ([41], [95]), HPLC ([85]) và ELISA ([49], [95]) được so sánh với phương pháp so màu quang học dựa trên sự thay đổi dải hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt của vàng nano khi xảy ra tương tác cảm ứng tập hợp hạt ([32], [33], [36]).
  • Ứng dụng biến tính điện cực trong phân tích điện hóa: Các công trình nghiên cứu sử dụng vàng nano biến tính bề mặt điện cực làm việc rắn nhằm thay thế điện cực giọt thủy ngân trong xác định ion kim loại và các phân tử sinh học ([45], [62], [98]), đặc biệt là phân tích axit uric nhằm phục vụ chẩn đoán y khoa.
  • Hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano kim loại: Các nghiên cứu trước đây về việc tổng hợp vàng nano từ dịch chiết quả nho, hoa hướng dương, trà và khảo sát tác động ức chế vi sinh vật ([11], [13], [24], [52], [55]).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các hướng nghiên cứu trên đã đạt được nhiều kết quả, luận án chỉ ra các hạn chế cụ thể:

  1. Thiếu các nghiên cứu mang tính hệ thống tại Việt Nam về quy luật động học và các yếu tố công nghệ chi phối quá trình tổng hợp vàng nano dạng cầu và dạng thanh.
  2. Chưa có công trình công bố việc sử dụng chitosan tan trong nước (WSC) đóng vai trò kép: vừa là chất khử cation $\text{Au}^{3+}$, vừa là chất bọc ổn định bề mặt hạt GNP để tạo ra hệ keo vàng có kích thước nhỏ, phân bố đồng đều và bền vững theo thời gian.
  3. Việc tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm để định lượng melamine trong nền mẫu sữa thực tế, cấu trúc hóa màng lai phân tử L-cysteine/vàng nano trên điện cực than thủy tinh (GCE/L-cys/GNP) nhằm xác định axit uric với giới hạn phát hiện thấp, cũng như đánh giá so sánh định lượng hoạt tính kháng khuẩn giữa hai dạng hình thái GNP và GNR đối với các chủng vi khuẩn thực phẩm chưa được làm sáng tỏ một cách toàn diện.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và nguyên lý phân tích

  • Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR): Sự dao động tập thể của các electron tự do trên bề mặt hạt nano kim loại khi tương tác với ánh sáng kích thích. Đối với vàng nano dạng cầu, phổ hấp thụ chỉ xuất hiện một dải cộng hưởng plasmon bề mặt duy nhất tại vùng bước sóng xấp xỉ 520 nm. Đối với vàng nano dạng thanh, xuất hiện hai dải cộng hưởng plasmon bề mặt: dao động plasmon bề mặt ngang (Transverse SPR - TSPR) tại vùng ánh sáng nhìn thấy (~520 nm) và dao động plasmon bề mặt dọc (Longitudinal SPR - LSPR) dịch chuyển về vùng bước sóng dài hơn (vùng cận hồng ngoại).
  • Cơ chế khử và ổn định hạt nano bởi WSC: Các nhóm chức hydroxyl (-OH) và amino (-$\text{NH}_2$) tự do trên mạch phân tử chitosan tan trong nước thực hiện quá trình khử ion $\text{Au}^{3+}$ thành $\text{Au}^0$, đồng thời chuỗi polymer bao bọc xung quanh mầm tinh thể ngăn chặn hiện tượng tập hợp và sa lắng hạt thông qua hiệu ứng cản trở không gian và tương tác tĩnh điện.
  • Cơ chế định hướng bất đẳng hướng của GNR: Phản ứng phát triển hạt mầm vàng hình cầu (tạo ra từ phản ứng khử nhanh bởi $\text{NaBH}_4$) thành dạng que dưới tác dụng định hướng cấu trúc của chất hoạt động bề mặt cation CTAB và sự hỗ trợ của ion $\text{Ag}^+$ cùng chất khử yếu axit ascorbic (AA).
  • Nguyên lý đo màu xác định melamine: Dựa trên tương tác tĩnh điện và liên kết hydro giữa phân tử melamine (chứa 3 nhóm -$\text{NH}2$ tích điện dương trong điều kiện phù hợp) với các hạt vàng nano tích điện âm bề mặt. Hiện tượng này làm mất độ bền keo, kéo theo sự tập hợp hạt (aggregation), làm dung dịch chuyển màu từ đỏ tía sang tím/xanh tối và xuất hiện dải hấp thụ mới tại bước sóng khoảng 650 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ quang $A{650}/A_{520}$ tỷ lệ tuyến tính với nồng độ melamine.
  • Nguyên lý von-ampe hòa tan anot xung vi phân (DP-ASV): Quá trình làm giàu chất phân tích (axit uric) lên bề mặt điện cực than thủy tinh biến tính màng L-cysteine và vàng nano (GCE/L-cys/GNP) ở thế điện phân thích hợp, sau đó quét thế về phía dương để hòa tan chất phân tích, ghi nhận dòng oxy hóa anot ($I_p$) đặc trưng cho nồng độ axit uric.

Phương pháp và kỹ thuật phân tích thực nghiệm

Luận án tích hợp các phương pháp phân tích cấu trúc vật lý và hóa lý thực nghiệm:

  • Phương pháp quang phổ: Phổ hấp thụ phân tử tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) và phổ phản xạ khuếch tán (UV-Vis/DR) dùng để khảo sát đặc trưng quang học và dải SPR.
  • Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD): Xác định cấu trúc mạng tinh thể và pha của vật liệu vàng nano.
  • Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Quan sát hình thái học, xác định hình dạng hình học và phân bố kích thước hạt.
  • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Khảo sát các liên kết hóa học và nhóm chức của chitosan, WSC và các màng biến tính bề mặt.
  • Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX): Xác định thành phần nguyên tố hóa học của hạt nano.
  • Phương pháp đo độ nhớt mao quản: Đánh giá khối lượng phân tử và độ deacetyl hóa của polymer chitosan.
  • Kỹ thuật điện hóa: Phương pháp von-ampe hòa tan anot xung vi phân (DP-ASV) và phương pháp von-ampe vòng (CV) sử dụng hệ đo ba điện cực để đánh giá đặc tính điện hóa bề mặt và cơ chế chuyển điện tử.
  • Phương pháp vi sinh: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thông qua xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường nuôi cấy lỏng Brain Heart Infusion (BHI), sử dụng chất chỉ thị chuyển màu oxy hóa khử Alamar Blue và đối chứng với kháng sinh Kanamycin.

Nguồn tư liệu và mẫu vật thực nghiệm

  • Hóa chất tinh khiết: Axit chloroauric ($\text{HAuCl}_4$), chitosan, hydrogen peroxide ($\text{H}_2\text{O}_2$), acetic anhydride, CTAB, bạc nitrat ($\text{AgNO}_3$), axit ascorbic, natri borohydride ($\text{NaBH}_4$), L-cysteine, melamine, axit uric, thuốc thử Alamar Blue, kháng sinh Kanamycin.
  • Nền mẫu phân tích thực tế:
    • 07 mẫu sữa thương phẩm thu thập trên thị trường để thử nghiệm xác định melamine và đối chứng với phương pháp HPLC.
    • 05 mẫu nước tiểu người (ký hiệu từ NT1 đến NT5) và 05 mẫu huyết thanh người (ký hiệu từ HT1 đến HT5) từ các đối tượng nam và nữ có độ tuổi từ 22 đến 51 tuổi nhằm xác định hàm lượng axit uric.
    • Bốn chủng vi sinh vật chuẩn gây nhiễm độc thực phẩm: E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes, S. aureus.

Nội dung chính theo từng chương

Chế tạo chitosan tan trong nước và tổng hợp vàng nano dạng cầu bằng phương pháp khử sử dụng WSC

Quy trình chế chế tạo chất khử/ổn định polymer sinh học được thực hiện qua hai giai đoạn: phản ứng N-acetyl hóa chitosan và phản ứng cắt mạch bằng $\text{H}_2\text{O}_2$. Khảo sát thực nghiệm xác lập điều kiện tối ưu để thu được chitosan tan trong nước (WSC) có độ đeacetyl hóa (ĐĐA) khoảng 50%:

  • Thời gian phản ứng N-acetyl hóa: 2 giờ.
  • Thời gian phản ứng cắt mạch với $\text{H}_2\text{O}_2$: 3 giờ.

Trong quá trình tổng hợp vàng nano dạng cầu (GNP), các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình hình thành hạt được khảo sát chi tiết:

  • Thời gian phản ứng: Khảo sát phổ UV-Vis cho thấy độ hấp thụ cực đại tăng nhanh trong giai đoạn đầu, chậm dần sau 8 giờ và đạt trạng thái bão hòa sau 31 giờ. Ảnh TEM chứng minh ở thời điểm 31 giờ hạt có kích thước lớn hơn và kém đồng đều hơn so với thời điểm 8 giờ; do đó thời gian khử 8 giờ được lựa chọn.
  • Nhiệt độ khử: Khảo sát ở các mức nhiệt độ 65°C, 75°C, 85°C và 95°C cho thấy sản phẩm tạo thành tại 85°C có độ bền keo và độ ổn định quang học tối ưu nhất.
  • Nồng độ các tác nhân: Khi tăng nồng độ $\text{Au}^{3+}$, kích thước hạt có xu hướng tăng nhưng độ đồng đều giảm. Ngược lại, khi tăng nồng độ WSC, kích thước hạt nano thu được giảm dần.
  • Khối lượng phân tử của WSC: Khối lượng phân tử WSC thấp làm giảm độ bền ổn định của dung dịch keo GNP.

Vật liệu GNP chế tạo ở điều kiện tối ưu (WSC 0,5%; $\text{Au}^{3+}$ 0,5 mM; nhiệt độ 85°C; thời gian 8 giờ) có hình thái dạng cầu đồng đều, đường kính hạt trung bình khoảng 8 nm (nằm trong dải 8–15 nm), cấu trúc mạng tinh thể lập phương tâm mặt (fcc). Nghiên cứu động học phản ứng theo phương pháp nồng độ đầu thiết lập phương trình tốc độ phản ứng khử có dạng tổng quát: $r = k[\text{Au}^{3+}]^a[\text{WSC}]^b$.

Nhằm kéo dài độ bền bảo quản, bổ sung thêm WSC nồng độ 0,3% vào dung dịch sau phản ứng giúp hệ keo duy trì tính ổn định không bị sa lắng trong thời gian lưu trữ 6 tháng. Ngoài ra, khi áp dụng phương pháp phát triển mầm từ hạt GNP ban đầu với tỷ lệ $[\text{Au}^{3+}]/[\text{Au}^0] = 8$, kích thước hạt tăng lên hơn gấp đôi, đạt khoảng 24 đến 35 nm.

Tổng hợp vàng nano dạng thanh bằng phương pháp phát triển mầm

Quy trình chế tạo vàng nano dạng thanh (GNR) được tiến hành qua hai giai đoạn riêng biệt: (1) giai đoạn tạo mầm vàng kích thước nhỏ bằng phản ứng khử nhanh $\text{HAuCl}_4$ bằng $\text{NaBH}_4$, và (2) giai đoạn phát triển mầm dị hướng có sự định hướng cấu trúc của chất hoạt động bề mặt cation CTAB và ion $\text{Ag}^+$.

Các thông số công nghệ chi phối tỷ lệ cạnh (Aspect Ratio - AR = chiều dài/chiều ngang) của GNR bao gồm:

  • Tỷ lệ mol $[\text{Ag}^+]/[\text{Au}^{3+}]$: Khi không có mặt $\text{Ag}^+$, sản phẩm chỉ xuất hiện một dao động TSPR và chỉ tạo ra lượng nhỏ thanh có AR rất lớn (~15). Khi bổ sung $\text{Ag}^+$, hệ xuất hiện đồng thời hai dải cộng hưởng TSPR và LSPR. Tỷ lệ mol $[\text{Ag}^+]/[\text{Au}^{3+}] = 0,2$ cho hiệu suất tổng hợp cao nhất và hình thái thanh đồng đều.
  • Tỷ lệ mol $[\text{AA}]/[\text{Au}^{3+}]$ (Axit ascorbic/Au): Khi tăng tỷ lệ này, tỷ lệ cạnh AR giảm xuống. Khi tỷ lệ đạt mức 2,5, hạt chuyển từ dạng thanh sang dạng hình khúc xương (dogbone). Tỷ lệ tối ưu được chọn là 1,0 (trong điều kiện tổng quát đạt 1,5).
  • Nồng độ $\text{Au}^{3+}$ và CTAB: Tỷ lệ cạnh đạt cực đại khi nồng độ $\text{Au}^{3+}$ là 10 mM và nồng độ CTAB là 0,1 M (ở nồng độ CTAB thấp 0,01 M không tạo được dạng thanh).
  • Giá trị pH phản ứng: Khảo sát trong dải pH từ 1,0 đến 2,8 cho thấy sản phẩm đều có dạng thanh và đạt tỷ lệ cạnh cực đại tại pH = 1,7 (kết luận tổng hợp ghi nhận vùng pH 1,5–1,7).

Sản phẩm GNR thu được có độ đơn phân tán cao, kích thước trung bình đạt khoảng $15\text{ nm} \times 76\text{ nm}$, hệ số cạnh AR $\approx 5$, mạng tinh thể lập phương tâm mặt.

Ứng dụng vàng nano dạng cầu để xác định hàm lượng melamine trong sữa

Dung dịch GNP đơn phân tán có dải hấp thụ cực đại duy nhất tại bước sóng 520 nm (màu đỏ tía). Khi đưa melamine vào hệ keo, các phân tử melamine mang các nhóm $-\text{NH}_2$ tích điện dương tương tác tĩnh điện với bề mặt GNP (được làm âm bề mặt bởi tripolyphotphat - TPP), làm suy giảm lớp điện tích bảo vệ và gây kết tụ hạt (chứng minh qua ảnh TEM). Quá trình này làm dung dịch chuyển sang màu tím hoặc xanh tối, đồng thời xuất hiện dải hấp thụ plasmon mới tại bước sóng 650 nm.

Khảo sát điều kiện phân tích:

  • Hạt GNP có kích thước nhỏ (mẫu KT1 đường kính 8,6 nm) có độ nhạy và tốc độ chuyển màu nhanh hơn các hạt kích thước lớn.
  • Tỷ lệ độ hấp thụ $A_{650}/A_{520}$ đạt giá trị cực đại trong môi trường trung tính (pH = 7,0).
  • Đường chuẩn trắc quang được thiết lập trong khoảng nồng độ melamine từ 0,05 đến 1,00 mg/L với phương trình hồi quy: $$A_{650}/A_{520} = (0,0211 \pm 0,0203) + (2,13 \pm 0,0436) \cdot C_{\text{Mel}}$$ Hệ số tương quan tuyến tính $R^2 = 0,998$, giới hạn phát hiện (LOD) đạt $4,9 \cdot 10^{-5}\text{ g/L}$ ($0,049\text{ mg/L}$).

Các ion vô cơ ($\text{Ca}^{2+}, \text{Mg}^{2+}, \text{Zn}^{2+}, \text{Fe}^{3+}, \text{Na}^+$), aminoacetic axit (AA) và axit ascorbic (VC) không gây ảnh hưởng đáng kể đến phép đo. Phương pháp được áp dụng phân tích trên 7 mẫu sữa thực tế, đối chứng với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Mẫu Hàm lượng thêm vào ($10^{-3}\text{ g/L}$) Phân tích bằng GNP ($10^{-3}\text{ g/L}$) Phân tích bằng HPLC ($10^{-3}\text{ g/L}$) Độ thu hồi (%)
Mẫu 1 0,05 $0,047 \pm 0,03$ 0,051 94
Mẫu 2 0,08 $0,089 \pm 0,01$ 0,083 111
Mẫu 3 0,10 $0,094 \pm 0,01$ 0,095 94
Mẫu 4 0,40 $0,430 \pm 0,20$ 0,390 108
Mẫu 5 0,50 $0,489 \pm 0,01$ 0,527 98
Mẫu 6 0,80 $0,760 \pm 0,10$ 0,840 95
Mẫu 7 1,00 $1,207 \pm 0,04$ 0,995 99

Kết quả kiểm định thống kê cho thấy không có sự sai khác giữa phương pháp trắc quang nano vàng và phương pháp HPLC; độ thu hồi dao động trong khoảng 94% đến 111%.

Chế tạo điện cực biến tính vàng nano xác định axit uric bằng phương pháp von-ampe hòa tan

Đặc tính điện hóa của 3 loại điện cực: điện cực than thủy tinh trần (GCE), điện cực biến tính hạt vàng nano (GCE/GNP) và điện cực biến tính màng lai L-cysteine kết hợp hạt vàng nano (GCE/L-cys/GNP) được đánh giá bằng kỹ thuật DP-ASV và CV.

Loại điện cực $E_{p,\text{TB}}$ (mV) $I_{p,\text{TB}}$ ($\mu\text{A}$) RSD (%) Độ nhạy $b$ ($\mu\text{A}/\mu\text{M}$)
GCE 603 1,552 0,29 0,056
GCE/GNP 597 0,113 5,57 0,004
GCE/L-cys/GNP 611 19,00 2,78 0,711

Điện cực GCE/L-cys/GNP cho cường độ dòng đỉnh hòa tan ($I_p$) gấp 12 lần so với điện cực GCE chưa biến tính và tín hiệu có độ lặp lại cao. Phổ CV chỉ xuất hiện pic oxy hóa anot ($E_{pa}$) mà không xuất hiện pic catot, chứng tỏ quá trình điện hóa của axit uric (UA) trên bề mặt điện cực là quá trình bất thuận nghịch.

Các thông số tối ưu cho hệ điện cực và phép đo DP-ASV:

  • Nồng độ L-cysteine tạo màng: 1,0 mM; số vòng quét điện hóa CV khi tạo màng: 20 vòng.
  • Giá trị pH dung dịch đo: pH = 3,2 (ở pH < 3,2 độ lặp lại kém với $\text{RSD} = 18,6%$; ở pH > 4,8 tín hiệu dòng giảm mạnh).
  • Tốc độ quét thế: $v = 20\text{ mV/s}$; thế điện phân làm giàu: $E_{\text{dep}} = 200\text{ mV}$; thời gian điện phân: $t_{\text{dep}} = 20\text{ s}$; biên độ xung: $\Delta E = 80\text{ mV}$.
  • Động học điện cực: Hệ số chuyển điện tử $\alpha = 0,283$; hằng số tốc độ chuyển electron $K_s = 9,88\text{ s}^{-1}$.

Độ tin cậy của phương pháp: Khoảng tuyến tính từ 2 đến 40 $\mu\text{M}$ ($R^2 > 0,99$); độ nhạy đạt $1,487 \pm 0,103\ \mu\text{A}/\mu\text{M}$; giới hạn phát hiện $\text{LOD} = 2,66 \pm 0,29\ \mu\text{M}$; giới hạn định lượng $\text{LOQ} = 7,47 \div 12\ \mu\text{M}$; độ lệch chuẩn tương đối RSD từ 0,94% đến 3,61% ($n = 9$).

Phương pháp được áp dụng phân tích trên mẫu thực tế gồm 05 mẫu nước tiểu và 05 mẫu huyết thanh người.

Nhóm mẫu Ký hiệu mẫu Đối tượng Tuổi Hàm lượng UA đo được ($\text{TB} \pm \text{SD}$) Độ thu hồi Rev (%)
Nước tiểu NT1 Nữ 51 $1,51 \pm 0,07\text{ mM}$ 94,72 – 117,10
NT2 Nam 28 $2,38 \pm 0,09\text{ mM}$ —
NT3 Nữ 26 $1,27 \pm 0,11\text{ mM}$ —
NT4 Nữ 22 $2,47 \pm 0,08\text{ mM}$ 125,00 – 126,40
NT5 Nữ 26 $2,96 \pm 0,06\text{ mM}$ 110,80 – 114,90
Huyết thanh HT1 Nam 48 $608 \pm 45\ \mu\text{M}$ 119,10 – 123,60
HT2 Nữ 36 $397 \pm 16\ \mu\text{M}$ 118,70 – 119,20
HT3 Nữ 26 $424,40\ \mu\text{M}$ —
HT4 Nữ 35 $508 \pm 5\ \mu\text{M}$ 115,70 – 119,30
HT5 Nữ 40 $240,12\ \mu\text{M}$ —

Kết quả cho thấy độ lặp lại của 3 lần đo có $\text{RSD} < 7,5%$. Hàm lượng UA trong mẫu HT1 (nam giới) cao hơn các mẫu nữ giới (HT2–HT5); mẫu HT3 và HT4 có hàm lượng UA vượt ngưỡng trên bình thường ($393\ \mu\text{M}$).

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của vàng nano

Khảo sát hoạt tính ức chế sinh trưởng in vitro của hạt GNP và GNR trên môi trường lỏng BHI đối với 4 chủng vi khuẩn thực phẩm:

  • Escherichia coli (vi khuẩn gram âm)
  • Salmonella typhimurium (vi khuẩn gram âm)
  • Listeria monocytogenes (vi khuẩn gram dương)
  • Staphylococcus aureus (vi khuẩn gram dương)

Kết quả thử nghiệm vi sinh ghi nhận:

  • Hạt vàng nano dạng cầu (GNP): Có khả năng ức chế cả 4 chủng vi khuẩn; nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đạt 0,1 $\mu\text{g/mL}$ đối với E. coli, L. monocytogenes và S. aureus; đối với S. typhimurium, giá trị MIC là 0,2 $\mu\text{g/mL}$.
  • Hạt vàng nano dạng thanh (GNR): Thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn rõ rệt so với GNP, thể hiện qua giá trị MIC rất nhỏ:
    • Đối với Listeria monocytogenes: $\text{MIC} < 0,0002\ \mu\text{g/mL}$.
    • Đối với Staphylococcus aureus: $\text{MIC} = 0,0008\ \mu\text{g/mL}$.
    • Đối với 2 chủng vi khuẩn này, giá trị MIC của GNR thấp hơn nồng độ ức chế của kháng sinh đối chứng Kanamycin.
    • Đối với Salmonella typhimurium, giá trị MIC của GNR tương đương GNP.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Luận án là công trình thực nghiệm hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về quy luật tổng hợp, cơ chế tạo mầm/phát triển bất đẳng hướng và khảo sát ứng dụng của vật liệu vàng nano ở hai dạng hình thái hình học: dạng cầu (GNP) và dạng thanh (GNR).
  2. Lần đầu tiên nghiên cứu sử dụng thành công dẫn xuất chitosan tan trong nước (WSC) có độ deacetyl hóa ~50% đóng vai trò kép vừa là chất khử "xanh", vừa là chất bảo vệ/ổn định bề mặt hạt để chế tạo hạt nano vàng hình cầu đơn phân tán kích thước 8–15 nm với độ bền keo cao.
  3. Xác lập đầy đủ các thông số động học phản ứng khử ion $\text{Au}^{3+}$ bằng WSC và các quy luật biến thiên tỷ lệ cạnh AR của hạt nano vàng dạng que theo nồng độ chất hoạt động bề mặt CTAB, ion $\text{Ag}^+$, chất khử axit ascorbic và pH môi trường.
  4. Làm sáng tỏ cơ chế oxy hóa bất thuận nghịch của axit uric trên điện cực than thủy tinh biến tính màng tổ hợp nano L-cysteine/GNP, xác định các thông số chuyển điện tử bề mặt ($\alpha = 0,283$; $K_s = 9,88\text{ s}^{-1}$).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

  1. Xây dựng quy trình phân tích trắc quang so màu không cần chất đánh dấu (label-free) dựa trên hạt GNP để phát hiện định tính bằng mắt thường và định lượng melamine trong mẫu sữa thực tế với giới hạn phát hiện thấp ($0,049\text{ mg/L}$), khoảng tuyến tính 0,05–1,00 mg/L, độ thu hồi đạt 94–111%, tương đương với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC nhưng chi phí thấp hơn và thời gian thực hiện nhanh hơn.
  2. Chế tạo thành công cảm biến điện hóa GCE/L-cys/GNP phục vụ định lượng axit uric trong dịch sinh học người (nước tiểu và huyết thanh) bằng phương pháp DP-ASV với giới hạn phát hiện $2,66\ \mu\text{M}$, đáp ứng dải nồng độ lâm sàng phục vụ sàng lọc bệnh gout.
  3. Phát hiện hoạt tính kháng khuẩn của vàng nano dạng thanh (GNR) đối với vi khuẩn gram dương (L. monocytogenes và S. aureus), với nồng độ ức chế tối thiểu nhỏ hơn so với kháng sinh chuẩn Kanamycin.

Kiến nghị của tác giả

Tiếp tục mở rộng nghiên cứu và phát triển ứng dụng của vật liệu vàng nano dạng cầu và dạng thanh trong ngành mỹ phẩm, công nghệ y sinh học, đặc biệt tập trung vào lĩnh vực phát hiện sớm và hỗ trợ điều trị bệnh lý.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi khảo sát các đối tượng mẫu sinh học thực tế (nước tiểu và huyết thanh) mới dừng lại ở số lượng 05 mẫu cho mỗi nhóm đối tượng, chưa mở rộng quy mô thống kê dịch tễ học lâm sàng lớn hơn.
  • Phân tích cơ chế kháng khuẩn của GNR đối với các chủng vi khuẩn gram dương mới được đánh giá thông qua chỉ thị màu oxy hóa khử Alamar Blue và quan sát độ đục môi trường nuôi cấy lỏng, chưa đi sâu giải trình tự tương tác màng tế bào ở mức độ sinh học phân tử chi tiết.
  • Các khảo sát ứng dụng điều trị y sinh và mỹ phẩm mới dừng lại ở mức đề xuất định hướng dựa trên kết quả kháng khuẩn và biến tính điện hóa.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Triển khai thử nghiệm vàng nano dạng thanh bọc silica hoặc chức năng hóa bề mặt chuyên biệt nhằm ứng dụng trong quang nhiệt trị liệu và dẫn truyền thuốc.
  • Mở rộng ứng dụng cảm biến điện cực biến tính nano vàng trên các nền mẫu sinh học phức tạp khác và phát triển các hệ điện cực nhúng dạng que đo nhanh tại chỗ.
  • Tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm mở rộng trên các chủng vi sinh vật kháng đa thuốc.

Giá trị tham khảo

Luận án cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm và tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cho các đối tượng sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa lý, Hóa phân tích, Khoa học vật liệu và Công nghệ Nano: Tham khảo quy trình thực nghiệm tổng hợp "xanh" hạt nano kim loại sử dụng biopolymer, phương pháp kiểm soát hình thái hạt dạng que bằng kỹ thuật phát triển mầm, cũng như các kỹ thuật phân tích đặc trưng XRD, TEM, UV-Vis và điện hóa DP-ASV/CV.
  • Giảng viên và các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Hóa học Y sinh và Cảm biến: Sử dụng các dẫn liệu về động học điện cực của màng nano lai L-cysteine/GNP và cơ chế tạo phức màu GNP-melamine để phát triển các phương pháp phân tích kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và chẩn đoán y sinh học.
  • Cán bộ kỹ thuật kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và phân tích y tế: Tham khảo quy trình định lượng melamine trong sữa không cần qua bước chiết tách sắc ký phức tạp và quy trình định lượng axit uric trong dịch sinh học trên điện cực rắn thay thế điện cực giọt thủy ngân.

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò của chitosan tan trong nước (WSC) trong quá trình tổng hợp vàng nano dạng cầu là gì?

Chitosan tan trong nước (WSC) đóng vai trò kép: vừa là tác nhân khử hóa học "xanh" chuyển hóa ion $\text{Au}^{3+}$ thành $\text{Au}^0$, vừa là chất ổn định bọc phủ bề mặt hạt. Điều kiện tối ưu để tổng hợp WSC là phản ứng N-acetyl hóa trong 2 giờ và cắt mạch với $\text{H}_2\text{O}_2$ trong 3 giờ (độ deacetyl hóa đạt khoảng 50%). Dung dịch WSC 0,5% khử $\text{Au}^{3+}$ 0,5 mM ở 85°C trong 8 giờ tạo ra hạt GNP dạng cầu kích thước trung bình 8 nm. Bổ sung 0,3% WSC sau phản ứng giúp hệ keo bền vững trong 6 tháng.

2. Những yếu tố nào chi phối hình thái và tỷ lệ cạnh (AR) của vàng nano dạng thanh (GNR)?

Quá trình tổng hợp GNR theo phương pháp phát triển mầm chịu sự chi phối của các yếu tố công nghệ:

  • Tỷ lệ mol $[\text{Ag}^+]/[\text{Au}^{3+}] = 0,2$ là điều kiện tối ưu để định hướng tạo thanh có 2 dải hấp thụ LSPR và TSPR.
  • Tỷ lệ mol $[\text{AA}]/[\text{Au}^{3+}] = 1,0$ (hoặc 1,5); nếu tăng lên 2,5 hạt sẽ chuyển thành dạng hình khúc xương (dogbone).
  • Nồng độ chất hoạt động bề mặt CTAB tối ưu là 0,1 M (ở 0,01 M không tạo được dạng thanh).
  • Nồng độ $\text{Au}^{3+}$ tối ưu là 10 mM và giá trị pH môi trường tối ưu trong khoảng 1,5–1,7. Hạt GNR thu được có kích thước $15\text{ nm} \times 76\text{ nm}$ với hệ số cạnh AR $\approx 5$.

3. Phương pháp xác định melamine bằng hạt nano vàng dạng cầu hoạt động theo cơ chế nào và có độ nhạy ra sao?

Cơ chế dựa trên hiện tượng tập hợp hạt keo GNP do tương tác tĩnh điện giữa bề mặt hạt GNP tích điện âm (bởi TPP) với các phân tử melamine tích điện dương (chứa 3 nhóm $-\text{NH}2$). Sự tập hợp hạt làm dung dịch chuyển từ màu đỏ tía ($A{520}$) sang màu tím/xanh tối ($A_{650}$). Phương pháp có khoảng tuyến tính tỷ lệ $A_{650}/A_{520}$ theo nồng độ melamine từ 0,05 đến 1,00 mg/L ($R^2 = 0,998$), giới hạn phát hiện đạt $0,049\text{ mg/L}$ ($4,9 \cdot 10^{-5}\text{ g/L}$), độ thu hồi trên mẫu sữa đạt 94–111%, tương đương với kết quả phân tích bằng HPLC.

4. Cấu tạo và hiệu quả phân tích của điện cực biến tính GCE/L-cys/GNP trong xác định axit uric như thế nào?

Điện cực được chế tạo bằng cách tạo màng L-cysteine (1,0 mM, 20 vòng quét CV) kết hợp hạt nano vàng (GNP) trên nền điện cực than thủy tinh (GCE). Điện cực GCE/L-cys/GNP cho cường độ dòng đỉnh hòa tan ($I_p$) gấp 12 lần so với điện cực GCE trần, độ nhạy đạt $1,487\ \mu\text{A}/\mu\text{M}$, khoảng tuyến tính 2–40 $\mu\text{M}$, giới hạn phát hiện $\text{LOD} = 2,66\ \mu\text{M}$. Phép đo DP-ASV thực hiện ở pH = 3,2, thế điện phân $E_{\text{dep}} = 200\text{ mV}$, thời gian $t_{\text{dep}} = 20\text{ s}$, tốc độ quét $20\text{ mV/s}$ với hệ số chuyển điện tử $\alpha = 0,283$ và hằng số tốc độ $K_s = 9,88\text{ s}^{-1}$.

5. Hoạt tính kháng khuẩn của vàng nano dạng thanh (GNR) khác biệt như thế nào so với dạng cầu (GNP) và kháng sinh Kanamycin?

Vàng nano dạng thanh (GNR) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội hơn dạng cầu (GNP) trên các chủng vi khuẩn thực phẩm. Đặc biệt đối với hai chủng vi khuẩn gram dương, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của GNR đạt mức rất thấp: $\text{MIC} < 0,0002\ \mu\text{g/mL}$ đối với Listeria monocytogenes và $\text{MIC} = 0,0008\ \mu\text{g/mL}$ đối với Staphylococcus aureus. Các giá trị MIC này của GNR nhỏ hơn so với nồng độ ức chế của kháng sinh đối chứng Kanamycin.

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Hóa học của tác giả Lê Thị Lành đã tổng hợp thành công hai dạng cấu trúc vàng nano: dạng cầu (GNP, kích thước 8–15 nm) bằng phương pháp xanh sử dụng chitosan tan trong nước (WSC) và dạng thanh (GNR, kích thước $15\text{ nm} \times 76\text{ nm}$, AR $\approx 5$) bằng phương pháp phát triển mầm định hướng bởi CTAB và ion $\text{Ag}^+$. Công trình đã chứng minh tính hiệu quả của hạt GNP trong việc định tính và định lượng melamine trong sữa bằng phương pháp trắc quang với giới hạn phát hiện $0,049\text{ mg/L}$, đồng thời phát triển thành công điện cực biến tính GCE/L-cys/GNP xác định axit uric trong huyết thanh và nước tiểu bằng kỹ thuật von-ampe hòa tan với độ nhạy cao. Bên cạnh đó, nghiên cứu khẳng định hoạt tính ức chế vi khuẩn thực phẩm vượt trội của vật liệu GNR so với GNP và kháng sinh Kanamycin trên các chủng Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus, cung cấp cơ sở khoa học và thực nghiệm phục vụ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và phân tích y sinh học.