CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh đái tháo đường Đái tháo đường là một loại bệnh rối loạn chuyển hóa, thể hiện qua nồng độ glucose trong máu bất thường [1]. Nguyên nhân là do sự thiếu hụt insulin hoặc tình trạng kháng insulin làm giảm khả năng đáp ứng của các cơ quan với insulin tiết ra. Sự thiếu hụt này dẫn đến lượng đường huyết trong máu tăng, gây tổn thương các bộ phận của cơ thể như mạch máu và dây thần kinh [2].
Bệnh đái tháo đường bao gồm 3 loại: đái tháo đường loại I, đái tháo đường loại II và đái tháo đường thai kỳ. Bệnh đái tháo đường loại I là do sự phá hủy hệ thống miễn dịch của cơ thể thông qua tế bào − tuyến tụy sản xuất insulin dẫn đến sự thiếu hụt insulin [3]. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị triệt để, bệnh nhân phải phụ thuộc vào việc tiêm insulin suốt đời [4]. Bệnh đái tháo đường loại II là một căn bệnh rất phổ biến, ảnh hưởng đến hơn 400 triệu người trên thế giới.
Nguyên nhân của căn bệnh này là tình trạng kháng insulin. Đối với người bình thường, insulin được giải phóng để đáp ứng kích thích của tế bào – trung gian cho sự hấp thu glucose, amino acid của các mô. Ngược lại, các mô này cung cấp thông tin cho tế bào đảo về lượng insulin cần thiết. Khi có hiện tượng kháng insulin chính là hiện tượng cơ thể người bệnh không phản ứng đúng với insulin, tế bào phải tăng tiết insulin để dung hòa lượng glucose đã nạp.
Khi tế bào không cung cấp đủ insulin cần thiết dẫn đến tăng nồng độ glucose trong máu [5]. Bên cạnh đó, các yếu tố dẫn đến sự phát triển và nguy hiểm của bệnh đái tháo đường loại II bao gồm béo phì, chế độ ăn uống không hợp lí, lười vận động [6]. Phương pháp điều trị bệnh nhân đái tháo đường loại II là sử dụng thuốc kết hợp với lối sống lành mạnh, cân bằng dinh dưỡng. Cuối cùng, bệnh đái tháo đường thai kỳ xuất hiện chủ yếu trong quá trình mang thai ở nữ giới, nguyên nhân chính là do hormone phát triển trong thời kỳ này gây ra tình trạng tăng cân và thay đổi nội tiết tố, ngăn chặn hoạt động của insulin, dẫn đến tác động tiêu cực cho mẹ và bé.
Bệnh sẽ thuyên giảm hoặc biến mất sau khi sinh con. -Glucosidase -Glucosidase là carbohydrate loại exo phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật, mô động vật và thực vật [7]. Các phản ứng có sự xúc tác của -glucosidase được thực hiện thông 1 qua cơ chế xúc tác acid-base, thường gồm các bước sau: Gắn kết chất nền: Chất nền (ví dụ, maltose hoặc p-nitrophenyl--D-glucopyranoside) gắn vào vị trí hoạt động của enzyme. Vị trí hoạt động có chứa các amino acid có chức năng quan trọng trong quá trình xúc tác.
Hoạt hóa nước: Một phân tử nước được kích hoạt trong vị trí hoạt động của enzyme và tấn công liên kết glycosidic giữa các đơn vị glucose. Một amino acid trong vị trí hoạt động thường hoạt động như một base để kích hoạt nước này. Phá vỡ liên kết glycosidic: Nước được hoạt hóa sẽ tấn công carbon của liên kết glycosidic, dẫn đến sự phá vỡ liên kết này và giải phóng glucose. Có 2 loại liên kết gồm: liên kết -1,4-glycosidic và liên kết -1,6-glycosidic.
Liên kết -1,4-glycosidic là loại liên kết chính mà -glucosidase thủy phân, có mặt trong các carbohydrate như maltose, maltotriose, và các chuỗi dài hơn như amylose, một thành phần của tinh bột. Quá trình thủy phân này thủy phân các phân tử glucose đơn lẻ. Ngoài ra, một số dạng enzyme khác có khả năng thủy phân liên kết -1,6-glycosidic với hiệu quả thấp hơn. Liên kết này xuất hiện chủ yếu tại các điểm phân nhánh của amylopectin, một loại tinh bột phân nhánh và glycogen.
Giải phóng sản phẩm: Sau khi liên kết bị phá vỡ, glucose hoặc một phân tử nhỏ hơn được giải phóng khỏi enzyme và enzyme sẵn sàng tham gia vào một chu kì xúc tác mới. Do đó, -glucosidase là một loại enzyme rất quan trọng trong việc thủy phân các carbohydrate phức tạp thành đơn vị glucose, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa và hấp thu năng lượg của cơ thể (hình 1. Chuyển đổi oligosaccharide thành glucose 2 Vì vậy, một trong những phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả nhất hiện nay là làm giảm việc sản xuất và hấp thu glucose bằng cách ức chế các enzyme thực hiện chức năng phân giải carbohydrate như -glucosidase. Thuốc ức chế -glucosidase được sử dụng phổ biến ở người gồm 3 loại: acarbose, miglitol và voglibose (hình 1.
Ngoài ra, theo các nghiên cứu dịch tễ học, flavonoid có hiệu quả trong việc điều trị bệnh đái tháo đường [8]. Cấu trúc hóa học của acarbose, miglitol, voglibose 1. Acarbose Acarbose là một oligosaccharide phức tạp (hình 1.3), bao gồm một nửa acarviosine và đơn vị maltose được phân lập từ Actinoplanes sp. [9] và Streptomyces sp.
Acarbose gây ức chế cạnh tranh đối với -glucosidase ở ruột non, giúp làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrate và sucrose (một disaccharide cấu tạo từ glucose và fructose). Điều này, dẫn đến nồng độ glucose trong máu tăng ít hơn [11]. Tuy nhiên, acarbose có thể gây ra tác dụng phụ thường gặp như đầy hơi, chướng bụng, khó tiêu hóa ở dạ dày, tiêu chảy nhẹ, nặng hơn là đau bụng dữ dội, táo bón ra máu và các bệnh về gan [12]. Do vậy, việc nghiên cứu, tổng hợp và tìm ra một loại chất ức chế khác có tác dụng phụ ít hơn acarbose là điều cần thiết.
Cấu trúc hóa học acarbose 1. Flavonoid Flavonoid là hợp chất tự nhiên quan trọng thuộc nhóm chất chuyển hóa thứ cấp, gồm một nhóm lớn các hợp chất polyphenolic có chứa dẫn xuất -benzopyrone [13]. Chúng được tìm thấy rộng rãi trong trái cây, thảo mộc, rau, hoa, hạt và thân [14]. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học, quá trình oxy hóa vòng carbon mà flavonoid phân thành nhiều loại (hình 1.
Mỗi loại đều mang lại giá trị y học và hoạt động sinh học khác nhau [15]. Flavonoid có nhiều lợi ích đối với thực vật và động vật. Ở thực vật, flavonoid chịu trách nhiệm tạo ra màu sắc và mùi thơm của hoa để thu hút côn trùng thụ phấn, phát tán quả giúp các loài cây mở rộng diện tích phân bố [16]. Đối với con người, flavonoid được sử dụng để kháng lại bệnh tật.
Cam thảo (rễ của Glycyrrhiza uralensis) chứa hơn 300 flavonoid, dùng để giảm đau dạ dày, loại bỏ đờm và giảm ho. Các loài thực vật thuộc chi Peganum có chứa một số alkaloid, flavonoid, v. Nó có tác dụng ức chế cholinesterase và monoamine oxidase, kháng ung thư, kháng đông máu, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng viêm [17]. Bên cạnh việc phân lập các flavonoid từ thực vật, còn có thể được tổng hợp trong phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật khác nhau như sử dụng phương pháp hỗ trợ vi sóng để tổng hợp bioflavonoid kháng lại các tế bào ung thư gan, ung thư vú [18].
Cấu trúc hóa học các nhóm thuộc flavonoid Ngoài ra, flavonoid còn nổi tiếng là hợp chất có khả năng ức chế tốt -glucosidase. Điển hình như một loại flavonol glycoside mới được phân lập từ cây Dendrobium devonianum cho thấy khả năng ức chế -glucosidase tốt hơn acarbose [19]. Anthocyanin phân lập từ đậu đen có khả năng kiểm soát bệnh béo phì nên giúp ngăn ngừa bệnh đái tháo đường loại II [20]. Thử nghiệm tác động của flavonoid được chiết xuất từ lá Warionia saharae đối với chuột bị mắc bệnh đái tháo đường, kết quả cho thấy nồng độ glucose ở chuột bị bệnh có sử dụng chiết xuất giảm hơn so với chuột bị bệnh mà không sử dụng.
Hơn nữa, việc đó còn cải thiện tình trạng tổn thương ở gan, tuyến tụy của chuột bị bệnh và có khả năng hoạt động như một chất kháng đái tháo đường hiệu quả [21]. Từ đó, cho thấy các nhóm thuộc flavonoid có tiềm năng rất lớn trong điều trị bệnh đái tháo đường. Bên cạnh đó, các nhóm thế fluoro cũng đã được chứng minh góp phần hoạt tính kháng -glucosidase [22]: 5 Cải thiện lực liên kết: Nhóm thế fluoro có thể tham gia vào liên kết hydro và các tương tác khác với vị trí hoạt động của enzyme, làm tăng ái lực liên kết của các dẫn xuất flavonol đối với -glucosidase. Điều này có thể dẫn đến khả năng ức chế tốt hơn.
Hiệu ứng điện tử: Nhóm fluoro có độ âm điện cao và sự hiện diện của chúng có thể ảnh hưởng đến sự phân bố điện tử trong phân tử flavonoid, giúp cải thiện tương tác với vị trí hoạt động của -glucosidase. Sự đa dạng cấu trúc: Việc thêm nhóm fluoro tại các vị trí khác nhau trên khung flavonoid có thể tạo ra nhiều dẫn xuất khác nhau, mỗi loại có hoạt tính ức chế riêng biệt. Sự đa dạng cấu trúc này cho phép tối ưu hóa khả năng ức chế -glucosidase thông qua nghiên cứu cấu trúc-hoạt tính. Vì vậy, trong nghiên cứu này, tôi sử dụng các dẫn xuất 7-fluoroflavonol thuộc nhóm flavonol làm chất thử.
Mục tiêu là xác định khả năng ức chế -glucosidase của các dẫn xuất, đồng thời tìm hiểu loại tương tác, cơ chế ức chế và phương trình động học bằng phương pháp đo phổ phát huỳnh quang. Chất đối chứng được sử dụng là acarbose. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế -glucosidase Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để đánh giá khả năng ức chế -glucosidase ở giai đoạn in vitro. Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp tạo màu sử dụng chất nền tổng hợp p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (pNPG).
Trong phương pháp này, chất nền pNPG không màu bị thủy phân bởi -glucosidase, giải phóng p-nitrophenol có màu vàng (hình 1. Lượng p-nitrophenol giải phóng sẽ được đo độ hấp thu ở bước sóng 405 nm. Phản ứng giữa -glucosidase và pNPG 6 Từ đó, xác định phần trăm ức chế của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol bằng công thức (1): Amẫu thử − Amẫu chứng trắng % Ức chế -glucosidase = (1 − ) 100 (%) (1) Amẫu chứng − Amẫu trắng Trong đó: Amẫu thử là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm, enzyme và pNPG. Amẫu chứng trắng là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm và pNPG.
Amẫu chứng là độ hấp thu của mẫu gồm enzyme, dung dịch đệm và pNPG. Amẫu trắng là độ hấp thu của mẫu gồm dung dịch đệm và pNPG. Sau khi xác định phần trăm ức chế ở các nồng độ khác nhau, tiến hành xây dựng đồ thị và tìm IC50 theo phương trình đồ thị. Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang Khi chiếu xạ liên tục vào phân tử có khả năng phát huỳnh quang F (fluorophore), phân tử sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F) (hình 1.