Nghiên Cứu Vắc Xin Bất Hoạt Phòng Ngừa Bệnh Tay Chân Miệng Do EV71

• Tác giả: Nguyen Thi Yen Nhi
• Người hướng dẫn: PSG. Cao Thi Bao Van
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Vắc Xin Bất Hoạt Phòng Ngừa Bệnh Tay Chân Miệng Do EV71
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: CẤU TRÚC HẠT VI RÚT VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA EV71
• 1.1. Cấu trúc hạt Vi rút. Cấu trúc bộ gene. Quá trình lây nhiễm của vi rút EV71 trên tế bào chủ. Quá trình tổng hợp protein Vi rút. Sao chép bộ gene Vi rút
• 1.2. Giải phóng vi rút khỏi tế bào. Nhóm gene EV71. Sự lây lan và tính sinh bệnh học của EV71. Các cơ chế miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của EV71. Dịch tễ học phân tử của EV71
• 1.3. Dịch tễ học bệnh ở Việt Nam
• 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin EV71
• 1.4.1. Vắc xin toàn phần bất hoạt. Vắc xin vi rút sống giảm độc lực. Vắc xin VLP (virus-like particle)
• 1.4.2. Vắc xin tái tổ hợp. Vắc xin peptide tổng hợp
• 1.5. Công nghệ sản xuất vắc xin toàn phần bất hoạt
• 1.5.1. Chọn chủng ứng cử
• 1.5.2. Sản xuất kháng nguyên EV71. Dòng tế bào. Giá thể nuôi cấy
• 1.5.3. Tinh chế kháng nguyên
• 1.5.4. Tá chất nhôm với vắc xin EV71 toàn phần bất hoạt. Đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị - dụng cụ
• 2.2. Các chủng vi rút
• 2.3. Động vật thí nghiệm
• 2.4. Hóa chất và môi trường
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Chọn chủng ứng cử cho vắc xin bằng phân tích xu hướng tiến hóa và so sánh
• 2.5.2. Các phương pháp nuôi cấy tế bào
• 2.5.3. Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
• 2.5.4. Nuôi cấy tế bào trên hệ thống lắc
• 2.5.5. Phương pháp nuôi cấy vi rút EV71
• 2.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá vi rút (TCID50)
• 2.5.7. Phương pháp plaque assay và thu nhận plaque
• 2.5.8. Phương pháp RT-PCR khuếch đại trình tự gen VP1
• 2.5.9. Phương pháp giải trình tự Sanger
• 2.5.10. Phương pháp tinh chế và đánh giá chất lượng kháng nguyên
• 2.5.10.1. Phương pháp cô đặc kháng nguyên
• 2.5.10.2. Phương pháp sắc ký lọc gel
• 2.5.11. Định lượng protein bằng phương pháp đo Bradford
• 2.5.12. Phương pháp điện di SDS-PAGE
• 2.5.13. Xác định thành phần EV71 bằng phương pháp Western Blot
• 2.5.14. Phương pháp bất hoạt kháng nguyên
• 2.5.15. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch và hiệu quả bảo vệ
• 2.5.15.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C
• 2.5.15.2. Phương pháp thu máu chuột
• 2.5.15.3. Phương pháp ELISA xác định kháng thể IgG kháng EV71 trong huyết thanh
• 2.5.15.4. Phương pháp ELISA xác định kháng thể phân lớp IgG1, IgG2a kháng EV71 trong huyết thanh chuột
• 2.5.15.5. Phương pháp thử thách đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Chọn chủng bằng phân tích dữ liệu dịch tễ học phân tử. Thích nghi chủng trên tế bào Vero
• 3.2. Sản xuất kháng nguyên trên hệ thống wave bioreactor
• 3.2.1. Nuôi cấy tế bào Vero trên hệ thống lắc wave bioreactor với giá thể Cytodex 1
• 3.2.2. Khảo sát liều lây nhiễm tối ưu và thời gian thu hoạch vi rút
• 3.2.3. Khảo sát thời điểm thu hoạch vi rút trên hệ thống wave bioreactor
• 3.2.4. Tinh chế, bất hoạt kháng nguyên và đánh giá chất lượng kháng nguyên
• 3.3. Độ tinh sạch, tính kháng nguyên và hàm lượng protein của kháng nguyên sau tinh chế
• 3.4. Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch
• 3.4.1. Kết quả dò liều kháng nguyên ở hàm lượng thấp
• 3.4.2. Kết quả khảo sát lịch tiêm
• 3.4.3. Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch trên các liều kháng nguyên khác nhau và đánh giá hiệu quả của tá chất nhôm
• 3.4.4. Khảo sát subtype kháng thể IgG (IgG1/IgG2a)
• 3.4.5. Kết quả khả năng trung hòa chéo của chủng vắc xin ứng cử với các kiểu gen khác
• 3.4.6. Hiệu quả bảo vệ của vắc xin trên chuột nhắt trắng
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TRONG LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vắc Xin EV71 Cơ Hội và Thách Thức

Bệnh tay chân miệng (TCM) là một bệnh truyền nhiễm phổ biến ở trẻ em, đặc biệt là trẻ dưới 5 tuổi. Bệnh lây truyền qua đường tiêu hóa, gây ra các triệu chứng như sốt, đau họng, tổn thương niêm mạc miệng và da, thường thấy ở lòng bàn tay, lòng bàn chân, đầu gối và mông. Bệnh có thể tiến triển nghiêm trọng, gây ra các biến chứng nguy hiểm như viêm não - màng não, viêm cơ tim và phù phổi cấp, dẫn đến tử vong. Enterovirus 71 (EV71) là một trong những tác nhân gây bệnh TCM nguy hiểm nhất. Hiện nay, vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu cho bệnh TCM, do đó, vắc xin là chiến lược phòng ngừa hiệu quả nhất. Nhiều loại vắc xin EV71 bất hoạt toàn phần đã được thương mại hóa ở Trung Quốc và đang trải qua các giai đoạn nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng ở các nước khác. Tuy nhiên, hiệu quả của các loại vắc xin này đối với các chủng EV71 lưu hành tại Việt Nam vẫn chưa được xác định rõ ràng. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển vắc xin phòng bệnh TCM do EV71 dựa trên các chủng lưu hành tại Việt Nam và đánh giá tính sinh miễn dịch cũng như hiệu quả bảo vệ trên mô hình chuột nhắt trắng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Vắc Xin EV71 Tại Việt Nam

Nghiên cứu phát triển vắc xin EV71 có ý nghĩa quan trọng đối với Việt Nam do đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus EV71 có nhiều điểm khác biệt so với các khu vực khác. Các kiểu gen EV71 được ghi nhận tại Việt Nam bao gồm C1, C4, C5 và B5. Vắc xin được phát triển dựa trên các chủng địa phương sẽ có khả năng bảo vệ tốt hơn cho cộng đồng. Việc phát triển vắc xin EV71 cũng sẽ tạo tiền đề cho việc phát triển các vắc xin đơn giá khác chống lại các tác nhân gây bệnh TCM, cũng như vắc xin đa giá phòng bệnh TCM. Điều này đóng góp vào việc tăng cường năng lực phòng chống dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.2. Các Mục Tiêu Nghiên Cứu Chính Của Dự Án Vắc Xin EV71

Nghiên cứu này tập trung vào các mục tiêu chính sau: (1) Chọn chủng virus EV71 đại diện cho chủng lưu hành, có xu hướng lưu hành, mang kiểu gen phổ biến và có khả năng tạo kháng thể trung hòa chéo với các kiểu gen phụ khác lưu hành tại Việt Nam. (2) Thích ứng chủng trên tế bào Vero để chọn dòng chủng có khả năng ổn định di truyền so với chủng ban đầu và tăng sinh tốt trên dòng tế bào này phục vụ sản xuất. (3) Chuẩn hóa việc sản xuất kháng nguyên trên hệ thống Wave bioreactor kết hợp vi hạt để thu được lượng kháng nguyên cao nhất. (4) Tinh chế kháng nguyên để loại bỏ các thành phần nuôi cấy và mảnh vỡ tế bào. (5) Đánh giá đáp ứng miễn dịch để thu được liều tiêm và lịch tiêm tối ưu trên chuột nhắt trắng. (6) Đánh giá hiệu quả bảo vệ thông qua thí nghiệm thử thách trên chuột sơ sinh 1 ngày tuổi.

II. Tổng Quan Về Virus EV71 Cấu Trúc Lây Nhiễm và Dịch Tễ

Enterovirus 71 (EV71) là một thành viên của loài Enterovirus A trên người, thuộc chi Enterovirus. EV71 được phân lập lần đầu tiên từ phân của một trẻ sơ sinh bị viêm não tại California, Mỹ vào năm 1969. Kể từ đó, EV71 được biết đến như một tác nhân liên quan đến nhiều bệnh, chủ yếu là bệnh tay chân miệng (TCM), đặc biệt ở trẻ em. Bệnh thường biểu hiện với sốt, sưng miệng, và nổi ban có bóng nước trên bàn tay, bàn chân. EV71 có thể gây ra các biến chứng thần kinh nghiêm trọng như viêm màng não, viêm não hoặc liệt kiểu bại liệt. Dịch EV71 bùng phát và lan rộng tại khu vực Châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997, với hàng triệu ca nhiễm được ghi nhận mỗi năm.

2.1. Cấu Trúc và Bộ Gen Của Virus EV71 Chi Tiết Nhất

Virus EV71 là virus không vỏ, có bộ gen RNA sợi đơn. Bộ gen của EV71 chứa một khung đọc mở duy nhất (ORF) mã hóa cho một polyprotein, sau đó được cắt thành các protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4) và các protein phi cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D). Protein VP1 là protein capsid chính và chứa các epitop trung hòa quan trọng. Cấu trúc bộ gen của EV71 bao gồm vùng 5'UTR, ORF và vùng 3'UTR. Vùng 5'UTR chứa một vị trí xâm nhập ribosome bên trong (IRES) cho phép khởi đầu dịch mã độc lập với mũ 5'.

2.2. Cơ Chế Lây Nhiễm và Tính Sinh Bệnh Học Của EV71

EV71 lây truyền chủ yếu qua đường phân - miệng và đường hô hấp. Virus xâm nhập vào cơ thể thông qua niêm mạc miệng hoặc đường hô hấp trên, sau đó nhân lên trong các hạch bạch huyết khu vực. Từ đó, virus lan truyền đến các cơ quan khác, bao gồm hệ thần kinh trung ương. Các cơ chế miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của EV71 bao gồm đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch thích ứng. Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh bao gồm việc kích hoạt các thụ thể nhận diện kiểu mẫu (PRR) như TLR, RIG-I, và NLR, dẫn đến sản xuất các cytokine kháng virus như interferon. Đáp ứng miễn dịch thích ứng bao gồm sản xuất kháng thể trung hòa và tế bào T độc tế bào.

2.3. Dịch Tễ Học Phân Tử Của EV71 Trên Toàn Cầu và Tại Việt Nam

EV71 có nhiều kiểu gen khác nhau, được phân loại thành các kiểu gen A, B, và C. Các kiểu gen này lại được chia thành các kiểu gen phụ. Sự phân bố kiểu gen của EV71 khác nhau theo khu vực và thời gian. Tại Việt Nam, các kiểu gen EV71 đã được ghi nhận bao gồm C1, C4, C5 và B5. Sự thay đổi trong dịch tễ học phân tử của EV71 có thể ảnh hưởng đến hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Vì vậy, việc phát triển vắc xin dựa trên các chủng lưu hành tại địa phương là rất quan trọng. Dữ liệu dịch tễ học phân tử cần được theo dõi liên tục để cập nhật và điều chỉnh chiến lược phòng ngừa dịch bệnh.

III. Phương Pháp Sản Xuất Vắc Xin EV71 Bất Hoạt Toàn Phần Hiệu Quả

Vắc xin bất hoạt toàn phần là một trong những phương pháp sản xuất vắc xin được sử dụng rộng rãi và hiệu quả. Quy trình sản xuất bao gồm chọn chủng ứng cử, nuôi cấy virus, tinh chế kháng nguyên, bất hoạt virus và phối trộn tá chất. Việc lựa chọn chủng ứng cử có vai trò quan trọng, cần đảm bảo chủng có khả năng sinh miễn dịch tốt và có phổ bảo vệ rộng. Các dòng tế bào Vero thường được sử dụng để nuôi cấy virus. Sau khi thu hoạch, virus được tinh chế để loại bỏ các tạp chất. Quá trình bất hoạt virus sử dụng các tác nhân hóa học hoặc vật lý để làm mất khả năng gây bệnh của virus. Cuối cùng, tá chất nhôm thường được sử dụng để tăng cường đáp ứng miễn dịch.

3.1. Lựa Chọn Chủng Ứng Cử Vắc Xin EV71 Tiêu Chí và Quy Trình

Việc lựa chọn chủng ứng cử vắc xin EV71 là một bước quan trọng. Chủng ứng cử cần đáp ứng các tiêu chí sau: (1) Đại diện cho chủng lưu hành hoặc có xu hướng lưu hành tại khu vực mục tiêu. (2) Có kiểu gen phổ biến. (3) Có khả năng tạo kháng thể trung hòa chéo với các kiểu gen phụ khác. (4) Có khả năng tăng sinh tốt trên dòng tế bào sản xuất. (5) Ổn định di truyền trong quá trình sản xuất. Quy trình lựa chọn chủng ứng cử thường bao gồm phân tích dữ liệu dịch tễ học phân tử, đánh giá khả năng sinh miễn dịch và đánh giá khả năng tăng sinh của các chủng virus khác nhau.

3.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Nuôi Cấy và Sản Xuất Kháng Nguyên EV71

Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và sản xuất kháng nguyên EV71 là cần thiết để đạt được năng suất cao và chất lượng ổn định. Các yếu tố cần xem xét bao gồm: (1) Lựa chọn dòng tế bào phù hợp (ví dụ: tế bào Vero). (2) Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy. (3) Kiểm soát các thông số nuôi cấy (ví dụ: nhiệt độ, pH, oxy hòa tan). (4) Sử dụng hệ thống bioreactor để tăng quy mô sản xuất. (5) Sử dụng vi hạt để tăng diện tích bề mặt cho tế bào bám dính và tăng mật độ tế bào.

3.3. Tinh Chế và Bất Hoạt Kháng Nguyên Vắc Xin EV71 An Toàn và Hiệu Quả

Sau khi thu hoạch, kháng nguyên virus cần được tinh chế để loại bỏ các tạp chất từ môi trường nuôi cấy và tế bào. Các phương pháp tinh chế thường được sử dụng bao gồm siêu ly tâm, sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion. Sau khi tinh chế, virus cần được bất hoạt để làm mất khả năng gây bệnh. Các phương pháp bất hoạt thường được sử dụng bao gồm sử dụng formalin, beta-propiolactone hoặc nhiệt. Quá trình bất hoạt cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo virus bị bất hoạt hoàn toàn mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch.

IV. Đánh Giá Tính Sinh Miễn Dịch và Hiệu Quả Bảo Vệ Của Vắc Xin

Sau khi vắc xin được sản xuất, cần tiến hành đánh giá tính sinh miễn dịch và hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Đánh giá tính sinh miễn dịch bao gồm đo lường đáp ứng kháng thể và đáp ứng tế bào T sau khi tiêm vắc xin. Đánh giá hiệu quả bảo vệ bao gồm thí nghiệm thử thách trên động vật, trong đó động vật được tiêm vắc xin và sau đó bị nhiễm virus. Hiệu quả bảo vệ được đánh giá dựa trên tỷ lệ động vật được bảo vệ khỏi bệnh hoặc giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh.

4.1. Phương Pháp Đánh Giá Đáp Ứng Miễn Dịch Sau Tiêm Vắc Xin EV71

Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắc xin EV71 bao gồm: (1) ELISA để đo lường nồng độ kháng thể IgG kháng EV71 trong huyết thanh. (2) Xét nghiệm trung hòa để đo lường khả năng kháng thể trung hòa virus. (3) Xét nghiệm ELISpot để đo lường số lượng tế bào T tiết interferon-gamma (IFN-γ). (4) Phân tích cytokine để đo lường nồng độ các cytokine khác nhau trong huyết thanh. Các xét nghiệm này giúp đánh giá khả năng vắc xin kích thích hệ miễn dịch sản xuất kháng thể và tế bào T có khả năng bảo vệ chống lại virus.

4.2. Thí Nghiệm Thử Thách Đánh Giá Hiệu Quả Bảo Vệ Trên Mô Hình Chuột Nhắt Trắng

Thí nghiệm thử thách trên mô hình chuột nhắt trắng là một phương pháp quan trọng để đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin EV71. Trong thí nghiệm này, chuột được tiêm vắc xin và sau đó bị nhiễm virus EV71. Hiệu quả bảo vệ được đánh giá dựa trên các tiêu chí sau: (1) Tỷ lệ chuột sống sót. (2) Mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng bệnh. (3) Nồng độ virus trong các cơ quan. (4) Tổn thương mô bệnh học. Kết quả của thí nghiệm này cung cấp bằng chứng về khả năng vắc xin bảo vệ động vật khỏi bệnh.

4.3. Tối Ưu Liều Lượng và Lịch Tiêm Vắc Xin Để Đạt Hiệu Quả Tối Ưu

Việc tối ưu hóa liều lượng và lịch tiêm vắc xin là rất quan trọng để đạt được hiệu quả bảo vệ tối ưu. Liều lượng vắc xin cần đủ cao để kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, nhưng không quá cao để gây ra các tác dụng phụ không mong muốn. Lịch tiêm cần được thiết kế để đảm bảo kháng thể được duy trì ở mức độ bảo vệ trong thời gian dài. Các nghiên cứu về liều lượng và lịch tiêm thường được thực hiện trên động vật trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên người. Kết quả của các nghiên cứu này giúp xác định liều lượng và lịch tiêm tối ưu cho vắc xin.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Vắc Xin EV71 Tương Lai

Nghiên cứu phát triển vắc xin EV71 bất hoạt toàn phần dựa trên các chủng lưu hành tại Việt Nam là một hướng đi quan trọng. Việc lựa chọn chủng ứng cử phù hợp, tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá tính sinh miễn dịch và hiệu quả bảo vệ là những yếu tố then chốt để tạo ra một loại vắc xin an toàn và hiệu quả. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển vắc xin đa giá phòng bệnh TCM, cũng như sử dụng các công nghệ mới để tăng cường tính sinh miễn dịch và kéo dài thời gian bảo vệ của vắc xin.

5.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Về Vắc Xin EV71 Đã Đạt Được

Các nghiên cứu về vắc xin EV71 bất hoạt toàn phần đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Một số loại vắc xin đã được thương mại hóa và chứng minh hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh TCM do EV71. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua, bao gồm việc phát triển vắc xin có khả năng bảo vệ chống lại nhiều kiểu gen EV71 khác nhau và việc tăng cường tính sinh miễn dịch của vắc xin.

5.2. Các Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Để Phát Triển Vắc Xin EV71 Thế Hệ Mới

Các hướng nghiên cứu tiềm năng để phát triển vắc xin EV71 thế hệ mới bao gồm: (1) Phát triển vắc xin đa giá phòng bệnh TCM do nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau. (2) Sử dụng các tá chất mới để tăng cường đáp ứng miễn dịch. (3) Phát triển vắc xin dựa trên protein capsid VP1 tái tổ hợp hoặc hạt giống virus (VLP). (4) Sử dụng các công nghệ tiên tiến như mRNA để phát triển vắc xin nhanh chóng và hiệu quả.

5.3. Đề Xuất Các Giải Pháp Để Ứng Dụng Vắc Xin EV71 Trong Thực Tế

Để ứng dụng vắc xin EV71 trong thực tế, cần có sự phối hợp giữa các nhà khoa học, nhà sản xuất và cơ quan quản lý y tế. Cần tiến hành các thử nghiệm lâm sàng quy mô lớn để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vắc xin. Cần xây dựng các chính sách tiêm chủng phù hợp để đảm bảo vắc xin được tiếp cận đến những người cần thiết. Cần tăng cường giáo dục sức khỏe cộng đồng để nâng cao nhận thức về bệnh TCM và lợi ích của việc tiêm vắc xin.