Luận văn thạc sĩ về ứng dụng vật liệu nano sắt từ Fe3O4 trong phân tách DNA

• Tác giả: Lê Thị Ngọc Hạnh
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Liên Thương
• Trường học: Trường Đại học Thủ Dầu Một
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano sắt từ Fe3O4 trong phân tách DNA
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Bình Dương

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Giới thiệu sơ lược vật liệu nano
• 2.2. Các phương pháp thu nhận DNA
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Giới thiệu về vật liệu nano và ứng dụng trong phân tách DNA

Vật liệu nano đã trở thành một công cụ quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là trong công nghệ sinh học và y sinh. Sắt từ Fe3O4 là một trong những vật liệu nano được nghiên cứu rộng rãi nhờ tính chất từ tính mạnh và khả năng tương thích sinh học. Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng vật liệu nano sắt từ Fe3O4 trong phân tách DNA, một quy trình quan trọng trong sinh học phân tử. Phương pháp này hứa hẹn mang lại hiệu quả cao, giảm thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Tổng quan về vật liệu nano sắt từ Fe3O4

Vật liệu nano sắt từ Fe3O4 có kích thước từ 6-8 nm, được tạo ra bằng phương pháp đồng kết tủa. Với tính chất siêu thuận từ, Fe3O4 có thể dễ dàng điều khiển bằng từ trường ngoài, làm cho nó trở thành công cụ lý tưởng trong phân tách DNA. Ngoài ra, việc bọc SiO2 lên bề mặt Fe3O4 giúp tăng độ ổn định và khả năng tương thích sinh học của vật liệu. Điều này mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong y sinh và công nghệ nano.

1.2. Ứng dụng của vật liệu nano trong phân tách DNA

Phân tách DNA là một bước quan trọng trong nhiều nghiên cứu sinh học. Phương pháp sử dụng vật liệu nano sắt từ Fe3O4 cho phép thu nhận DNA nhanh chóng và hiệu quả từ các mẫu sinh học như vi khuẩn, tảo, nấm và máu động vật. So với phương pháp truyền thống sử dụng phenol/chloroform, phương pháp này an toàn hơn, không yêu cầu máy ly tâm và có thể thực hiện trong điều kiện thiếu điện năng. Điều này đặc biệt hữu ích trong các phòng thí nghiệm đơn giản hoặc tại hiện trường.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu này tập trung vào việc tổng hợp hạt nano sắt từ Fe3O4 và Fe3O4@SiO2, sau đó đánh giá hiệu quả của chúng trong phân tách DNA từ các mẫu khác nhau. Các phương pháp thí nghiệm bao gồm tổng hợp hạt nano, thử nghiệm khả năng thu nhận DNA và so sánh với các phương pháp thương mại. Kết quả cho thấy, vật liệu nano sắt từ có hiệu quả tương đương với các kit thương mại trong việc thu nhận DNA từ tảo, nấm và máu động vật.

2.1. Tổng hợp hạt nano sắt từ Fe3O4 và Fe3O4 SiO2

Hạt nano sắt từ Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa, sau đó bọc SiO2 bằng phương pháp Stöber. Kích thước hạt nano Fe3O4 là 6-8 nm, trong khi Fe3O4@SiO2 có kích thước lớn hơn, từ 80-100 nm. Các hạt nano này được đặc trưng bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và phổ hồng ngoại (FT-IR), cho thấy cấu trúc và tính chất hóa học ổn định. Điều này đảm bảo hiệu quả của chúng trong các ứng dụng sinh học.

2.2. Đánh giá hiệu quả phân tách DNA

Các thử nghiệm được thực hiện trên các mẫu DNA từ vi khuẩn E. coli, tảo Spirulina platensis, nấm Cordyceps militaris và máu lợn. Kết quả cho thấy, hạt nano sắt từ Fe3O4 và Fe3O4@SiO2 có khả năng thu nhận DNA hiệu quả, đặc biệt là từ tảo và nấm. Mặc dù hiệu suất thu nhận DNA từ E. coli thấp hơn so với kit thương mại, phương pháp này vẫn có ưu điểm về thời gian và an toàn. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của vật liệu nano sắt từ trong phân tách DNA.

III. Kết luận và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này đã chứng minh hiệu quả của vật liệu nano sắt từ Fe3O4 trong phân tách DNA. Phương pháp này không chỉ nhanh chóng và an toàn mà còn có thể áp dụng trong các điều kiện thiếu điện năng. Điều này mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong y sinh, công nghệ sinh học và các lĩnh vực khác. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện hiệu suất thu nhận DNA từ các mẫu phức tạp hơn như vi khuẩn.

3.1. Giá trị thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này mang lại giá trị thực tiễn cao trong việc phát triển các phương pháp phân tách DNA hiệu quả và tiết kiệm chi phí. Vật liệu nano sắt từ Fe3O4 có thể được sử dụng trong các phòng thí nghiệm đơn giản, đặc biệt là ở các khu vực có điều kiện hạn chế về cơ sở vật chất. Điều này góp phần thúc đẩy nghiên cứu sinh học và y học tại các quốc gia đang phát triển.

3.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu có thể tập trung vào việc cải thiện hiệu suất thu nhận DNA từ các mẫu phức tạp như vi khuẩn và tế bào động vật. Ngoài ra, việc tích hợp vật liệu nano sắt từ vào các hệ thống tự động hóa sẽ giúp tăng hiệu quả và giảm thiểu rủi ro trong quá trình thí nghiệm. Điều này sẽ mở rộng phạm vi ứng dụng của công nghệ nano trong các lĩnh vực khoa học và công nghiệp.

Tổng quan nghiên cứu

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, việc thu nhận và tinh sạch DNA chất lượng cao đóng vai trò then chốt cho các ứng dụng phân tử như PCR, giải trình tự gen và chuyển gen. Ước tính khoảng 20% thời gian trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử được dành cho công đoạn chuẩn bị mẫu nucleic acid, trong đó quy trình thu nhận DNA truyền thống thường phức tạp, tốn thời gian và đòi hỏi tiếp xúc với hóa chất độc hại. Trước thực trạng này, nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano sắt từ Fe₃O₄ trong phân tách DNA nhằm mục tiêu phát triển phương pháp thu nhận DNA nhanh chóng, hiệu quả và an toàn hơn, đặc biệt phù hợp với các phòng thí nghiệm đơn giản hoặc điều kiện không có điện năng.

Luận văn tập trung vào tổng hợp hạt nano sắt từ Fe₃O₄ và Fe₃O₄@SiO₂ với kích thước lần lượt là 6–8 nm và 80–100 nm, sau đó đánh giá khả năng thu nhận DNA từ các mẫu đa dạng như DNA sau PCR, vi khuẩn Escherichia coli DH5α, tảo Spirulina platensis, nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris và máu lợn. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 7/2017 đến 7/2018 tại Trường Đại học Thủ Dầu Một, Bình Dương, với sự hướng dẫn của các chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc so sánh hiệu quả thu nhận DNA bằng hạt nano sắt từ với các phương pháp truyền thống như phenol–chloroform và các kit thương mại, đồng thời đề xuất giải pháp thu nhận DNA không cần ly tâm, giảm thiểu tiếp xúc với hóa chất độc hại và rút ngắn thời gian thực hiện. Kết quả nghiên cứu góp phần mở rộng ứng dụng vật liệu nano trong công nghệ sinh học, nâng cao hiệu quả và an toàn trong quy trình phân tích phân tử.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: (1) nguyên tắc thu nhận DNA dựa trên tính chất hấp phụ của nucleic acid lên bề mặt hạt nano có điện tích âm hoặc dương trong môi trường muối chaotropic, và (2) tính chất siêu thuận từ của hạt nano Fe₃O₄ cho phép thu hồi dễ dàng bằng từ trường ngoài mà không cần ly tâm. Các khái niệm chuyên ngành quan trọng bao gồm:

• Hạt nano siêu thuận từ (SPION): Hạt nano oxit sắt có kích thước dưới 30 nm, không giữ từ tính khi không có từ trường ngoài, giúp tránh kết tụ.
• Phương pháp đồng kết tủa: Kỹ thuật tổng hợp hạt nano Fe₃O₄ bằng cách kết tủa ion sắt trong dung dịch kiềm.
• Phủ silica (SiO₂): Lớp phủ bảo vệ và chức năng hóa bề mặt hạt nano, tăng tính ổn định sinh học và khả năng liên kết DNA.
• Muối chaotropic: Các muối làm giảm sự hydrat hóa, tạo điều kiện cho DNA liên kết với bề mặt silica.
• Phương pháp thu nhận DNA bằng hạt nano từ tính: DNA liên kết với hạt nano trong dung dịch muối, sau đó hạt được thu hồi bằng nam châm vĩnh cửu, rửa và giải hấp DNA.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bao gồm các mẫu DNA sau PCR, vi khuẩn E. coli DH5α, tảo Spirulina platensis, nấm Cordyceps militaris và máu lợn thu thập tại các cơ sở nghiên cứu trong nước. Hạt nano Fe₃O₄ được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa với oleic acid làm chất ổn định bề mặt, kích thước hạt 6–8 nm. Hạt nano Fe₃O₄@SiO₂ được phủ silica bằng phương pháp Stöber, kích thước 80–100 nm.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Phân tích hình ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để xác định kích thước và hình thái hạt nano.
• Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) để xác định các nhóm chức trên bề mặt hạt.
• Thử nghiệm thu nhận DNA bằng cách ủ hạt nano với mẫu DNA trong dung dịch muối, thu hồi hạt bằng nam châm, rửa bằng ethanol 70%, giải hấp DNA trong đệm TE ở 65°C.
• Đánh giá lượng và độ tinh sạch DNA thu nhận bằng đo quang phổ và điện di gel agarose 1%.
• So sánh kết quả với phương pháp phenol–chloroform và các kit thương mại.
• Cỡ mẫu: Mỗi loại mẫu được thử nghiệm với ít nhất 3 lần lặp lại để đảm bảo tính thống kê.
• Phương pháp chọn mẫu: Lựa chọn mẫu đại diện cho các nhóm sinh vật khác nhau nhằm đánh giá tính phổ quát của phương pháp.
• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 7/2017 đến 7/2018, bao gồm tổng hợp hạt nano, thử nghiệm thu nhận DNA và phân tích kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Kích thước và đặc tính hạt nano: Hạt nano Fe₃O₄ có kích thước 6–8 nm, Fe₃O₄@SiO₂ có kích thước 80–100 nm, đồng nhất và ổn định trong dung dịch. Phổ FTIR xác nhận sự hiện diện của lớp phủ silica với các nhóm silanol đặc trưng.

2. Hiệu quả thu nhận DNA từ mẫu PCR: Lượng DNA thu nhận tăng theo lượng hạt nano sử dụng, đạt tối ưu ở 100 µg hạt. Kết quả điện di gel agarose cho thấy DNA thu nhận có kích thước tương đương mẫu gốc, không bị đứt gãy đáng kể.

3. Thu nhận DNA từ vi khuẩn E. coli DH5α: Lượng DNA thu nhận bằng hạt nano thấp hơn khoảng 15% so với kit thương mại, nhưng thời gian thực hiện nhanh hơn 30%. Độ tinh sạch DNA thấp hơn so với phương pháp phenol–chloroform (tỷ số OD260/OD280 khoảng 1.6 so với 1.8).

4. Thu nhận DNA từ tảo Spirulina platensis, nấm Cordyceps militaris và máu lợn: Lượng DNA thu nhận bằng hạt nano tương đương với kit thương mại (chênh lệch không vượt quá 5%, không có ý nghĩa thống kê). Thời gian thu nhận DNA giảm 40% so với phương pháp truyền thống. Đặc biệt, phương pháp không cần ly tâm khi tách DNA từ E. coli và máu lợn, phù hợp với phòng thí nghiệm đơn giản.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân hiệu quả thu nhận DNA khác nhau giữa các mẫu có thể do đặc tính sinh học và thành phần tạp chất khác nhau, ảnh hưởng đến khả năng liên kết DNA với hạt nano. Việc phủ silica giúp tăng tính ổn định và khả năng hấp phụ DNA, tuy nhiên độ tinh sạch DNA thu nhận còn hạn chế do chưa có bước tinh sạch bổ sung.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả phù hợp với báo cáo về ưu điểm của hạt nano Fe₃O₄ trong thu nhận nucleic acid nhanh chóng và an toàn, đồng thời giảm thiểu tiếp xúc với hóa chất độc hại. Việc không cần ly tâm trong một số trường hợp là điểm nổi bật, giúp mở rộng ứng dụng trong điều kiện thực địa hoặc phòng thí nghiệm thiếu thiết bị.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh lượng DNA thu nhận giữa các phương pháp và bảng thống kê tỷ số OD260/OD280 để minh họa độ tinh sạch DNA. Biểu đồ thời gian thực hiện cũng giúp làm nổi bật ưu điểm về tốc độ của phương pháp sử dụng hạt nano.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình phủ silica: Nghiên cứu điều chỉnh độ dày lớp phủ silica để tăng khả năng hấp phụ và tinh sạch DNA, nhằm nâng cao độ tinh khiết sản phẩm cuối cùng.

2. Phát triển bước tinh sạch bổ sung: Áp dụng các bước rửa giải hoặc sử dụng dung dịch đệm đặc biệt để loại bỏ tạp chất protein, polysaccharide nhằm cải thiện tỷ số OD260/OD280 lên trên 1.8.

3. Mở rộng thử nghiệm trên đa dạng mẫu sinh học: Thực hiện thêm các thử nghiệm với mẫu phức tạp như mô người, mẫu môi trường để đánh giá tính ứng dụng rộng rãi của hạt nano.

4. Ứng dụng trong phòng thí nghiệm thực địa: Đề xuất sử dụng hạt nano Fe₃O₄ và Fe₃O₄@SiO₂ trong các phòng thí nghiệm di động hoặc điều kiện không có điện, đặc biệt cho các nghiên cứu di truyền học tại hiện trường.

5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật sử dụng hạt nano trong thu nhận DNA cho các cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên nhằm phổ biến phương pháp mới.

Các giải pháp trên nên được thực hiện trong vòng 12 tháng tiếp theo, với sự phối hợp giữa các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học để thúc đẩy ứng dụng thực tiễn.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và phân tử: Có thể áp dụng phương pháp thu nhận DNA bằng hạt nano để nâng cao hiệu quả và an toàn trong phòng thí nghiệm.

2. Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm: Học hỏi quy trình thu nhận DNA không cần ly tâm, giảm thiểu tiếp xúc hóa chất độc hại, phù hợp với các phòng thí nghiệm có trang thiết bị hạn chế.

3. Doanh nghiệp sản xuất kit sinh học: Tham khảo công nghệ tổng hợp và ứng dụng hạt nano Fe₃O₄ để phát triển sản phẩm kit thu nhận DNA mới, thân thiện và tiết kiệm chi phí.

4. Cơ quan quản lý và đào tạo: Sử dụng luận văn làm tài liệu tham khảo trong đào tạo và xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho các phương pháp thu nhận nucleic acid hiện đại.

Mỗi nhóm đối tượng có thể áp dụng kết quả nghiên cứu để cải tiến quy trình làm việc, phát triển sản phẩm hoặc nâng cao chất lượng đào tạo trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp thu nhận DNA bằng hạt nano Fe₃O₄ có ưu điểm gì so với phương pháp truyền thống?
   Phương pháp này rút ngắn thời gian thu nhận DNA, giảm tiếp xúc với hóa chất độc hại như phenol–chloroform, không cần ly tâm trong nhiều trường hợp, phù hợp với phòng thí nghiệm đơn giản hoặc điều kiện không có điện.

2. Độ tinh sạch DNA thu nhận bằng hạt nano có đảm bảo cho các ứng dụng phân tử?
   Mặc dù độ tinh sạch chưa cao bằng phương pháp phenol–chloroform, DNA thu nhận vẫn đủ chất lượng cho các ứng dụng PCR và giải trình tự cơ bản. Cần tối ưu thêm bước tinh sạch để nâng cao độ tinh khiết.

3. Có thể sử dụng hạt nano Fe₃O₄ để thu nhận DNA từ những mẫu nào?
   Nghiên cứu đã thử nghiệm thành công trên DNA sau PCR, vi khuẩn E. coli, tảo Spirulina platensis, nấm Cordyceps militaris và máu lợn, cho thấy tính đa dụng của phương pháp.

4. Phương pháp này có thể áp dụng trong điều kiện không có điện không?
   Có, đặc biệt khi tách DNA từ E. coli và máu lợn, không cần sử dụng máy ly tâm mà chỉ cần nam châm vĩnh cửu, rất phù hợp với phòng thí nghiệm thực địa hoặc vùng sâu vùng xa.

5. Làm thế nào để tối ưu lượng hạt nano sử dụng trong thu nhận DNA?
   Lượng hạt nano tối ưu được xác định qua thử nghiệm với các nồng độ khác nhau, thường khoảng 100 µg cho mỗi mẫu, giúp đạt hiệu quả thu nhận DNA cao nhất mà không lãng phí vật liệu.

Kết luận

• Đã tổng hợp thành công hạt nano Fe₃O₄ kích thước 6–8 nm và Fe₃O₄@SiO₂ kích thước 80–100 nm với đặc tính siêu thuận từ và lớp phủ silica ổn định.
• Phương pháp thu nhận DNA bằng hạt nano sắt từ cho hiệu quả tương đương với kit thương mại trên các mẫu tảo, nấm và máu, tuy nhiên thấp hơn trên vi khuẩn E. coli.
• Ưu điểm nổi bật là giảm thời gian thực hiện, không cần ly tâm trong nhiều trường hợp và giảm thiểu tiếp xúc với hóa chất độc hại.
• Đề xuất tối ưu hóa lớp phủ silica và bước tinh sạch để nâng cao độ tinh khiết DNA thu nhận.
• Khuyến nghị ứng dụng phương pháp trong phòng thí nghiệm thực địa và đào tạo kỹ thuật viên, đồng thời mở rộng thử nghiệm trên các mẫu sinh học đa dạng hơn.

Tiếp theo, cần triển khai nghiên cứu tối ưu quy trình và mở rộng ứng dụng trong thực tế, đồng thời chuyển giao công nghệ cho các đơn vị nghiên cứu và sản xuất kit sinh học. Độc giả và các nhà nghiên cứu được khuyến khích áp dụng và phát triển phương pháp này nhằm nâng cao hiệu quả công tác phân tích phân tử.