Trương cao minh nghiên cứu thiết kế một số cấu trúc mới hướng ức chế glutaminyl cyclase bằng phương pháp học máy kết hợp mô hình pharmacophore

Nghiên cứu thiết kế cấu trúc mới ức chế glutaminyl cyclase, enzyme liên quan bệnh Alzheimer, bằng học máy và mô hình pharmacophore. Mở ra hướng điều trị tiềm năng.

• Tác giả: Trương Cao Minh
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Mai Dung
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế một số cấu trúc mới theo hướng ức chế glutaminyl cyclase bằng phương pháp học máy kết hợp với mô hình pharmacophore
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ QC
• 1.1. Giới thiệu về QC
• 1.2. Mối liên quan giữa QC và bệnh Alzheimer
• 1.3. Đặc điểm cấu trúc của QC ở người
• 1.4. Một số chất ức chế QC đã được nghiên cứu
• 1.5. Liên quan cấu trúc - tác dụng các chất ức chế QC
• 2. TỔNG QUAN VỀ QSAR
• 2.1. Đại cương về QSAR
• 2.2. Tham số mô tả phân tử và dấu vân tay phân tử
• 2.3. Các bước xây dựng mô hình QSAR
• 3. TỔNG QUAN VỀ MÔ HÌNH PHARMACOPHORE
• 3.1. Khái niệm về mô hình pharmacophore
• 3.2. Mô hình pharmacophore dựa trên phối tử
• 3.3. Mô hình pharmacophore dựa trên cấu trúc
• 4. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP MÔ PHỎNG TƯƠNG TÁC PHÂN TỬ (MOLECULAR DOCKING)
• 5. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Nguyên liệu, thiết bị
• 5.2. Nội dung nghiên cứu
• 5.3. Phương pháp nghiên cứu
• 5.4. Phương pháp xây dựng mô hình QSAR
• 5.5. Phương pháp xây dựng mô hình pharmacophore
• 5.6. Phương pháp thiết kế một số cấu trúc mới hướng ức chế QC
• 5.7. Phương pháp Docking phân tử
• 6. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 6.1. Mô hình QSAR
• 6.2. Kết quả phân chia tập huấn luyện và tập kiểm tra
• 6.3. Kết quả huấn luyện mô hình QSAR
• 6.4. Kết quả dự đoán của mô hình trên tập kiểm tra
• 6.5. Mô hình pharmacophore
• 6.6. Kết quả huấn luyện mô hình pharmacophore
• 6.7. Kết quả đánh giá mô hình pharmacophore
• 6.8. Thiết kế một số cấu trúc mới hướng ức chế QC
• 6.9. Kết quả sàng lọc ảo
• 6.10. Mô phỏng docking phân tử
• 6.11. Bàn luận về xây dựng mô hình QSAR
• 6.12. Bàn luận về xây dựng mô hình pharmacophore
• 6.13. Bàn luận về thiết kế và kết quả sàng lọc
• 6.14. Bàn luận về kết quả mô phỏng docking phân tử
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Glutaminyl Cyclase QC và Bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là một trong những hội chứng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, đặc trưng bởi sự suy giảm không hồi phục về trí nhớ, nhận thức và ngôn ngữ. Theo Hiệp hội Alzheimer, năm 2023, ước tính có khoảng 6,7 triệu người Mỹ trên 65 tuổi mắc bệnh. Bệnh cũng là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ bảy trên toàn thế giới, với hơn 121.000 ca tử vong. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 660.000 người mắc hội chứng sa sút trí tuệ vào năm 2020 và dự kiến tăng lên 2,4 triệu vào năm 2050. Chi phí liên quan ước tính khoảng 960 triệu đô la. Sự gia tăng này một phần do tốc độ già hóa dân số nhanh và thiếu nhận thức về các bệnh thần kinh. Giả thuyết amyloid hiện nay được xem là trung tâm trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Nó bắt nguồn từ quá trình tích tụ và hình thành mảng bám amyloid. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc ức chế QC có liên quan chặt chẽ đến việc cải thiện khả năng nhận thức và làm chậm tiến triển của bệnh. Do đó, QC là một mục tiêu phân tử tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Enzyme Glutaminyl Cyclase QC

Glutaminyl Cyclase (QC) thuộc họ enzyme acyltransferase phụ thuộc kim loại. Nó xúc tác quá trình sửa đổi sau dịch mã ở một số protein hoặc peptid. Quá trình này chuyển gốc glutamin (Gln) hoặc glutamat (Glu) ở đầu tận nitơ thành cấu trúc pyroglutamat-peptid (pE-peptid), đồng thời giải phóng một phân tử amoniac hoặc một phân tử nước. QC lần đầu tiên được phân lập vào năm 1963 bởi Michael và cộng sự sau khi quan sát thấy sự giải phóng khí amoniac khi hòa tan nhựa mủ của cây đu đủ Carica papaya trong dung dịch chứa L-glutamin và L-glutaminyl peptid [40]. QC có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, từ đáp ứng miễn dịch đến viêm nhiễm. QC tăng tính bền vững của các cơ chất, ngăn chặn sự thủy phân từ các aminopeptidase, đồng thời làm tăng khả năng gắn kết của peptid với các receptor [12, 15].

1.2. Mối Liên Quan Giữa Glutaminyl Cyclase và Bệnh Alzheimer

Giả thuyết amyloid được xem là trung tâm trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer. Giả thuyết này bắt nguồn từ việc tích tụ mảnh Aβ. Mảnh Aβ có nguồn gốc từ protein amyloid tiền thân (APP). APP được chuyển hóa theo hai con đường khác nhau: con đường sinh amyloid và con đường không sinh amyloid. Trong con đường sinh amyloid, enzym β-secretase (BACE) chịu trách nhiệm chính trong việc chuyển hóa APP để tạo thành mảnh sAPPβ. Phần peptid còn lại của APP sẽ tiếp tục được phân cắt bởi phức hợp enzym γ-secretase và giải phóng ra mảnh Aβ. Tỉ lệ Aβ42: Aβ40 tăng làm thúc đẩy quá trình tích tụ mảnh Aβ42, các mảnh đó sẽ kết tập, kéo dài và dần hình thành nên mảng bám amyloid [22].

II. Thách Thức Trong Điều Trị Alzheimer Vai Trò Ức Chế QC

Một thách thức lớn trong điều trị bệnh Alzheimer là sự phức tạp của cơ chế bệnh sinh và sự thiếu hụt các phương pháp điều trị hiệu quả. Giả thuyết amyloid, mặc dù có giá trị, vẫn chưa hoàn toàn giải thích được tất cả các khía cạnh của bệnh. Việc phát triển các loại thuốc điều trị Alzheimer nhắm vào các mục tiêu khác nhau, bao gồm cả Glutaminyl Cyclase (QC), đang là một hướng đi đầy hứa hẹn. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc ức chế QC có thể làm giảm sự hình thành mảng bám amyloid, một đặc điểm chính của bệnh Alzheimer. Tuy nhiên, việc phát triển các chất ức chế QC hiệu quả và an toàn vẫn còn nhiều khó khăn, bao gồm việc đảm bảo độ chọn lọc cao, khả năng vượt qua hàng rào máu não (BBB) và giảm thiểu các tác dụng phụ tiềm ẩn. Do đó, việc thiết kế cấu trúc các chất ức chế QC mới bằng các phương pháp tiên tiến như học máy và mô hình Pharmacophore là vô cùng cần thiết.

2.1. Sự Hình Thành Mảng Bám Amyloid và Protein Tau Trong Alzheimer

Nghiên cứu năm 1985, khi thực hiện nghiên cứu mảnh A𝛽 được phân lập từ mảng bám amyloid ở những bệnh nhân Alzheimer, Masters và cộng sự nhận thấy sự bất thường trong cấu trúc ở đầu tận nitơ khi tới 64% mảnh A𝛽 bắt đầu từ phenylalanin (Phe) ở vị trí số 4 [39]. Năm 1992, Mori và cộng sự phát hiện ra cấu trúc pyroglutamat ở đầu tận nitơ của khoảng 15-20% mảnh A𝛽, được biết đến là mảnh pE3-A𝛽. Mảnh pE3-A𝛽 có khả năng hình thành cấu trúc nếp gấp beta dễ dàng hơn các đoạn peptid có độ dài hoàn chỉnh, từ đó cho thấy mảnh pE3-A𝛽 hoạt động như một “chất mồi” (seed species), có thể tự kết tập hoặc kết tập với các mảnh A𝛽 có độ dài khác nhau, thúc đẩy quá trình oligomer hoá để tạo nên mảng bám amyloid.

2.2. Ảnh Hưởng Của Glutaminyl Cyclase QC Lên Quá Trình Bệnh Sinh

Nghiên cứu chỉ ra rằng pE3-A𝛽 có khả năng kích hoạt và thúc đẩy quá trình chết của tế bào theo chương trình (apoptosis) và quá trình hoại tử ở các tế bào thần kinh đệm hình sao thông qua việc hoạt hoá caspase, thay đổi tính thấm của màng tế bào hay tạo ra các cytokin gây viêm. Sự phân bố khác nhau của hQC trong tế bào dẫn tới việc hình thành nên hai dạng isoform, cụ thể là hQC phân bố trong túi bài tiết (sQC, mã hoá bởi gen QPCT) và hQC phân bố trong thể golgi (gQC hoặc isoQC, mã hoá bởi gen QPCTL). Việc xác định các cơ chế này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

III. Phương Pháp Học Máy Mô Hình Pharmacophore Thiết Kế Thuốc Ức Chế QC

Trong kỷ nguyên công nghệ thông tin và trí tuệ nhân tạo, các phương pháp nghiên cứu và phát triển thuốc bằng mô phỏng trên máy tính (in silico) ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Các phương pháp này giúp đẩy nhanh quá trình tìm kiếm các hợp chất tiềm năng làm thuốc và tiết kiệm chi phí so với phương pháp truyền thống. Nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng học máy kết hợp với mô hình Pharmacophore để thiết kế cấu trúc các chất ức chế QC mới. Học máy có thể giúp dự đoán hoạt tính sinh học và tối ưu hóa cấu trúc phân tử, trong khi mô hình Pharmacophore giúp xác định các đặc điểm cấu trúc quan trọng cho hoạt tính ức chế QC. Mục tiêu là xây dựng mô hình liên quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học (QSAR) và mô hình Pharmacophore của các chất ức chế QC, sau đó thiết kế các cấu trúc mới và sàng lọc tác dụng dựa trên các mô hình này kết hợp với phương pháp mô phỏng tương tác phân tử (Molecular docking).

3.1. Ứng Dụng Học Máy Machine Learning Trong Thiết Kế Thuốc

Học máy đang cách mạng hóa quy trình phát triển thuốc bằng cách cung cấp các công cụ mạnh mẽ để phân tích dữ liệu lớn, dự đoán hoạt tính sinh học và tối ưu hóa cấu trúc phân tử. Các thuật toán học máy có thể được sử dụng để sàng lọc các hợp chất tiềm năng, dự đoán khả năng hấp thụ, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của thuốc (ADMET), và xác định các mục tiêu thuốc mới. Học máy giúp giảm thời gian và chi phí phát triển thuốc đồng thời tăng khả năng thành công.

3.2. Vai Trò Của Mô Hình Pharmacophore Trong Tối Ưu Hóa Cấu Trúc

Mô hình Pharmacophore là một biểu diễn trừu tượng của các đặc điểm cấu trúc cần thiết để một phân tử tương tác với mục tiêu sinh học cụ thể. Mô hình này giúp xác định các nhóm chức quan trọng và sự sắp xếp không gian của chúng. Bằng cách sử dụng mô hình Pharmacophore, các nhà nghiên cứu có thể thiết kế các phân tử mới có khả năng tương tác mạnh mẽ với mục tiêu mong muốn, trong trường hợp này là Glutaminyl Cyclase (QC). Mô hình này dựa trên các nhóm chức quan trọng như nhóm cho liên kết hydro, nhóm nhận liên kết hydro, nhóm tích điện dương, nhóm tích điện âm và vòng thơm.

3.3. Phương Pháp Mô Phỏng Tương Tác Phân Tử Molecular Docking

Mô phỏng docking phân tử là một phương pháp tính toán được sử dụng để dự đoán cách một phân tử nhỏ (ví dụ: thuốc tiềm năng) liên kết với một protein mục tiêu (ví dụ: enzyme Glutaminyl Cyclase). Phương pháp này giúp đánh giá ái lực liên kết giữa thuốc và protein, xác định các tương tác quan trọng, và dự đoán cấu trúc của phức hợp thuốc-protein. Kết quả docking phân tử có thể được sử dụng để sàng lọc các hợp chất tiềm năng và tối ưu hóa cấu trúc thuốc.

IV. Nghiên Cứu Thiết Kế Cấu Trúc Mới Ức Chế Glutaminyl Cyclase QC

Nghiên cứu này tập trung vào việc thiết kế và đánh giá các cấu trúc mới có khả năng ức chế Glutaminyl Cyclase (QC), một mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị bệnh Alzheimer. Quá trình thiết kế bao gồm việc xây dựng mô hình QSAR và mô hình Pharmacophore, sau đó sử dụng các mô hình này để sàng lọc ảo các hợp chất tiềm năng. Các hợp chất có kết quả sàng lọc tốt nhất được đánh giá bằng phương pháp docking phân tử để xác định ái lực liên kết và các tương tác quan trọng với enzyme QC. Nghiên cứu cũng đánh giá độ chọn lọc của các hợp chất mới đối với QC so với các enzyme khác.

4.1. Xây Dựng Mô Hình QSAR Quantitative Structure Activity Relationship

Mô hình QSAR được xây dựng để thiết lập mối liên hệ giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của các chất ức chế Glutaminyl Cyclase (QC) đã biết. Mô hình này sử dụng các tham số mô tả phân tử (ví dụ: trọng lượng phân tử, hệ số phân bố, diện tích bề mặt) để dự đoán hoạt tính ức chế QC của các hợp chất mới. Mô hình QSAR được đánh giá bằng cách sử dụng một tập kiểm tra độc lập để đảm bảo tính chính xác và khả năng dự đoán.

4.2. Sàng Lọc Ảo Các Hợp Chất Tiềm Năng Bằng Mô Hình Pharmacophore

Sàng lọc ảo là một phương pháp sử dụng mô hình Pharmacophore để tìm kiếm các hợp chất trong cơ sở dữ liệu có cấu trúc phù hợp với các đặc điểm cấu trúc cần thiết cho hoạt tính ức chế Glutaminyl Cyclase (QC). Các hợp chất được xác định trong quá trình sàng lọc ảo được đánh giá thêm bằng phương pháp docking phân tử và các thử nghiệm sinh học in vitro.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Hợp Chất Tiềm Năng Độ Hiệu Quả Ức Chế QC

Nghiên cứu đã xác định được một số hợp chất mới có tiềm năng ức chế Glutaminyl Cyclase (QC) dựa trên kết quả sàng lọc ảo và docking phân tử. Các hợp chất này thể hiện ái lực liên kết tốt với enzyme QC và tuân thủ các quy tắc Lipinski, cho thấy chúng có khả năng trở thành thuốc đường uống. Các kết quả này cung cấp cơ sở cho việc tổng hợp và đánh giá in vitro các hợp chất này để xác nhận hoạt tính ức chế QC và độ chọn lọc.

5.1. Đánh Giá In Silico Các Hợp Chất Ức Chế QC Mới Được Thiết Kế

Đánh giá in silico bao gồm việc sử dụng các phương pháp tính toán như docking phân tử và mô phỏng động lực học phân tử để dự đoán ái lực liên kết, độ ổn định của phức hợp thuốc-protein, và các tương tác quan trọng giữa thuốc và enzyme QC. Các kết quả đánh giá in silico cung cấp thông tin quan trọng để lựa chọn các hợp chất triển vọng cho các thử nghiệm in vitro.

5.2. So Sánh Kết Quả Với Các Nghiên Cứu Về Ức Chế QC Khác

Nghiên cứu so sánh kết quả với các nghiên cứu khác về ức chế Glutaminyl Cyclase (QC) để đánh giá tính mới và tiềm năng của các hợp chất mới được xác định. So sánh này bao gồm việc đánh giá hoạt tính ức chế QC, độ chọn lọc, và cấu trúc của các hợp chất mới so với các chất ức chế QC đã biết.

VI. Tương Lai Nghiên Cứu Ức Chế QC Đột Phá Điều Trị Alzheimer

Nghiên cứu này đóng góp vào sự hiểu biết về Glutaminyl Cyclase (QC) và vai trò của nó trong bệnh Alzheimer. Các kết quả cho thấy việc sử dụng học máy và mô hình Pharmacophore là một phương pháp hiệu quả để thiết kế các chất ức chế QC mới. Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu để xác nhận hoạt tính ức chế QC và độ an toàn của các hợp chất mới, cũng như đánh giá hiệu quả của chúng trong các mô hình in vivo của bệnh Alzheimer. Trong tương lai, việc phát triển các chất ức chế QC hiệu quả có thể mang lại một đột phá trong điều trị bệnh Alzheimer.

6.1. Triển Vọng Phát Triển Thuốc Ức Chế QC Thế Hệ Mới Cho Alzheimer

Triển vọng phát triển thuốc ức chế Glutaminyl Cyclase (QC) thế hệ mới cho bệnh Alzheimer rất hứa hẹn. Các thuốc này có thể được thiết kế để có độ chọn lọc cao hơn, khả năng vượt qua hàng rào máu não tốt hơn, và giảm thiểu các tác dụng phụ tiềm ẩn. Sự kết hợp của các phương pháp thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, học máy, và thử nghiệm lâm sàng có thể dẫn đến sự phát triển của các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh Alzheimer.

6.2. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Tác Động Của QC và Mảnh Amyloid Beta

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của Glutaminyl Cyclase (QC) và mảnh amyloid beta là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về bệnh Alzheimer. Nghiên cứu này có thể bao gồm việc xác định các mục tiêu phân tử mới, khám phá vai trò của các yếu tố di truyền và môi trường, và phát triển các biomarker Alzheimer để chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh. Sự hiểu biết sâu sắc hơn về cơ chế bệnh sinh có thể dẫn đến sự phát triển của các phương pháp điều trị hiệu quả hơn và cá nhân hóa hơn cho bệnh Alzheimer.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh Alzheimer là một dạng thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến nhất của hội chứng sa sút trí tuệ, đặc trưng bởi sự suy giảm không hồi phục về trí nhớ, khả năng nhận thức và ngôn ngữ. Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Alzheimer (2023), tại Hoa Kỳ có khoảng 6,7 triệu người trên 65 tuổi mắc bệnh, và đây là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ bảy trên toàn cầu với hơn 121.000 ca tử vong mỗi năm. Tại Việt Nam, số lượng bệnh nhân mắc hội chứng sa sút trí tuệ ước tính đạt 660.000 người vào năm 2020 và dự báo tăng lên 2,4 triệu người vào năm 2050, tạo gánh nặng kinh tế - y tế ước tính 960 triệu USD.

Trong cơ chế bệnh sinh của Alzheimer, giả thuyết amyloid đóng vai trò trung tâm thông qua sự tích tụ các đoạn peptid beta-amyloid ($A\beta$). Trong đó, mảnh biến dị pyroglutamat beta-amyloid ($pE3\text{-}A\beta$) hình thành do enzym Glutaminyl cyclase (QC) xúc tác phản ứng đóng vòng và loại nước phần dư glutamat ở đầu tận nitơ của đoạn $A\beta_{3-40/42}$. Do mất các điện tích và xuất hiện vòng lactam bền vững, mảnh $pE3\text{-}A\beta$ có tốc độ kết tập nhanh hơn, đóng vai trò như "chất mồi" (seed species) thúc đẩy quá trình tạo mảng bám amyloid và gây độc tế bào thần kinh. Do đó, ức chế enzym QC là một hướng tiếp cận mục tiêu phân tử tiềm năng trong điều trị Alzheimer.

Để rút ngắn thời gian và chi phí so với nghiên cứu thực nghiệm truyền thống, phương pháp mô phỏng trên máy tính (in silico) kết hợp trí tuệ nhân tạo được ứng dụng nhằm tìm kiếm các phối tử ức chế QC mới. Khóa luận đặt ra 2 mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Xây dựng mô hình liên quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học (QSAR) và mô hình pharmacophore của các chất ức chế enzym QC.
2. Thiết kế các cấu trúc phân tử mới hướng ức chế QC và sàng lọc tác dụng dựa trên các mô hình QSAR, pharmacophore đã xây dựng kết hợp phương pháp mô phỏng tương tác phân tử (molecular docking).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cấu trúc hóa học và dữ liệu hoạt tính sinh học ($IC_{50}$) của 1.681 chất ức chế QC thu thập từ các công bố và bằng sáng chế quốc tế; cấu trúc tinh thể 3D của enzym glutaminyl cyclase ở người (dạng $sQC$, mã PDB: 3PBB và các mã đối chứng).
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Hóa dược, Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội; hoàn thành và bảo vệ vào tháng 06/2024.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mục tiêu phân tử

• Đặc điểm enzym Glutaminyl cyclase (QC): QC người thuộc nhóm II, gồm hai dạng đồng dạng phân bố khác nhau: $sQC$ trong túi bài tiết (mã hóa bởi gen QPCT) và $gQC$ hay $isoQC$ trong thể Golgi (mã hóa bởi gen QPCTL). Cả hai dạng có trình tự tương đồng hơn 45% và có trung tâm hoạt động dạng hình cầu chứa ion $Zn^{2+}$ tạo phức tứ diện với 3 acid amin ($Asp159, Glu202, His330$ ở $sQC$; $Asp186, Glu226, His351$ ở $gQC$) và một phân tử nước.
• Bộ khung pharmacophore cổ điển của chất ức chế QC: Được phát triển dựa trên cơ chất tripeptid ($Glu\text{-}Phe\text{-}Arg$), gồm 4 phần:
  • Phần A: Nhóm gắn kẽm (ZBG) như imidazol, benzimidazol, methyltriazol.
  • Phần B: Mạch alkyl mang nhóm nhận/cho liên kết hydro (urea, thiourea) tạo liên kết với $Gln304$.
  • Phần C: Vòng thơm tạo liên kết xếp chồng $\pi\text{-}\pi$ với $Phe325$ và tương tác kỵ nước.
  • Phần D: Hợp phần mô phỏng gốc guanidin của $Arg$, tương tác tĩnh điện với $Glu327$.

Phương pháp nghiên cứu

• Xây dựng mô hình QSAR:
  • Dữ liệu: 1.681 chất được chuẩn hóa hoạt tính về dạng $pIC_{50} = -\log(IC_{50})$.
  • Tham số mô tả: Dấu vân tay phân tử Morgan (Morgan fingerprint) với bán kính xuyên tâm $radius = 4$ và độ dài chuỗi nhị phân $nBits = 256$ thông qua thư viện RDKit.
  • Thuật toán: Máy hỗ trợ vector hồi quy (Support Vector Regression - SVR). Tối ưu hóa siêu tham số bằng phương pháp tìm kiếm lưới (GridSearchCV) kết hợp tìm kiếm ngẫu nhiên (Randomized Search).
  • Thẩm định: Thẩm định chéo 10 lần ($Q^2_{10CV}$), kiểm tra $Y$ ngẫu nhiên (100 lần lặp để xác định $R^2_{rand}$ và $Q^2_{rand}$). Xây dựng miền cấu trúc ứng dụng qua giản đồ William với ngưỡng đòn bẩy $h^*$.
• Xây dựng mô hình Pharmacophore:
  • Phương pháp: Dựa trên phối tử (Ligand-based) sử dụng phần mềm Psearch trên môi trường Visual Studio Code.
  • Tập huấn luyện: Lựa chọn các chất hoạt tính ($pIC_{50} \ge 7$) và không hoạt tính ($pIC_{50} \le 5$), phân cụm theo thuật toán Butina Clustering với ngưỡng khoảng cách Tanimoto 0,2.
  • Thẩm định: Tập kiểm tra được làm giàu bằng 15.348 chất mồi nhử (decoys) tạo từ nền tảng máy tính để đánh giá độ chính xác, độ nhạy, hệ số $F_{0,5}\text{ score}$, hệ số tương quan Matthew (MCC), hệ số làm giàu (EF) và điểm Güner–Henry (GH).
• Thiết kế cấu trúc mới và sàng lọc ảo:
  • Thiết kế: Phân cụm 428 chất hoạt tính bằng thuật toán $k\text{-means}$ (xác định số cụm qua phương pháp khuỷu tay - Elbow method). Trích xuất khung cấu trúc phân tử theo phương pháp HierS bằng thư viện ScaffoldGraph kết hợp phân tích mức độ quan trọng của đặc trưng bằng hoán vị (Permutation Feature Importance). Thay thế bằng các nhóm đẳng cấu sinh học (bioisostere).
  • Bộ lọc dược lý: Đánh giá quy tắc 5 Lipinski và khả năng thấm qua hàng rào máu não (BBB) bằng công cụ trực tuyến SwissADME.
• Mô phỏng tương tác phân tử (Molecular Docking):
  • Thực hiện trên phần mềm AutoDock Vina 1.5 với cấu trúc tinh thể $sQC$ (PDB ID: 3PBB, độ phân giải 1,95 Å).
  • Tọa độ tâm hộp docking: $x = -0,986$; kích thước hộp lưới: $30 \times 20 \times 30$ Å; độ thấu triệt (exhaustiveness): 24.
  • Thẩm định quy trình bằng phương pháp tái docking phối tử đồng kết tinh PBD150 (đánh giá độ lệch căn quân phương RMSD < 2 Å). Sử dụng chất ức chế đang thử nghiệm lâm sàng PQ912 làm đối chứng so sánh năng lượng liên kết ($\Delta G$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

• Hệ thống hóa cấu trúc phân tử, cơ chế xúc tác phản ứng đóng vòng tạo $pE3\text{-}A\beta$ của enzym glutaminyl cyclase (QC) và mối liên hệ nhân quả với sự tiến triển của bệnh lý Alzheimer.
• Phân tích chi tiết đặc điểm không gian 3D của hai dạng đồng dạng $sQC$ và $gQC$, cấu hình đóng/mở tại trung tâm hoạt động phụ thuộc vào định hướng của gốc $Trp207$, cũng như cấu trúc hóa học của các phối tử ức chế điển hình (PBD150, PQ912, TQ1–TQ4).
• Trình bày cơ sở lý thuyết của mô hình QSAR theo 5 nguyên tắc chuẩn của OECD, các bậc tham số mô tả phân tử (từ 0D đến 4D), dấu vân tay phân tử (dấu vân tay xuyên tâm Morgan, ECFP/FCFP và dấu vân tay cấu trúc MACCS).
• Khái quát lý thuyết mô hình pharmacophore (dựa trên phối tử và cấu trúc), các thuật toán so khớp đồ thị VF2 và nguyên lý mô phỏng tương tác phân tử bằng phương pháp docking phân tử.

Chương 2. Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

• Trình bày nguồn gốc 1.681 cấu trúc hóa học lấy từ 23 tài liệu công bố và bằng sáng chế (gồm 13 công bố từ công ty Probiodrug AG - Đức, 8 công bố từ nhóm GS. JeeWoo Lee - Hàn Quốc, 2 công bố từ Hungary và Trung Quốc). Tất cả dữ liệu hoạt tính đều được đo lường đồng nhất bằng giá trị $IC_{50}$ theo quy trình thực nghiệm của Schilling và cộng sự (2002).
• Cài đặt hệ thống công cụ xử lý dữ liệu và thuật toán trên máy tính cá nhân (hệ điều hành Windows 11), ngôn ngữ lập trình Python 3.7/3.0, môi trường Google Colaboratory, thư viện RDKit, phần mềm ChemDraw 20.0, Chem3D, ScaffoldGraph, Psearch, AutoDock Vina 1.5, ChimeraX 1.7, AutoDockTools 1.7 và Discovery Studio 2024 Client.
• Quy định chi tiết các bước chuẩn bị protein 3PBB, chuẩn hóa trường lực (AM1-BCC cho $Zn^{2+}$, Kollman cho protein, Gasteiger cho phối tử), phương pháp phân chia tập dữ liệu ngẫu nhiên (1.352 chất tập huấn luyện và 329 chất tập kiểm tra) kết hợp kiểm định thống kê Kolmogorov-Smirnov và Wilcoxon để xác nhận tính tương đồng về phân bố hoạt tính.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

• Mô hình QSAR (SVR):
  • Tối ưu hóa siêu tham số cho hàm hạt nhân cơ bản (RBF Kernel) với $C = 3,0335571517$ và $\varepsilon = 0,0247876099$.
  • Loại bỏ 43 ngoại lai (3 chất vượt ngưỡng đòn bẩy $h^* = 0,5703$ và 40 chất có phần dư chuẩn hóa ngoài khoảng $[-3; 3]$) trên giản đồ William. Tập huấn luyện sau làm sạch gồm 1.309 chất đạt $R^2_{train} = 0,99$ và $Q^2_{10CV} = 0,80$.
  • Thử nghiệm $Y$ ngẫu nhiên 100 lần thu được $R^2_{rand} = -0,49$ và $Q^2_{rand} = -0,24$, khẳng định mô hình không bị khớp ngẫu nhiên.
  • Dự đoán trên tập kiểm tra độc lập (329 chất, $100%$ nằm trong miền ứng dụng $h^{**} \le 0,5890$) đạt $R^2_{test} = 0,83$, $RMSE = 0,48$, $MAE = 0,37$, hệ số góc $K = 0,95$ và $K' = 1,01$.
• Mô hình Pharmacophore:
  • Từ 29 chất đại diện phân cụm Butina, xây dựng được 8 mô hình giả thuyết 4 điểm.
  • Thẩm định trên tập kiểm tra 15.892 chất (405 active, 15.487 inactive/decoy), mô hình 3 được lựa chọn tối ưu với các chỉ số: Độ chuẩn xác = $0,99$; Độ chính xác = $0,76$; Độ nhạy = $0,75$; Độ đặc hiệu = $0,99$; $F_{0,5}\text{ score} = 0,76$; $MCC = 0,75$; $EF = 30,43$; điểm $GH = 0,75$.
  • Cấu trúc không gian của mô hình 3 gồm 2 nhóm vòng thơm ($a$), 1 nhóm nhận liên kết hydro ($A$) và 3 cấu trúc thân dầu ($H$) với bán kính 1 Å.
• Thiết kế cấu trúc và sàng lọc ảo:
  • Phân cụm 428 chất hoạt tính thành 4 cụm. Sử dụng ScaffoldGraph tạo khung phân tử HierS kết hợp đột biến điểm đặc trưng, xác định các nhóm chức cốt lõi và phát triển 7 dãy dẫn chất mới với tổng cộng 41.592 cấu trúc.
  • Sàng lọc ảo đa tầng: 41.592 chất $\rightarrow$ 5.025 chất thuộc miền ứng dụng QSAR $\rightarrow$ 349 chất có $pIC_{50}$ dự đoán $\ge 7,00$ $\rightarrow$ 339 chất vượt qua mô hình pharmacophore 3 (toàn bộ thuộc dãy 5) $\rightarrow$ 155 chất đạt chuẩn Lipinski và có khả năng thấm qua BBB $\rightarrow$ 78 chất có năng lượng liên kết docking thấp hơn chất đối chứng PQ912.
• Mô phỏng tương tác phân tử (Molecular Docking):
  • Tái docking trên 8 tinh thể QC trong PDB cho kết quả RMSD đều $< 2$ Å; trong đó tinh thể 3PBB có RMSD thấp nhất ($0,7036$ Å). Tương quan giữa $\Delta G$ thực nghiệm và dự đoán đạt hệ số $0,78$.
  • Docking 155 chất đã sàng lọc giúp xác định 78 cấu trúc có năng lượng tự do liên kết âm hơn phối tử đối chứng lâm sàng PQ912, thiết lập các tương tác then chốt với ion $Zn^{2+}$, $Glu201$, $Leu249$, $Ile303$, $Ser323$, $Phe325$.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng số liệu tổng hợp kết quả nghiên cứu

Tham số / Tiêu chí đánh giá	Giá trị thực nghiệm trong khóa luận	Ngưỡng yêu cầu / Tiêu chuẩn
Mô hình QSAR (SVR)
Số lượng chất tập huấn luyện ($N_{train}$)	1.309 chất (sau loại 43 ngoại lai)	-
Hệ số xác định tập huấn luyện ($R^2_{train}$)	0,99	$\ge 0,90$
Hệ số thẩm định chéo 10 lần ($Q^2_{10CV}$)	0,80	$\ge 0,80$
Kiểm tra $Y$ ngẫu nhiên ($R^2_{rand}$ / $Q^2_{rand}$)	-0,49 / -0,24	$< R^2_{train}$ / $< Q^2_{10CV}$
Số lượng chất tập kiểm tra ($N_{test}$)	329 chất ($100%$ trong miền ứng dụng)	-
Hệ số xác định tập kiểm tra ($R^2_{test}$)	0,83	$\ge 0,80$
Sai số dự đoán ($RMSE$ / $MAE$)	0,48 / 0,37	Giá trị nhỏ
Hệ số góc tương quan ($K$ / $K'$)	0,95 / 1,01	Trong khoảng $(0,85; 1,15)$
Mô hình Pharmacophore (Mô hình 3)
Tập kiểm tra đánh giá	15.892 chất (405 active + 15.487 decoy)	-
Độ chuẩn xác (Accuracy)	0,99	$\ge 0,90$
Điểm $F_{0,5}\text{ score}$	0,76	$\ge 0,70$
Hệ số tương quan Matthew (MCC)	0,75	$\ge 0,70$
Hệ số làm giàu (Enrichment Factor - EF)	30,43	Càng cao càng tốt
Điểm Güner–Henry (GH)	0,75	$\ge 0,70$
Quy trình sàng lọc ảo
Tổng số cấu trúc thiết kế ban đầu	41.592 chất (thuộc 7 dãy dẫn chất)	-
Số chất trong miền cấu trúc ứng dụng QSAR	5.025 chất	$h_i \le 0,5890$
Số chất có hoạt tính dự đoán $pIC_{50} \ge 7,00$	349 chất	$pIC_{50} \ge 7,00$
Số chất thỏa mãn mô hình Pharmacophore 3	339 chất (đều thuộc Dãy 5)	Khớp đồ thị VF2
Số chất thỏa tiêu chuẩn Lipinski và thấm qua BBB	155 chất	Vi phạm $\le 1$ quy tắc Lipinski
Số cấu trúc tiềm năng có $\Delta G < \Delta G_{PQ912}$	78 chất	$\Delta G$ âm hơn đối chứng
RMSD tái docking phối tử PBD150 trên 3PBB	0,7036 Å	$< 2,0$ Å

Đóng góp mới của khóa luận

1. Xây dựng thành công quy trình sàng lọc ảo đa tầng (multi-tiered virtual screening workflow) kết hợp máy học SVR, mô hình pharmacophore dựa trên phối tử và docking phân tử có độ tin cậy cao trên tập dữ liệu lớn các chất ức chế QC.
2. Ứng dụng phương pháp trích xuất khung phân tử HierS từ thư viện ScaffoldGraph kết hợp đột biến điểm đặc trưng (Permutation Feature Importance) để tìm ra các nhóm thế và khung cấu trúc then chốt quyết định hoạt tính ức chế enzym.
3. Thiết kế mới 41.592 dẫn xuất và sàng lọc được 78 cấu trúc tiềm năng thuộc Dãy 5 (thiết kế dựa trên dị vòng trung tâm kết hợp khung đẳng cấu sinh học và dẫn xuất indanon tương tự Donepezil), đảm bảo các tiêu chí giống thuốc, có khả năng thấm qua hàng rào máu não và năng lượng gắn kết với $sQC$ tốt hơn chất đang thử nghiệm lâm sàng PQ912.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

• Toàn bộ kết quả của đề tài dừng lại ở mức độ tính toán và mô phỏng trên máy tính (in silico); các cấu trúc đề xuất chưa được tổng hợp hóa học và thử nghiệm sinh học in vitro để xác định giá trị $IC_{50}$ hoặc $K_i$ thực nghiệm.
• Mô hình QSAR đạt hệ số $R^2_{train} = 0,99$ ở tập huấn luyện, cho thấy mô hình có mức độ khớp rất cao, có thể tiềm ẩn nguy cơ quá khớp (overfitting) đối với những không gian hóa học nằm ngoài tập dữ liệu đã nghiên cứu.
• Tập kiểm tra của mô hình pharmacophore sử dụng lượng lớn các chất mồi nhử (decoys) sinh ra bằng thuật toán mô phỏng chứ chưa bao gồm toàn bộ các chất không hoạt tính thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Lựa chọn các chất có điểm số liên kết cao nhất trong số 78 cấu trúc thuộc Dãy 5 để tiến hành tổng hợp hóa dược tại phòng thí nghiệm.
• Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym glutaminyl cyclase in vitro theo phương pháp huỳnh quang của Schilling et al. nhằm kiểm chứng độ chính xác của dự đoán in silico.
• Thực hiện mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics Simulation - MD) trong thời gian dài (100–200 ns) để đánh giá độ bền liên kết và sự thay đổi cấu dạng của phức hợp protein - phối tử trong môi trường dung môi sinh lý.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng hưởng lợi:
  • Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa dược, Dược học, Công nghệ sinh học và Hóa tin dược (Chemoinformatics / CADD).
  • Các nhóm nghiên cứu phát triển thuốc điều trị bệnh lý thoái hóa thần kinh, đặc biệt là bệnh Alzheimer hướng đích enzym Glutaminyl cyclase.
• Nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:
  • Phương pháp luận chuẩn hóa dữ liệu, mã hóa Morgan fingerprint và quy trình thẩm định mô hình QSAR hồi quy SVR theo hướng dẫn của OECD (sử dụng biểu đồ William, kiểm tra $Y$ ngẫu nhiên).
  • Kỹ thuật phân cụm cấu trúc hóa học bằng Butina Clustering và thuật toán đẳng cấu đồ thị con VF2 trong phần mềm Psearch để xây dựng mô hình pharmacophore.
  • Phương pháp khai thác khung phân tử HierS bằng ScaffoldGraph và phân tích tầm quan trọng của đặc trưng (Feature Importance) phục vụ thiết kế thuốc de novo.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao enzym Glutaminyl cyclase (QC) lại được chọn làm mục tiêu phân tử trong điều trị bệnh Alzheimer?

QC xúc tác phản ứng đóng vòng và loại nước phần dư glutamat ở đầu tận nitơ của đoạn $A\beta_{3-40/42}$ để tạo ra mảnh $pE3\text{-}A\beta$. Mảnh này bị mất điện tích, hình thành vòng lactam bền vững, có khả năng kết tập nhanh và đóng vai trò như chất mồi thúc đẩy quá trình tạo mảng bám amyloid, kích hoạt quá trình chết tế bào thần kinh theo chu trình. Ức chế QC giúp làm giảm sự hình thành $pE3\text{-}A\beta$, cải thiện nhận thức và làm chậm tiến triển bệnh Alzheimer.

2. Thuật toán học máy nào được sử dụng để xây dựng mô hình QSAR và đạt kết quả thẩm định ra sao?

Khóa luận sử dụng thuật toán Máy hỗ trợ vector hồi quy (Support Vector Regression - SVR) với hàm hạt nhân RBF, tối ưu hóa siêu tham số đạt $C = 3,0336$ và $\varepsilon = 0,0248$. Sau khi loại 43 ngoại lai qua giản đồ William, mô hình đạt độ khớp tập huấn luyện $R^2_{train} = 0,99$, thẩm định chéo $Q^2_{10CV} = 0,80$, kiểm tra $Y$ ngẫu nhiên ($R^2_{rand} = -0,49$, $Q^2_{rand} = -0,24$) và dự đoán trên tập kiểm tra độc lập 329 chất đạt $R^2_{test} = 0,83$, $RMSE = 0,48$, $MAE = 0,37$.

3. Mô hình Pharmacophore tối ưu trong nghiên cứu có những đặc điểm không gian nào?

Mô hình 3 là mô hình 4 điểm tối ưu nhất trong 8 mô hình được tạo ra, gồm 2 nhóm vòng thơm ($a$), 1 nhóm nhận liên kết hydro ($A$) và 3 cấu trúc thân dầu ($H$), trong đó 2 vòng thơm trùng vị trí không gian với 2 cấu trúc thân dầu (bán kính các nhóm là 1 Å). Khi thẩm định trên 15.892 chất, mô hình đạt độ chuẩn xác $0,99$, $F_{0,5}\text{ score} = 0,76$, $MCC = 0,75$ và hệ số làm giàu $EF = 30,43$.

4. Từ 41.592 cấu trúc thiết kế ban đầu, quy trình sàng lọc ảo đã thu hẹp lại kết quả như thế nào?

Quy trình sàng lọc qua 5 bước liên tiếp: (1) Lọc qua miền ứng dụng QSAR thu được 5.025 chất; (2) Lọc hoạt tính dự đoán $pIC_{50} \ge 7,00$ thu được 349 chất; (3) Lọc qua mô hình pharmacophore 3 thu được 339 chất (toàn bộ thuộc Dãy 5); (4) Lọc tính chất giống thuốc Lipinski và khả năng thấm BBB qua SwissADME thu được 155 chất; (5) Docking phân tử trên tinh thể $sQC$ (3PBB) thu được 78 chất có năng lượng liên kết tự do âm hơn chất đối chứng lâm sàng PQ912.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Trương Cao Minh đã xây dựng thành công hệ thống mô hình in silico tích hợp bao gồm mô hình hồi quy QSAR (SVR) và mô hình pharmacophore 4 điểm có khả năng dự đoán chính xác hoạt tính ức chế enzym Glutaminyl cyclase. Dựa trên việc phân tích khung phân tử HierS và đặc trưng cấu trúc quan trọng, nghiên cứu đã thiết kế 41.592 dẫn xuất mới và sàng lọc được 78 cấu trúc tiềm năng thuộc Dãy 5 thỏa mãn các tiêu chuẩn về dược động học (thấm qua hàng rào máu não, quy tắc Lipinski) cùng ái lực gắn kết cao trên đích phân tử $sQC$. Đây là nguồn dữ liệu khoa học có độ tin cậy cao, tạo tiền đề định hướng cho các nghiên cứu tổng hợp hóa dược và thử nghiệm hoạt tính sinh học điều trị bệnh Alzheimer trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan về QC 1. Giới thiệu về QC QC thuộc họ enzym acyltransferase phụ thuộc kim loại, xúc tác cho quá trình sửa đổi sau dịch mã ở một số protein hoặc peptid bằng cách chuyển phần dư glutamin (Gln) hoặc glutamat (Glu) ở đầu tận nitơ thành cấu trúc pyroglutamat-peptid (pE-peptid), đồng thời giải phóng một phân tử amoniac hoặc một phân tử nước tương ứng (Hình 1. QC lần đầu được phân lập vào năm 1963 bởi Michael và cộng sự sau khi quan sát thấy sự giải phóng khí amoniac khi hòa tan nhựa mủ của cây đu đủ Carica papaya trong dung dịch chứa L-glutamin và L-glutaminyl peptid [40].

Sau đó đến năm 1987, nhóm nghiên cứu của Walker báo cáo về enzym có khả năng chuyển glutaminyl-peptid thành pE- peptid ở tuyến yên, tuyến tủy thượng thận và ở một số tế bào lympho ở người [8]. Cho đến nay, hai nhóm QC đã được tìm thấy và đặt tên lần lượt là QC nhóm I (chủ yếu ở thực vật và vi khuẩn) và QC nhóm II (ở một số vi khuẩn, động vật và con người). Vai trò của QC nhóm I chưa được nghiên cứu đầy đủ, tuy nhiên nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng một số pE-peptid là sản phẩm chuyển hoá của QC nhóm I tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch, chống lại kí sinh trùng ở một số loài thực vật, hay tạo điều kiện cho kí sinh trùng sốt rét trốn thoát khỏi hệ miễn dịch ở một số chủng Plasmodium [12]. Ngược lại, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng pyroglutamat hoá của QC nhóm II được phát hiện ở đa dạng các cơ chất như hormon giải phóng gonadotropin (GnRH), hormon giải phóng thyrotropin (TRH), neurotensin, fibronectin, hoặc một số cytokin khởi động phản ứng viêm như CCL2, CX3CL1 [23, 30, 74].

Việc sửa đổi sau phiên mã tạo ra sản phẩm pE-peptid của QC nhóm II đã làm tăng tính bền vững của các cơ chất, ngăn chặn sự thủy phân từ các aminopeptidase, đồng thời làm tăng khả năng gắn kết của peptid với các receptor [12, 15]. Sự hình thành pE-peptid bởi QC 1. Mối liên quan giữa QC và bệnh Alzheimer Hiện nay, giả thuyết amyloid được coi là giả thuyết trung tâm trong cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer [29]. Giả thuyết này bắt nguồn từ việc tích tụ mảnh Aβ là mảnh peptid có nguồn gốc từ protein amyloid tiền thân (APP), một glycoprotein xuyên màng biểu hiện ở nhiều mô khác nhau và đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành, phát triển, tái tạo và tính khả biến của tế bào thần kinh [9, 11, 29].

APP được chuyển hoá theo hai con đường khác nhau: Con đường sinh amyloid (amyloidogenic pathway) và 2 con đường không sinh amyloid (non-amyloidogenic pathway). Trong con đường không sinh amyloid, enzym α-secretase cắt bỏ APP để tạo ra mảnh sAPPα đầu tận nitơ và mảnh 𝛼CTF 83 đầu tận carbon. Mảnh αCTF 83 tiếp tục được phân cắt bởi phức hợp enzym γ- secretase, giải phóng ra đoạn peptid p3 và miền nội bào APP (AICD). Ngược lại, trong con đường sinh amyloid, enzym β-secretase (BACE) chịu trách nhiệm chính trong việc chuyển hoá APP để tạo thành mảnh sAPPβ.

Phần peptid gồm 99 acid amin còn lại của APP sẽ tiếp tục được phân cắt bởi phức hợp enzym γ-secretase và giải phóng ra mảnh Aβ không tan có chiều dài từ 37 đến 42 acid amin, trong đó đáng chú ý là mảnh Aβ40 và Aβ42 [9]. Tỉ lệ Aβ42: Aβ40 tăng làm thúc đẩy quá trình tích tụ mảnh Aβ42, các mảnh đó sẽ kết tập, kéo dài và dần hình thành nên mảng bám amyloid [22]. Đây chính là trung tâm của rất nhiều con đường bệnh sinh khác nhau của bệnh Alzheimer, bao gồm tăng cường phosphoryl hoá protein tau hình thành đám rối thần kinh tau, kích hoạt quá trình stress oxy hoá gây tổn thương viêm lan rộng, hoạt hoá receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA) gây độc tế bào thần kinh… từ đó dẫn tới sự chết theo chu trình của tế bào thần kinh, tổn thương khớp thần kinh hay thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh [55, 77]. Năm 1985, khi thực hiện nghiên cứu mảnh A𝛽 được phân lập từ mảng bám amyloid ở những bệnh nhân Alzheimer, Masters và cộng sự nhận thấy sự bất thường trong cấu trúc ở đầu tận nitơ khi tới 64% mảnh A𝛽 bắt đầu từ phenylalanin (Phe) ở vị trí số 4 [39].

Ngay sau đó, vào năm 1986, nhóm nghiên cứu của Selkoe báo cáo về việc không thu được mảnh peptid có chứa đầu tận nitơ nào sau khi tinh chế mảng bám amyloid, gợi ý rằng có thể đầu tận nitơ đã bị khóa bởi một cấu trúc hoá học nào đó [76]. Giả thuyết trên đã được kiểm chứng vào năm 1992 bởi Mori và cộng sự khi đã phát hiện sự tồn tại của cấu trúc pyroglutamat ở đầu tận nitơ của khoảng 15-20% mảnh A𝛽, hay được biết đến là mảnh pE3-A𝛽, từ đó mở ra nhiều nghiên cứu sâu hơn về vai trò của mảnh trên trong cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer [54]. Mảnh pE3-A𝛽 có nguồn gốc từ các mảnh A𝛽 có chiều dài 40 hoặc 42 acid amin (A𝛽 1-40/42) tạo ra nhờ quá trình phân cắt APP nhờ enzym BACE và phức hợp enzym γ- secretase. Sau khi được giải phóng vào khe synap từ các tế bào thần kinh, mảnh A𝛽 sẽ được xử lý bằng cách được loại bỏ lần lượt hai acid amin ở đầu tận nitơ lần lượt là aspartat (Asp) và alanin (Ala) bởi một số enzym như aminopeptidase A (APA), merpin- 𝛽 hoặc dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), tạo ra sản phẩm là mảnh A𝛽 3-40/42 có chứa Glu ở đầu tận nitơ.

Sau đó, QC sẽ thực hiện phản ứng đóng vòng và loại nước để chuyển Glu thành pyroglutamat ở đầu tận nitơ, tạo ra sản phẩm pE3-A𝛽 (Hình 1. Do đã bị mất đi hai điện tích âm và một điện tích dương, đồng thời đầu tận nitơ hình thành cấu trúc vòng lactam nên mảnh pE3-A𝛽 sẽ có xu hướng kết tập với nhau dễ dàng hơn, nhanh hơn và ổn định hơn, đặc biệt là trước tác động của một số peptidase [3]. Khi nghiên cứu về cấu trúc bậc 2 các mảnh A𝛽, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng 3 mảnh pE3-A𝛽 có khả năng hình thành cấu trúc nếp gấp beta dễ dàng hơn các đoạn peptid có độ dài hoàn chỉnh, từ đó cho thấy mảnh pE3-A𝛽 hoạt động như một “chất mồi” (seed species), có thể tự kết tập hoặc kết tập với các mảnh A𝛽 có độ dài khác nhau, thúc đẩy quá trình oligomer hoá để tạo nên mảng bám amyloid. Tuy nhiên, do tốc độ oligomer hoá nhanh dẫn tới việc hình thành nên các đoạn peptid được cuộn gập bất thường (misfolded peptide), từ đó ức chế điện thế hoá dài hạn (long-term potentiation) ở các tế bào thần kinh vùng hồi hải mã.

Bên cạnh đó, pE3-A𝛽 hoạt động như một chất ức chế sự hình thành sợi cơ (fibrillogenesis) ở các mảnh A𝛽 1-40/42, từ đó có thể duy trì ở dạng oligomer hoặc dạng tiền sợi cơ (prefibrillar) có khả năng gây độc các tế bào thần kinh. Một số ảnh hưởng khác của pE3-A𝛽 tới cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer có thể kể đến như khả năng kích hoạt thúc đẩy quá trình chết của tế bào theo chương trình (apoptosis) và quá trình hoại tử ở các tế bào thần kinh đệm hình sao thông qua việc hoạt hoá caspase, thay đổi tính thấm của màng tế bào hay tạo ra các cytokin gây viêm [66]. Cơ chế hình thành pE3-A𝛽 [27] 1. Đặc điểm cấu trúc của QC ở người QC ở người (hQC) thuộc QC nhóm II, biểu hiện cao ở hệ thần kinh như trong tế bào urocortin-1, nhân Edinger-Westphal của hệ cholinergic, nhân xanh (locus coerulus) và hạt nhân cơ bản Meynert (nucleus basalis Meynert) [52].

Sự phân bố khác nhau của hQC trong tế bào dẫn tới việc hình thành nên hai dạng isoform, cụ thể là hQC phân bố trong túi bài tiết (sQC, mã hoá bởi gen QPCT) và hQC phân bố trong thể golgi (gQC hoặc isoQC, mã hoá bởi gen QPCTL). Hai dạng isoform trên có trình tự các acid amin giống nhau tới hơn 45% với kích cỡ của trung tâm hoạt động gần tương tự nhau (gồm khoảng 330 acid amin). Tuy nhiên, do sự phân bố ở các tế bào và các mô là khác nhau nên hai isoform trên hoạt động với các cơ chất khác nhau, do đó chúng đóng vai trò sinh lý và bệnh lý khác nhau trong cơ thể [4, 13, 90]. Hai dạng isoform của hQC đều có cấu trúc hình cầu với trung tâm là một nếp gấp beta gồm 6 sợi, trong đó có 2 sợi phản song song, nằm giữa cấu trúc gồm hai và sáu 4 xoắn alpha ở hai phía đối diện nhau (Hình 1.

Phần còn lại của protein chứa các cấu trúc xoắn 310 và các vòng lặp phi cấu trúc (unstructured loops) (Hình 1. Trung tâm hoạt động của cả hai dạng isoform đều chứa ion Zn2+, hình thành phức tứ diện với ba acid amin là aspartat (Asp), glutamat (Glu), histidin (His) (Asp159, Glu202 và His330 ở sQC; Asp186, Glu226 và His351 ở gQC) và một nguyên tử nước (Hình 1. Đối với sQC, trung tâm hoạt động được giới hạn bởi hai phần dư tryptophan (Trp) là Trp207 và Trp329, hơn nữa sự định hướng của Trp207 trong không gian sẽ quyết định cấu dạng của trung tâm hoạt động. Cụ thể, khi khung indol của Trp207 quay về hướng cơ chất thì trung tâm hoạt động tồn tại ở dạng cấu hình A (cấu hình mở), ngược lại đối với cấu hình B (cấu hình đóng) thì khung indol sẽ định hướng về phía ion Zn2+.

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi tồn tại ở cấu hình A, thể tích của trung tâm hoạt động sẽ tăng lên, tạo thuận lợi cho việc hình thành sản phẩm đã được đóng vòng. Đối với gQC, vai trò của 5 vòng lặp quanh trung tâm hoạt động, đặc biệt là vòng lặp 2 chứa lysin (Lys) từ Lys229 đến Lys234 đã làm tăng đáng kể thể tích trung tâm hoạt động của gQC so với của sQC. Bên cạnh đó, ba acid amin (Glu201, Asp248 và Asp305 ở sQC; Glu225, Asp269 và Asp326 ở gQC) hình thành mạng lưới liên kết hydro với nhau, có khả năng làm ổn định trạng thái chuyển tiếp của cơ chất và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xúc tác của enzym. Mạng lưới liên kết hydro trên dễ dàng bị phá vỡ khi liên kết cis peptid giữa Asp thuộc phức tứ diện của ion Zn2+ và phần dư serin (Ser) kế cạnh không được hình thành (Asp159 và Ser160 ở sQC; Asp186 và Ser187 ở gQC), từ đó cho thấy vai trò của các phần dư Ser trên đối với hoạt tính [90].