CHƯƠNG 1. Tổng quan về QC 1. Giới thiệu về QC QC thuộc họ enzym acyltransferase phụ thuộc kim loại, xúc tác cho quá trình sửa đổi sau dịch mã ở một số protein hoặc peptid bằng cách chuyển phần dư glutamin (Gln) hoặc glutamat (Glu) ở đầu tận nitơ thành cấu trúc pyroglutamat-peptid (pE-peptid), đồng thời giải phóng một phân tử amoniac hoặc một phân tử nước tương ứng (Hình 1. QC lần đầu được phân lập vào năm 1963 bởi Michael và cộng sự sau khi quan sát thấy sự giải phóng khí amoniac khi hòa tan nhựa mủ của cây đu đủ Carica papaya trong dung dịch chứa L-glutamin và L-glutaminyl peptid [40].
Sau đó đến năm 1987, nhóm nghiên cứu của Walker báo cáo về enzym có khả năng chuyển glutaminyl-peptid thành pE- peptid ở tuyến yên, tuyến tủy thượng thận và ở một số tế bào lympho ở người [8]. Cho đến nay, hai nhóm QC đã được tìm thấy và đặt tên lần lượt là QC nhóm I (chủ yếu ở thực vật và vi khuẩn) và QC nhóm II (ở một số vi khuẩn, động vật và con người). Vai trò của QC nhóm I chưa được nghiên cứu đầy đủ, tuy nhiên nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng một số pE-peptid là sản phẩm chuyển hoá của QC nhóm I tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch, chống lại kí sinh trùng ở một số loài thực vật, hay tạo điều kiện cho kí sinh trùng sốt rét trốn thoát khỏi hệ miễn dịch ở một số chủng Plasmodium [12]. Ngược lại, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng pyroglutamat hoá của QC nhóm II được phát hiện ở đa dạng các cơ chất như hormon giải phóng gonadotropin (GnRH), hormon giải phóng thyrotropin (TRH), neurotensin, fibronectin, hoặc một số cytokin khởi động phản ứng viêm như CCL2, CX3CL1 [23, 30, 74].
Việc sửa đổi sau phiên mã tạo ra sản phẩm pE-peptid của QC nhóm II đã làm tăng tính bền vững của các cơ chất, ngăn chặn sự thủy phân từ các aminopeptidase, đồng thời làm tăng khả năng gắn kết của peptid với các receptor [12, 15]. Sự hình thành pE-peptid bởi QC 1. Mối liên quan giữa QC và bệnh Alzheimer Hiện nay, giả thuyết amyloid được coi là giả thuyết trung tâm trong cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer [29]. Giả thuyết này bắt nguồn từ việc tích tụ mảnh Aβ là mảnh peptid có nguồn gốc từ protein amyloid tiền thân (APP), một glycoprotein xuyên màng biểu hiện ở nhiều mô khác nhau và đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành, phát triển, tái tạo và tính khả biến của tế bào thần kinh [9, 11, 29].
APP được chuyển hoá theo hai con đường khác nhau: Con đường sinh amyloid (amyloidogenic pathway) và 2 con đường không sinh amyloid (non-amyloidogenic pathway). Trong con đường không sinh amyloid, enzym α-secretase cắt bỏ APP để tạo ra mảnh sAPPα đầu tận nitơ và mảnh 𝛼CTF 83 đầu tận carbon. Mảnh αCTF 83 tiếp tục được phân cắt bởi phức hợp enzym γ- secretase, giải phóng ra đoạn peptid p3 và miền nội bào APP (AICD). Ngược lại, trong con đường sinh amyloid, enzym β-secretase (BACE) chịu trách nhiệm chính trong việc chuyển hoá APP để tạo thành mảnh sAPPβ.
Phần peptid gồm 99 acid amin còn lại của APP sẽ tiếp tục được phân cắt bởi phức hợp enzym γ-secretase và giải phóng ra mảnh Aβ không tan có chiều dài từ 37 đến 42 acid amin, trong đó đáng chú ý là mảnh Aβ40 và Aβ42 [9]. Tỉ lệ Aβ42: Aβ40 tăng làm thúc đẩy quá trình tích tụ mảnh Aβ42, các mảnh đó sẽ kết tập, kéo dài và dần hình thành nên mảng bám amyloid [22]. Đây chính là trung tâm của rất nhiều con đường bệnh sinh khác nhau của bệnh Alzheimer, bao gồm tăng cường phosphoryl hoá protein tau hình thành đám rối thần kinh tau, kích hoạt quá trình stress oxy hoá gây tổn thương viêm lan rộng, hoạt hoá receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA) gây độc tế bào thần kinh… từ đó dẫn tới sự chết theo chu trình của tế bào thần kinh, tổn thương khớp thần kinh hay thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh [55, 77]. Năm 1985, khi thực hiện nghiên cứu mảnh A𝛽 được phân lập từ mảng bám amyloid ở những bệnh nhân Alzheimer, Masters và cộng sự nhận thấy sự bất thường trong cấu trúc ở đầu tận nitơ khi tới 64% mảnh A𝛽 bắt đầu từ phenylalanin (Phe) ở vị trí số 4 [39].
Ngay sau đó, vào năm 1986, nhóm nghiên cứu của Selkoe báo cáo về việc không thu được mảnh peptid có chứa đầu tận nitơ nào sau khi tinh chế mảng bám amyloid, gợi ý rằng có thể đầu tận nitơ đã bị khóa bởi một cấu trúc hoá học nào đó [76]. Giả thuyết trên đã được kiểm chứng vào năm 1992 bởi Mori và cộng sự khi đã phát hiện sự tồn tại của cấu trúc pyroglutamat ở đầu tận nitơ của khoảng 15-20% mảnh A𝛽, hay được biết đến là mảnh pE3-A𝛽, từ đó mở ra nhiều nghiên cứu sâu hơn về vai trò của mảnh trên trong cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer [54]. Mảnh pE3-A𝛽 có nguồn gốc từ các mảnh A𝛽 có chiều dài 40 hoặc 42 acid amin (A𝛽 1-40/42) tạo ra nhờ quá trình phân cắt APP nhờ enzym BACE và phức hợp enzym γ- secretase. Sau khi được giải phóng vào khe synap từ các tế bào thần kinh, mảnh A𝛽 sẽ được xử lý bằng cách được loại bỏ lần lượt hai acid amin ở đầu tận nitơ lần lượt là aspartat (Asp) và alanin (Ala) bởi một số enzym như aminopeptidase A (APA), merpin- 𝛽 hoặc dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), tạo ra sản phẩm là mảnh A𝛽 3-40/42 có chứa Glu ở đầu tận nitơ.
Sau đó, QC sẽ thực hiện phản ứng đóng vòng và loại nước để chuyển Glu thành pyroglutamat ở đầu tận nitơ, tạo ra sản phẩm pE3-A𝛽 (Hình 1. Do đã bị mất đi hai điện tích âm và một điện tích dương, đồng thời đầu tận nitơ hình thành cấu trúc vòng lactam nên mảnh pE3-A𝛽 sẽ có xu hướng kết tập với nhau dễ dàng hơn, nhanh hơn và ổn định hơn, đặc biệt là trước tác động của một số peptidase [3]. Khi nghiên cứu về cấu trúc bậc 2 các mảnh A𝛽, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng 3 mảnh pE3-A𝛽 có khả năng hình thành cấu trúc nếp gấp beta dễ dàng hơn các đoạn peptid có độ dài hoàn chỉnh, từ đó cho thấy mảnh pE3-A𝛽 hoạt động như một “chất mồi” (seed species), có thể tự kết tập hoặc kết tập với các mảnh A𝛽 có độ dài khác nhau, thúc đẩy quá trình oligomer hoá để tạo nên mảng bám amyloid. Tuy nhiên, do tốc độ oligomer hoá nhanh dẫn tới việc hình thành nên các đoạn peptid được cuộn gập bất thường (misfolded peptide), từ đó ức chế điện thế hoá dài hạn (long-term potentiation) ở các tế bào thần kinh vùng hồi hải mã.
Bên cạnh đó, pE3-A𝛽 hoạt động như một chất ức chế sự hình thành sợi cơ (fibrillogenesis) ở các mảnh A𝛽 1-40/42, từ đó có thể duy trì ở dạng oligomer hoặc dạng tiền sợi cơ (prefibrillar) có khả năng gây độc các tế bào thần kinh. Một số ảnh hưởng khác của pE3-A𝛽 tới cơ chế bệnh sinh bệnh Alzheimer có thể kể đến như khả năng kích hoạt thúc đẩy quá trình chết của tế bào theo chương trình (apoptosis) và quá trình hoại tử ở các tế bào thần kinh đệm hình sao thông qua việc hoạt hoá caspase, thay đổi tính thấm của màng tế bào hay tạo ra các cytokin gây viêm [66]. Cơ chế hình thành pE3-A𝛽 [27] 1. Đặc điểm cấu trúc của QC ở người QC ở người (hQC) thuộc QC nhóm II, biểu hiện cao ở hệ thần kinh như trong tế bào urocortin-1, nhân Edinger-Westphal của hệ cholinergic, nhân xanh (locus coerulus) và hạt nhân cơ bản Meynert (nucleus basalis Meynert) [52].
Sự phân bố khác nhau của hQC trong tế bào dẫn tới việc hình thành nên hai dạng isoform, cụ thể là hQC phân bố trong túi bài tiết (sQC, mã hoá bởi gen QPCT) và hQC phân bố trong thể golgi (gQC hoặc isoQC, mã hoá bởi gen QPCTL). Hai dạng isoform trên có trình tự các acid amin giống nhau tới hơn 45% với kích cỡ của trung tâm hoạt động gần tương tự nhau (gồm khoảng 330 acid amin). Tuy nhiên, do sự phân bố ở các tế bào và các mô là khác nhau nên hai isoform trên hoạt động với các cơ chất khác nhau, do đó chúng đóng vai trò sinh lý và bệnh lý khác nhau trong cơ thể [4, 13, 90]. Hai dạng isoform của hQC đều có cấu trúc hình cầu với trung tâm là một nếp gấp beta gồm 6 sợi, trong đó có 2 sợi phản song song, nằm giữa cấu trúc gồm hai và sáu 4 xoắn alpha ở hai phía đối diện nhau (Hình 1.
Phần còn lại của protein chứa các cấu trúc xoắn 310 và các vòng lặp phi cấu trúc (unstructured loops) (Hình 1. Trung tâm hoạt động của cả hai dạng isoform đều chứa ion Zn2+, hình thành phức tứ diện với ba acid amin là aspartat (Asp), glutamat (Glu), histidin (His) (Asp159, Glu202 và His330 ở sQC; Asp186, Glu226 và His351 ở gQC) và một nguyên tử nước (Hình 1. Đối với sQC, trung tâm hoạt động được giới hạn bởi hai phần dư tryptophan (Trp) là Trp207 và Trp329, hơn nữa sự định hướng của Trp207 trong không gian sẽ quyết định cấu dạng của trung tâm hoạt động. Cụ thể, khi khung indol của Trp207 quay về hướng cơ chất thì trung tâm hoạt động tồn tại ở dạng cấu hình A (cấu hình mở), ngược lại đối với cấu hình B (cấu hình đóng) thì khung indol sẽ định hướng về phía ion Zn2+.
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi tồn tại ở cấu hình A, thể tích của trung tâm hoạt động sẽ tăng lên, tạo thuận lợi cho việc hình thành sản phẩm đã được đóng vòng. Đối với gQC, vai trò của 5 vòng lặp quanh trung tâm hoạt động, đặc biệt là vòng lặp 2 chứa lysin (Lys) từ Lys229 đến Lys234 đã làm tăng đáng kể thể tích trung tâm hoạt động của gQC so với của sQC. Bên cạnh đó, ba acid amin (Glu201, Asp248 và Asp305 ở sQC; Glu225, Asp269 và Asp326 ở gQC) hình thành mạng lưới liên kết hydro với nhau, có khả năng làm ổn định trạng thái chuyển tiếp của cơ chất và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xúc tác của enzym. Mạng lưới liên kết hydro trên dễ dàng bị phá vỡ khi liên kết cis peptid giữa Asp thuộc phức tứ diện của ion Zn2+ và phần dư serin (Ser) kế cạnh không được hình thành (Asp159 và Ser160 ở sQC; Asp186 và Ser187 ở gQC), từ đó cho thấy vai trò của các phần dư Ser trên đối với hoạt tính [90].