Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu hoạt tính ức chế α-glucosidase của dẫn xuất 7-fluoroflavonol

Nghiên cứu ức chế α-glucosidase từ dẫn xuất 7-fluoroflavonol trong đồ án tốt nghiệp công nghệ kỹ thuật hóa học, khám phá tiềm năng ứng dụng.

• Tác giả: Hà Thị Trúc Nhi
• Người hướng dẫn: PGS. TS Hoàng Minh Hảo
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất
• Loại tài liệu: đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh đái tháo đường
• 1.2. α-Glucosidase
• 1.2.1. Phản ứng có sự xúc tác của α-glucosidase
• 1.2.2. Các loại liên kết glycosidic
• 1.2.3. Ý nghĩa của α-glucosidase trong tiêu hóa
• 1.2.4. Thuốc ức chế α-glucosidase
• 1.3. Acarbose
• 1.4. Flavonoid
• 1.4.1. Đặc điểm và phân loại flavonoid
• 1.4.2. Lợi ích của flavonoid đối với thực vật và con người
• 1.4.3. Khả năng ức chế α-glucosidase của flavonoid
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất
• 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.2. Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol
• 2.3. Hiện tượng dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi chất ức chế
• 2.4. Động học và cơ chế ức chế α-glucosidase bởi chất ức chế
• 2.5. Hiện tượng dập tắt huỳnh quang phức chất [enzyme-ANS] bởi chất ức chế
• 2.6. Xử lý kết quả
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol
• 3.2. Hiện tượng dập tắt huỳnh quang α-glucosidase bởi TT02
• 3.3. Động học và cơ chế ức chế α-glucosidase bởi TT02. Chất đối chứng acarbose
• 3.4. Chất ức chế TT02
• 3.5. Hiện tượng dập tắt huỳnh quang phức chất [enzyme-ANS] bởi TT02
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh đái tháo đường và vai trò của α glucosidase

Bệnh đái tháo đường là một rối loạn chuyển hóa phổ biến, đặc trưng bởi nồng độ glucose trong máu cao. Nguyên nhân chính là do sự thiếu hụt insulin hoặc kháng insulin, dẫn đến tăng đường huyết và tổn thương các cơ quan như mạch máu và dây thần kinh. α-Glucosidase là enzyme quan trọng tham gia vào quá trình thủy phân carbohydrate thành glucose, làm tăng nồng độ đường trong máu. Ức chế α-glucosidase là một phương pháp hiệu quả trong điều trị bệnh đái tháo đường, giúp giảm lượng glucose hấp thụ từ thức ăn.

1.1. Cơ chế hoạt động của α glucosidase

α-Glucosidase thủy phân các liên kết glycosidic trong carbohydrate, chủ yếu là liên kết α-1,4-glycosidic, giải phóng glucose. Quá trình này bao gồm các bước: gắn kết chất nền, hoạt hóa nước, phá vỡ liên kết glycosidic và giải phóng glucose. Ức chế enzyme này giúp làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate, từ đó kiểm soát đường huyết.

1.2. Các chất ức chế α glucosidase hiện có

Các chất ức chế α-glucosidase phổ biến bao gồm acarbose, miglitol và voglibose. Acarbose là chất ức chế cạnh tranh, làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrate. Tuy nhiên, nó có thể gây tác dụng phụ như đầy hơi và khó tiêu. Do đó, việc nghiên cứu các chất ức chế mới, ít tác dụng phụ hơn là cần thiết.

II. Nghiên cứu về dẫn xuất 7 fluoroflavonol và khả năng ức chế α glucosidase

7-Fluoroflavonol là một dẫn xuất của flavonoid, có tiềm năng trong việc ức chế α-glucosidase. Flavonoid nói chung và 7-fluoroflavonol nói riêng đã được chứng minh có khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu này tập trung vào việc sàng lọc hoạt tính ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol, đồng thời tìm hiểu cơ chế và động học của quá trình ức chế.

2.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế α glucosidase

Nghiên cứu sử dụng 6 cấu trúc 7-fluoroflavonol để đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase. Kết quả cho thấy, hợp chất TT02 có hoạt tính ức chế mạnh nhất với IC50 = 264,58 µM, thấp hơn so với acarbose (IC50 = 69,71 µM). Điều này cho thấy tiềm năng của 7-fluoroflavonol trong việc phát triển các chất ức chế mới.

2.2. Cơ chế dập tắt huỳnh quang và động học ức chế

Nghiên cứu cơ chế dập tắt huỳnh quang của α-glucosidase bởi TT02 cho thấy, quá trình dập tắt chủ yếu theo cơ chế tĩnh với hằng số kết hợp Ka = 0,0057 × 10^6 M^-1. Động học ức chế cho thấy TT02 ức chế α-glucosidase theo cơ chế không cạnh tranh, với hằng số Michaelis-Menten KM = 0,39 mM và hằng số ức chế Ki = 49,47 × 10^-6 M.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này góp phần làm sáng tỏ tiềm năng của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol trong việc ức chế α-glucosidase, mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh đái tháo đường. Kết quả nghiên cứu không chỉ bổ sung thêm các chất ức chế mới mà còn cung cấp thông tin về cơ chế và động học của quá trình ức chế, hỗ trợ cho các nghiên cứu in-vivo trong tương lai.

3.1. Đóng góp khoa học

Nghiên cứu này là một trong những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính, cơ chế và động học ức chế α-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol. Kết quả nghiên cứu góp phần làm phong phú thêm hiểu biết về tiềm năng của flavonoid trong điều trị bệnh đái tháo đường.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Việc phát hiện ra hợp chất TT02 có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh mở ra tiềm năng phát triển các loại thuốc mới ít tác dụng phụ hơn so với acarbose. Nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc thiết kế và tổng hợp các chất ức chế α-glucosidase hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đái tháo đường là một trong những bệnh lý rối loạn chuyển hóa mãn tính phổ biến và nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của Hiệp hội phòng, kháng bệnh đái tháo đường thế giới (IDF) năm 2021, ước tính cứ 10 người trưởng thành thì có một người mắc bệnh. Tại Việt Nam, số lượng bệnh nhân đái tháo đường đã vượt mức 7 triệu người, trở thành gánh nặng kinh tế và y tế lớn, đồng thời là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Nguyên nhân cốt lõi của bệnh xuất phát từ sự thiếu hụt bài tiết insulin từ tế bào $\beta$ tuyến tụy hoặc tình trạng kháng insulin tại các mô đích, làm giảm khả năng thu nạp và sử dụng glucose, dẫn đến hiện tượng tăng đường huyết kéo dài. Tình trạng đường huyết tăng cao không kiểm soát gây tổn thương cấu trúc và chức năng của nhiều cơ quan quan trọng như mạch máu, tim, thận và hệ thần kinh.

Về mặt sinh hóa, enzyme $\alpha$-glucosidase (carbohydrate loại exo) đóng vai trò then chốt trong quá trình tiêu hóa carbohydrate bằng cách xúc tác thủy phân các liên kết $\alpha$-1,4-glycosidic và $\alpha$-1,6-glycosidic trong tinh bột và oligosaccharide để giải phóng glucose tự do đi vào tuần hoàn máu. Do đó, việc ức chế hoạt tính của $\alpha$-glucosidase nhằm làm chậm quá trình hấp thu glucose tại ruột non là một chiến lược điều trị hiệu quả đối với bệnh đái tháo đường loại II. Mặc dù các hoạt chất ức chế thương mại như acarbose, miglitol và voglibose đang được sử dụng lâm sàng, chúng thường đi kèm nhiều tác dụng phụ đường tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng, khó tiêu, tiêu chảy và nguy cơ ảnh hưởng chức năng gan.

Flavonoid, đặc biệt là phân nhóm flavonol, là các hợp chất polyphenolic tự nhiên có hoạt tính sinh học phong phú (kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng ung thư và kháng $\alpha$-glucosidase). Việc tổng hợp và gắn thêm các nhóm thế fluoro vào khung flavonol (dẫn xuất 7-fluoroflavonol) được kỳ vọng sẽ tăng cường ái lực liên kết hydro, cải thiện hiệu ứng điện tử và tối ưu hóa tương tác không gian với khoang hoạt động của enzyme. Từ cơ sở đó, đề tài "Sàng lọc hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất" được thực hiện nhằm tìm kiếm các phân tử ức chế mới có tiềm năng ứng dụng y dược.

Đề tài xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể như sau:

1. Xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ của 06 dẫn xuất 7-fluoroflavonol đối với enzyme $\alpha$-glucosidase.
2. Xác định cơ chế dập tắt phổ phát huỳnh quang của enzyme $\alpha$-glucosidase bởi hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất.
3. Xác định loại ức chế và các thông số động học của quá trình ức chế enzyme.
4. Xác định bản chất tương tác giữa enzyme $\alpha$-glucosidase và chất ức chế thông qua hiện tượng dập tắt huỳnh quang của phức chất [$\alpha$-glucosidase / 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS)].

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Enzyme $\alpha$-glucosidase từ nấm men (Sigma-Aldrich), chất đối chứng chuẩn acarbose, chất nền $p$-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG), đầu dò huỳnh quang 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) và 06 dẫn xuất 7-fluoroflavonol tổng hợp (KP04, KP05, NT04, NT06, NT08, TT02) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Hoàng Minh Hảo.
• Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm in vitro tại phòng thí nghiệm thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh; thời gian hoàn thành vào tháng 08/2024. Phạm vi chuyên môn tập trung vào khảo sát hoạt tính ức chế quang phổ so màu trên đĩa 96 giếng, quang phổ huỳnh quang phân tử và phân tích động học ức chế thuận nghịch.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên các khung lý thuyết hóa sinh, động học enzyme và quang hóa học huỳnh quang chuyên sâu:

• Cơ chế thủy phân của $\alpha$-glucosidase: Enzyme xúc tác cắt liên kết glycosidic thông qua cơ chế acid-base với sự tham gia của phân tử nước được hoạt hóa tại khoang xúc tác. Hoạt tính ức chế được định lượng thông qua phản ứng thủy phân cơ chất tổng hợp không màu $p$-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG) thành sản phẩm $p$-nitrophenol có màu vàng, hấp thu cực đại ở bước sóng 405 nm.
• Mô hình động học enzyme Michaelis-Menten và các mô hình tuyến tính hóa: $$\text{v} = \frac{\text{V}{\max}[\text{S}]}{\text{K}{\text{M}} + [\text{S}]}$$ Phương trình đồ thị nghịch đảo kép Lineweaver-Burk được áp dụng để xác định kiểu ức chế thuận nghịch (cạnh tranh, không cạnh tranh, kháng cạnh tranh hay hỗn tạp): $$\frac{1}{\text{v}} = \frac{\text{K}{\text{M}}}{\text{V}{\max}} \cdot \frac{1}{[\text{S}]} + \frac{1}{\text{V}{\max}}$$ Đồ thị Dixon biểu diễn sự phụ thuộc của $1/\text{v}$ theo nồng độ chất ức chế $[\text{I}]$ để xác định hằng số ức chế $\text{K}{\text{i}}$.
• Lý thuyết phát quang nội tại và dập tắt huỳnh quang protein: Enzyme $\alpha$-glucosidase phát huỳnh quang nội tại nhờ sự hiện diện của các gốc amino acid thơm (Tryptophan, Tyrosine, Phenylalanine). Quá trình dập tắt huỳnh quang được phân tích bằng phương trình Stern-Volmer: $$\frac{\text{F}0}{\text{F}} = 1 + \text{k}{\text{q}}\tau_0[\text{Q}] = 1 + \text{K}{\text{SV}}[\text{Q}]$$ Trong đó $\tau_0 = 10^{-8}\text{ s}$ là thời gian sống của fluorophore khi không có chất dập tắt; $\text{k}{\text{q}}$ là hằng số tốc độ dập tắt lưỡng phân tử. Trường hợp dập tắt tĩnh tạo phức ở trạng thái cơ bản, hằng số kết hợp $\text{K}_{\text{a}}$ và số vị trí gắn kết $n$ được xác định theo phương trình: $$\log\left(\frac{\text{F}0 - \text{F}}{\text{F}}\right) = \log \text{K}{\text{a}} + n\log[\text{Q}]$$
• Lý thuyết đầu dò huỳnh quang kỵ nước ANS: Phân tử 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) hầu như không phát huỳnh quang trong môi trường nước nhưng phát huỳnh quang mạnh khi gắn kết vào các vùng kỵ nước của protein. Hiện tượng suy giảm cường độ huỳnh quang của phức [$\alpha$-glucosidase - ANS] khi có mặt chất ức chế được dùng để xác định tương tác kỵ nước giữa chất ức chế và enzyme.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Thực nghiệm đo quang trên đĩa 96 giếng (ELISA): Dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM (pH = 6,9) được sử dụng cho toàn bộ phản ứng. Các mẫu được ủ ở 37°C trong tủ sấy đối lưu Memmert UN110.0. Đo độ hấp thu quang bằng máy ELISA JP Selecta 2100C tại bước sóng 405 nm. Phần trăm ức chế được tính toán theo công thức: $$% \text{ Ức chế} = \left(1 - \frac{\text{A}{\text{mẫu thử}} - \text{A}{\text{mẫu chứng trắng}}}{\text{A}{\text{mẫu chứng}} - \text{A}{\text{mẫu trắng}}}\right) \times 100$$
• Phương pháp quang phổ huỳnh quang: Thực hiện trên thiết bị FluoroMax-4 (Horiba, Nhật Bản) với cuvette thạch anh. Đo phổ huỳnh quang nội tại của enzyme ở bước sóng kích thích $\lambda_{\text{EX}} = 295\text{ nm}$, dải phát xạ $\lambda_{\text{EM}} = 300 - 450\text{ nm}$, độ rộng khe đo $\text{slit} = 2\text{ nm}$. Đo phổ huỳnh quang của phức [enzyme - ANS] ở $\lambda_{\text{EX}} = 375\text{ nm}$, $\lambda_{\text{EM}} = 400 - 600\text{ nm}$, $\text{slit} = 2\text{ nm}$.
• Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được đo lặp lại 3 lần ($n=3$), biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn (SD) và xử lý bằng các phần mềm Microsoft Excel 2019, Origin 2024b và GraphPad Prism 10.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về bệnh đái tháo đường, cấu trúc và chức năng xúc tác của enzyme $\alpha$-glucosidase. Tác giả phân tích cơ chế tác dụng và nhược điểm của các loại thuốc ức chế hiện hành (acarbose, miglitol, voglibose). Chương này trình bày chi tiết về nhóm hợp chất tự nhiên flavonoid, phân loại và các nghiên cứu thực nghiệm chứng minh tiềm năng kháng $\alpha$-glucosidase của các dẫn xuất flavonol.

Nội dung chương làm rõ cơ sở lý hóa của việc đưa nhóm thế fluoro vào vòng chromen-4-one: tăng độ âm điện, thay đổi mật độ điện tử, tạo tương tác liên kết hydro bổ sung và tối ưu hóa cấu trúc không gian nhằm tăng ái lực gắn kết với enzyme. Bên cạnh đó, chương 1 trình bày nền tảng lý thuyết quang phổ huỳnh quang (phát xạ của Tryptophan, Tyrosine, Phenylalanine; cơ chế dập tắt động và dập tắt tĩnh; phương trình Stern-Volmer), các mô hình động học enzyme thuận nghịch (cạnh tranh, không cạnh tranh, kháng cạnh tranh, hỗn tạp) thông qua đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon, cùng nguyên lý sử dụng chất phát huỳnh quang ANS để thăm dò tương tác kỵ nước.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ hóa chất, quy trình pha chế, thiết bị và các bước tiến hành thực nghiệm:

• Hóa chất và thiết bị: Liệt kê đầy đủ 14 danh mục hóa chất kèm số CAS và nhà sản xuất (Sigma-Aldrich, Acros Organics, Fisher Scientific, Xilong Scientific). Cấu trúc 06 dẫn xuất 7-fluoroflavonol được mô tả chi tiết: KP04 ($\text{M} = 256,05\text{ g/mol}$), KP05 ($\text{M} = 274,04\text{ g/mol}$), NT04 ($\text{M} = 286,06\text{ g/mol}$), NT06 ($\text{M} = 286,06\text{ g/mol}$), NT08 ($\text{M} = 274,04\text{ g/mol}$) và TT02 ($\text{M} = 292,03\text{ g/mol}$).
• Quy trình sàng lọc $\text{IC}_{50}$: Chuẩn bị đĩa 96 giếng chứa 4 nhóm mẫu: Mẫu trắng (MTr), Mẫu chứng (MCh), Mẫu thử (MTh) và Mẫu chứng trắng (MCt). Ủ hỗn hợp enzyme $\alpha$-glucosidase (0,3 U/mL) và chất thử trong đệm phosphate (50 mM, pH = 6,9) ở 37°C trong 30 phút; thêm $20\text{ }\mu\text{L}$ pNPG 1 mM và tiếp tục ủ 30 phút; dừng phản ứng bằng $20\text{ }\mu\text{L }\text{Na}_2\text{CO}_3$ 125 mM (ủ 5 phút); đo quang ở bước sóng 405 nm trên máy ELISA.
• Quy trình đo dập tắt huỳnh quang: Trộn $540\text{ }\mu\text{L}$ enzyme $\alpha$-glucosidase 10 U/mL với các nồng độ tăng dần của chất ức chế TT02 trong cuvette thạch anh, đo trên máy FluoroMax-4 ($\lambda_{\text{EX}} = 295\text{ nm}$, $\lambda_{\text{EM}} = 300 - 450\text{ nm}$).
• Quy trình nghiên cứu động học enzyme: Thực hiện phản ứng trên đĩa 96 giếng bằng cách khảo sát ma trận 4 nồng độ chất ức chế (acarbose và TT02) kết hợp 4 nồng độ chất nền pNPG tăng dần để thu thập dữ liệu vận tốc phản ứng $\text{v}$.
• Quy trình đo huỳnh quang phức [enzyme - ANS]: Phối trộn $500\text{ }\mu\text{L}$ $\alpha$-glucosidase 10 U/mL, $25\text{ }\mu\text{L}$ ANS 1 mM với các nồng độ TT02 khác nhau trong điều kiện tối, đo huỳnh quang ở $\lambda_{\text{EX}} = 375\text{ nm}$, $\lambda_{\text{EM}} = 400 - 600\text{ nm}$.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày toàn bộ kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình sàng lọc, đo quang phổ huỳnh quang và động học enzyme:

• Kết quả sàng lọc hoạt tính: Trong số 06 dẫn xuất 7-fluoroflavonol, chỉ có hợp chất TT02 [7-Fluoro-2-(3,4-difluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one] thể hiện khả năng ức chế $\alpha$-glucosidase với giá trị $\text{IC}{50} = 264,58\text{ }\mu\text{M}$ (tương đương $77,27\text{ }\mu\text{g/mL}$). Chất đối chứng acarbose có giá trị $\text{IC}{50} = 69,71\text{ }\mu\text{M}$ ($69,71\text{ }\mu\text{g/mL}$). Các dẫn xuất còn lại (KP04, KP05, NT04, NT06, NT08) không thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể ở dải nồng độ khảo sát.
• Kết quả dập tắt huỳnh quang của $\alpha$-glucosidase bởi TT02: Cường độ phát huỳnh quang của enzyme giảm dần khi nồng độ TT02 tăng lên. Phân tích theo phương trình Stern-Volmer cho thấy quá trình dập tắt bao gồm cả dập tắt động và dập tắt tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế do hằng số dập tắt lưỡng phân tử $\text{k}{\text{q}} = 7,63 \times 10^{11}\text{ M}^{-1}\text{s}^{-1}$ lớn hơn nhiều so với giới hạn khuếch tán thông thường ($10^{10}\text{ M}^{-1}\text{s}^{-1}$). Hằng số kết hợp $\text{K}{\text{a}} = 0,0057 \times 10^6\text{ M}^{-1}$ ($5,7 \times 10^3\text{ M}^{-1}$) và số vị trí liên kết $n \approx 1$, chứng minh tỷ lệ phản ứng kết hợp giữa enzyme và TT02 là 1:1.
• Kết quả động học và cơ chế ức chế:
  • Đối với chất đối chứng acarbose: Đồ thị Lineweaver-Burk chỉ ra giá trị $\text{K}{\text{M}}$ tăng dần khi nồng độ acarbose tăng trong khi $\text{V}{\max}$ không đổi, xác nhận acarbose là chất ức chế cạnh tranh (competitive inhibitor).
  • Đối với chất thử TT02: Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy khi tăng nồng độ TT02, giá trị $\text{K}{\text{M}}$ không đổi ($\text{K}{\text{M}} = 0,39\text{ mM}$) trong khi $\text{V}{\max}$ giảm dần. Đồ thị Dixon xác định hằng số ức chế $\text{K}{\text{i}} = 49,47 \times 10^{-6}\text{ M}$ ($49,47\text{ }\mu\text{M}$). Kết quả này khẳng định TT02 ức chế $\alpha$-glucosidase theo cơ chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition).
• Kết quả tương tác qua phức [enzyme - ANS]: Cường độ phát huỳnh quang của phức chất [$\alpha$-glucosidase - ANS] giảm khi bổ sung TT02, chứng tỏ TT02 cạnh tranh với ANS tại các vị trí kỵ nước trên enzyme, từ đó kết luận tương tác chính giữa TT02 và $\alpha$-glucosidase là tương tác kỵ nước.

---

Kết quả và đóng góp

Dưới đây là bảng tổng hợp các thông số định lượng, hoạt tính sinh học và động học enzyme được trích xuất từ khóa luận:

Thông số nghiên cứu	Chất đối chứng: Acarbose	Chất thử tiềm năng: TT02
Công thức hóa học / Tên IUPAC	Oligosaccharide	7-Fluoro-2-(3,4-difluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one
Khối lượng phân tử (g/mol)	645,60	292,03
Giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{M}$)	69,71	264,58
Giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{g/mL}$)	69,71	77,27
Cơ chế dập tắt huỳnh quang	—	Dập tắt tĩnh chiếm ưu thế (kết hợp dập tắt động)
Hằng số dập tắt $\text{k}_{\text{q}}$ ($\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$)	—	$7,63 \times 10^{11}$
Hằng số kết hợp $\text{K}_{\text{a}}$ ($\text{M}^{-1}$)	—	$0,0057 \times 10^6$ ($5,7 \times 10^3$)
Tỷ lệ kết hợp enzyme : ligand ($n$)	—	1:1
Loại ức chế enzyme	Ức chế cạnh tranh (Competitive)	Ức chế không cạnh tranh (Non-competitive)
Hằng số Michaelis-Menten $\text{K}_{\text{M}}$ (mM)	Tăng dần theo nồng độ chất ức chế	0,39 (không đổi khi đổi nồng độ chất ức chế)
Tốc độ cực đại $\text{V}_{\max}$	Không đổi	Giảm dần khi tăng nồng độ chất ức chế
Hằng số ức chế $\text{K}_{\text{i}}$ ($\mu\text{M}$)	Xác định qua đồ thị Dixon	49,47 ($49,47 \times 10^{-6}\text{ M}$)
Loại tương tác chủ đạo với enzyme	—	Tương tác kỵ nước (Hydrophobic interaction)

Danh sách cấu trúc các dẫn xuất 7-fluoroflavonol được khảo sát trong nghiên cứu:

Ký hiệu mẫu	Danh pháp hóa học IUPAC	Khối lượng phân tử (g/mol)	Hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase
KP04	7-Fluoro-3-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one	256,05	Không thể hiện hoạt tính rõ rệt
KP05	7-Fluoro-2-(2-fluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one	274,04	Không thể hiện hoạt tính rõ rệt
NT04	7-Fluoro-3-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one	286,06	Không thể hiện hoạt tính rõ rệt
NT06	7-Fluoro-3-hydroxy-2-(3-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one	286,06	Không thể hiện hoạt tính rõ rệt
NT08	7-Fluoro-2-(4-fluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one	274,04	Không thể hiện hoạt tính rõ rệt
TT02	7-Fluoro-2-(3,4-difluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one	292,03	Có hoạt tính ($\text{IC}_{50} = 264,58\text{ }\mu\text{M}$)

Đóng góp khoa học và thực tiễn:

• Về mặt khoa học: Khóa luận lần đầu tiên công bố dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase, động học enzyme và cơ chế dập tắt huỳnh quang của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol. Nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm rõ ràng về việc dẫn xuất mang nhóm 3,4-difluorophenyl (TT02) tạo liên kết kỵ nước với enzyme và ức chế theo cơ chế không cạnh tranh tại vị trí allosteric.
• Về mặt thực tiễn: Bổ sung cấu trúc 7-fluoroflavonol TT02 vào cơ sở dữ liệu các hợp chất tiềm năng định hướng phát triển thuốc hạ đường huyết; việc xác định các thông số động học ($\text{K}{\text{M}}, \text{K}{\text{i}}, \text{V}{\max}$) và thông số liên kết ($\text{K}{\text{a}}, \text{k}_{\text{q}}, n$) tạo tiền đề thuận lợi cho các nghiên cứu mô hình hóa phân tử và thử nghiệm sinh học ở mức độ in vivo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm sàng lọc in vitro trên hệ enzyme $\alpha$-glucosidase thương mại, chưa tiến hành trên các mô hình tế bào ruột hoặc động vật sống (in vivo).
• Trong 06 cấu trúc khảo sát, chỉ có duy nhất 01 dẫn xuất (TT02) thể hiện hoạt tính ức chế, 05 dẫn xuất còn lại chưa ghi nhận hoạt tính rõ rệt ở dải nồng độ thử nghiệm.
• Giá trị $\text{IC}_{50}$ của hợp chất TT02 ($264,58\text{ }\mu\text{M}$) vẫn cao hơn đáng kể so với chất đối chứng acarbose ($69,71\text{ }\mu\text{M}$), cho thấy hiệu lực ức chế in vitro ở mức độ trung bình.
• Chưa thực hiện các khảo sát về độc tính tế bào, độ hòa tan sinh học, độ bền chuyển hóa cũng như chưa có dữ liệu mô phỏng gắn kết phân tử (molecular docking) để xác định chính xác tọa độ vị trí allosteric mà TT02 liên kết.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Thiết kế và tổng hợp bổ sung các dẫn xuất đa thế trên khung 7-fluoroflavonol nhằm tối ưu hóa mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR), hướng tới việc hạ thấp giá trị $\text{IC}_{50}$.
• Ứng dụng công cụ tính toán hóa học và mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics Simulation / Docking) để xác định chính xác các amino acid tham gia tương tác kỵ nước với TT02.
• Triển khai các thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình chuột đái tháo đường nhằm đánh giá hiệu quả dung nạp glucose thực tế, dược động học và độ an toàn sinh học.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa Hữu cơ, Hóa Dược, Dược học, Công nghệ Sinh học và Hóa Sinh:

• Phương pháp sàng lọc ức chế enzyme trên đĩa 96 giếng: Cung cấp quy trình chi tiết về pha chế hệ đệm phosphate 50 mM (pH = 6,9), nồng độ enzyme, cơ chất pNPG, cách bố trí 4 loại mẫu (Trắng, Chứng, Thử, Chứng trắng) và kỹ thuật đo quang ELISA ở bước sóng 405 nm.
• Phương pháp phân tích động học enzyme: Cung cấp tài liệu thực hành chuẩn mực về việc xây dựng ma trận nồng độ chất ức chế - chất nền, thiết lập và giải tích đồ thị Lineweaver-Burk và Dixon để xác định cơ chế ức chế (cạnh tranh/không cạnh tranh) cùng các thông số $\text{K}{\text{M}}, \text{K}{\text{i}}, \text{V}_{\max}$.
• Phương pháp quang phổ huỳnh quang phân tử: Hướng dẫn ứng dụng phương trình Stern-Volmer để tính toán hằng số tốc độ dập tắt lưỡng phân tử $\text{k}{\text{q}}$, hằng số kết hợp $\text{K}{\text{a}}$, số vị trí liên kết $n$, và kỹ thuật sử dụng chất thăm dò huỳnh quang kỵ nước ANS trên thiết bị FluoroMax-4.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Trong 06 dẫn xuất 7-fluoroflavonol được sàng lọc, hợp chất nào có hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase và hiệu lực so với đối chứng acarbose ra sao?
Chỉ có duy nhất dẫn xuất TT02 [7-Fluoro-2-(3,4-difluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one] thể hiện hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase với giá trị $\text{IC}{50} = 264,58\text{ }\mu\text{M}$ ($77,27\text{ }\mu\text{g/mL}$). Hiệu lực này thấp hơn chất đối chứng thương mại acarbose ($\text{IC}{50} = 69,71\text{ }\mu\text{M}$, tương đương $69,71\text{ }\mu\text{g/mL}$). Năm dẫn xuất còn lại (KP04, KP05, NT04, NT06, NT08) không thể hiện hoạt tính rõ rệt.

2. Quá trình dập tắt huỳnh quang của enzyme $\alpha$-glucosidase bởi TT02 diễn ra theo cơ chế nào?
Quá trình dập tắt diễn ra đồng thời theo hai cơ chế dập tắt động và dập tắt tĩnh, trong đó dập tắt tĩnh chiếm ưu thế do hình thành phức chất không phát huỳnh quang ở trạng thái cơ bản. Hằng số dập tắt lưỡng phân tử đạt $\text{k}{\text{q}} = 7,63 \times 10^{11}\text{ M}^{-1}\text{s}^{-1}$ (vượt xa giới hạn dập tắt khuếch tán $10^{10}\text{ M}^{-1}\text{s}^{-1}$), hằng số kết hợp $\text{K}{\text{a}} = 0,0057 \times 10^6\text{ M}^{-1}$ ($5,7 \times 10^3\text{ M}^{-1}$) với tỷ lệ phản ứng kết hợp enzyme : TT02 là 1:1 ($n \approx 1$).

3. Hợp chất TT02 ức chế $\alpha$-glucosidase theo loại ức chế nào và các thông số động học bằng bao nhiêu?
TT02 ức chế $\alpha$-glucosidase theo cơ chế ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition), liên kết tại vị trí allosteric ngoài khoang xúc tác của enzyme. Khi tăng nồng độ TT02, giá trị $\text{K}{\text{M}}$ không thay đổi ($\text{K}{\text{M}} = 0,39\text{ mM}$) trong khi vận tốc cực đại $\text{V}{\max}$ giảm dần. Hằng số ức chế được xác định qua đồ thị Dixon là $\text{K}{\text{i}} = 49,47 \times 10^{-6}\text{ M}$ ($49,47\text{ }\mu\text{M}$). Ngược lại, acarbose ức chế theo cơ chế cạnh tranh.

4. Bằng chứng thực nghiệm nào chứng minh tương tác giữa TT02 và $\alpha$-glucosidase là tương tác kỵ nước?
Tác giả sử dụng đầu dò huỳnh quang kỵ nước 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS). Khi ANS tạo phức với các vùng kỵ nước trên $\alpha$-glucosidase, phức chất phát huỳnh quang mạnh tại dải bước sóng $400 - 600\text{ nm}$ ($\lambda_{\text{EX}} = 375\text{ nm}$). Khi đưa TT02 vào hệ, cường độ huỳnh quang của phức [$\alpha$-glucosidase - ANS] suy giảm rõ rệt, chứng minh TT02 đã cạnh tranh và chiếm chỗ tại các vị trí liên kết kỵ nước của enzyme.

5. Những amino acid nào tạo nên huỳnh quang nội tại của $\alpha$-glucosidase và thông số đo huỳnh quang được cài đặt thế nào?
Huỳnh quang nội tại của $\alpha$-glucosidase được tạo ra bởi 3 amino acid thơm có trong cấu trúc chuỗi polypeptide là Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) và Phenylalanine (Phe). Trong thí nghiệm đo dập tắt huỳnh quang nội tại, máy FluoroMax-4 được thiết lập bước sóng kích thích $\lambda_{\text{EX}} = 295\text{ nm}$, dải phát xạ $\lambda_{\text{EM}} = 300 - 450\text{ nm}$ và độ mở khe đo $\text{slit} = 2\text{ nm}$.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hà Thị Trúc Nhi đã thực hiện thành công việc sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase trên 06 dẫn xuất 7-fluoroflavonol, qua đó xác định được hợp chất tiềm năng TT02 [7-Fluoro-2-(3,4-difluorophenyl)-3-hydroxy-4H-chromen-4-one] với $\text{IC}{50} = 264,58\text{ }\mu\text{M}$. Các phân tích quang phổ và động học chuyên sâu chứng minh TT02 ức chế enzyme theo cơ chế không cạnh tranh ($\text{K}{\text{M}} = 0,39\text{ mM}, \text{K}_{\text{i}} = 49,47\text{ }\mu\text{M}$), dập tắt huỳnh quang enzyme chủ yếu theo cơ chế tĩnh với tỷ lệ kết hợp 1:1 và tương tác thông qua liên kết kỵ nước. Công trình cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm có độ tin cậy cao, đóng góp cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu phát triển thuốc điều trị đái tháo đường từ khung cấu trúc fluoroflavonol.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh đái tháo đường Đái tháo đường là một loại bệnh rối loạn chuyển hóa, thể hiện qua nồng độ glucose trong máu bất thường [1]. Nguyên nhân là do sự thiếu hụt insulin hoặc tình trạng kháng insulin làm giảm khả năng đáp ứng của các cơ quan với insulin tiết ra. Sự thiếu hụt này dẫn đến lượng đường huyết trong máu tăng, gây tổn thương các bộ phận của cơ thể như mạch máu và dây thần kinh [2].

Bệnh đái tháo đường bao gồm 3 loại: đái tháo đường loại I, đái tháo đường loại II và đái tháo đường thai kỳ. Bệnh đái tháo đường loại I là do sự phá hủy hệ thống miễn dịch của cơ thể thông qua tế bào  − tuyến tụy sản xuất insulin dẫn đến sự thiếu hụt insulin [3]. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị triệt để, bệnh nhân phải phụ thuộc vào việc tiêm insulin suốt đời [4]. Bệnh đái tháo đường loại II là một căn bệnh rất phổ biến, ảnh hưởng đến hơn 400 triệu người trên thế giới.

Nguyên nhân của căn bệnh này là tình trạng kháng insulin. Đối với người bình thường, insulin được giải phóng để đáp ứng kích thích của tế bào  – trung gian cho sự hấp thu glucose, amino acid của các mô. Ngược lại, các mô này cung cấp thông tin cho tế bào đảo  về lượng insulin cần thiết. Khi có hiện tượng kháng insulin chính là hiện tượng cơ thể người bệnh không phản ứng đúng với insulin, tế bào  phải tăng tiết insulin để dung hòa lượng glucose đã nạp.

Khi tế bào  không cung cấp đủ insulin cần thiết dẫn đến tăng nồng độ glucose trong máu [5]. Bên cạnh đó, các yếu tố dẫn đến sự phát triển và nguy hiểm của bệnh đái tháo đường loại II bao gồm béo phì, chế độ ăn uống không hợp lí, lười vận động [6]. Phương pháp điều trị bệnh nhân đái tháo đường loại II là sử dụng thuốc kết hợp với lối sống lành mạnh, cân bằng dinh dưỡng. Cuối cùng, bệnh đái tháo đường thai kỳ xuất hiện chủ yếu trong quá trình mang thai ở nữ giới, nguyên nhân chính là do hormone phát triển trong thời kỳ này gây ra tình trạng tăng cân và thay đổi nội tiết tố, ngăn chặn hoạt động của insulin, dẫn đến tác động tiêu cực cho mẹ và bé.

Bệnh sẽ thuyên giảm hoặc biến mất sau khi sinh con.  -Glucosidase -Glucosidase là carbohydrate loại exo phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật, mô động vật và thực vật [7]. Các phản ứng có sự xúc tác của -glucosidase được thực hiện thông 1 qua cơ chế xúc tác acid-base, thường gồm các bước sau: Gắn kết chất nền: Chất nền (ví dụ, maltose hoặc p-nitrophenyl--D-glucopyranoside) gắn vào vị trí hoạt động của enzyme. Vị trí hoạt động có chứa các amino acid có chức năng quan trọng trong quá trình xúc tác.

Hoạt hóa nước: Một phân tử nước được kích hoạt trong vị trí hoạt động của enzyme và tấn công liên kết glycosidic giữa các đơn vị glucose. Một amino acid trong vị trí hoạt động thường hoạt động như một base để kích hoạt nước này. Phá vỡ liên kết glycosidic: Nước được hoạt hóa sẽ tấn công carbon của liên kết glycosidic, dẫn đến sự phá vỡ liên kết này và giải phóng glucose. Có 2 loại liên kết gồm: liên kết -1,4-glycosidic và liên kết -1,6-glycosidic.

Liên kết -1,4-glycosidic là loại liên kết chính mà -glucosidase thủy phân, có mặt trong các carbohydrate như maltose, maltotriose, và các chuỗi dài hơn như amylose, một thành phần của tinh bột. Quá trình thủy phân này thủy phân các phân tử glucose đơn lẻ. Ngoài ra, một số dạng enzyme khác có khả năng thủy phân liên kết -1,6-glycosidic với hiệu quả thấp hơn. Liên kết này xuất hiện chủ yếu tại các điểm phân nhánh của amylopectin, một loại tinh bột phân nhánh và glycogen.

Giải phóng sản phẩm: Sau khi liên kết bị phá vỡ, glucose hoặc một phân tử nhỏ hơn được giải phóng khỏi enzyme và enzyme sẵn sàng tham gia vào một chu kì xúc tác mới. Do đó, -glucosidase là một loại enzyme rất quan trọng trong việc thủy phân các carbohydrate phức tạp thành đơn vị glucose, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa và hấp thu năng lượg của cơ thể (hình 1. Chuyển đổi oligosaccharide thành glucose 2 Vì vậy, một trong những phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả nhất hiện nay là làm giảm việc sản xuất và hấp thu glucose bằng cách ức chế các enzyme thực hiện chức năng phân giải carbohydrate như -glucosidase. Thuốc ức chế -glucosidase được sử dụng phổ biến ở người gồm 3 loại: acarbose, miglitol và voglibose (hình 1.

Ngoài ra, theo các nghiên cứu dịch tễ học, flavonoid có hiệu quả trong việc điều trị bệnh đái tháo đường [8]. Cấu trúc hóa học của acarbose, miglitol, voglibose 1. Acarbose Acarbose là một oligosaccharide phức tạp (hình 1.3), bao gồm một nửa acarviosine và đơn vị maltose được phân lập từ Actinoplanes sp. [9] và Streptomyces sp.

Acarbose gây ức chế cạnh tranh đối với -glucosidase ở ruột non, giúp làm chậm quá trình chuyển hóa carbohydrate và sucrose (một disaccharide cấu tạo từ glucose và fructose). Điều này, dẫn đến nồng độ glucose trong máu tăng ít hơn [11]. Tuy nhiên, acarbose có thể gây ra tác dụng phụ thường gặp như đầy hơi, chướng bụng, khó tiêu hóa ở dạ dày, tiêu chảy nhẹ, nặng hơn là đau bụng dữ dội, táo bón ra máu và các bệnh về gan [12]. Do vậy, việc nghiên cứu, tổng hợp và tìm ra một loại chất ức chế khác có tác dụng phụ ít hơn acarbose là điều cần thiết.

Cấu trúc hóa học acarbose 1. Flavonoid Flavonoid là hợp chất tự nhiên quan trọng thuộc nhóm chất chuyển hóa thứ cấp, gồm một nhóm lớn các hợp chất polyphenolic có chứa dẫn xuất -benzopyrone [13]. Chúng được tìm thấy rộng rãi trong trái cây, thảo mộc, rau, hoa, hạt và thân [14]. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học, quá trình oxy hóa vòng carbon mà flavonoid phân thành nhiều loại (hình 1.

Mỗi loại đều mang lại giá trị y học và hoạt động sinh học khác nhau [15]. Flavonoid có nhiều lợi ích đối với thực vật và động vật. Ở thực vật, flavonoid chịu trách nhiệm tạo ra màu sắc và mùi thơm của hoa để thu hút côn trùng thụ phấn, phát tán quả giúp các loài cây mở rộng diện tích phân bố [16]. Đối với con người, flavonoid được sử dụng để kháng lại bệnh tật.

Cam thảo (rễ của Glycyrrhiza uralensis) chứa hơn 300 flavonoid, dùng để giảm đau dạ dày, loại bỏ đờm và giảm ho. Các loài thực vật thuộc chi Peganum có chứa một số alkaloid, flavonoid, v. Nó có tác dụng ức chế cholinesterase và monoamine oxidase, kháng ung thư, kháng đông máu, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng viêm [17]. Bên cạnh việc phân lập các flavonoid từ thực vật, còn có thể được tổng hợp trong phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật khác nhau như sử dụng phương pháp hỗ trợ vi sóng để tổng hợp bioflavonoid kháng lại các tế bào ung thư gan, ung thư vú [18].

Cấu trúc hóa học các nhóm thuộc flavonoid Ngoài ra, flavonoid còn nổi tiếng là hợp chất có khả năng ức chế tốt -glucosidase. Điển hình như một loại flavonol glycoside mới được phân lập từ cây Dendrobium devonianum cho thấy khả năng ức chế -glucosidase tốt hơn acarbose [19]. Anthocyanin phân lập từ đậu đen có khả năng kiểm soát bệnh béo phì nên giúp ngăn ngừa bệnh đái tháo đường loại II [20]. Thử nghiệm tác động của flavonoid được chiết xuất từ lá Warionia saharae đối với chuột bị mắc bệnh đái tháo đường, kết quả cho thấy nồng độ glucose ở chuột bị bệnh có sử dụng chiết xuất giảm hơn so với chuột bị bệnh mà không sử dụng.

Hơn nữa, việc đó còn cải thiện tình trạng tổn thương ở gan, tuyến tụy của chuột bị bệnh và có khả năng hoạt động như một chất kháng đái tháo đường hiệu quả [21]. Từ đó, cho thấy các nhóm thuộc flavonoid có tiềm năng rất lớn trong điều trị bệnh đái tháo đường. Bên cạnh đó, các nhóm thế fluoro cũng đã được chứng minh góp phần hoạt tính kháng -glucosidase [22]: 5 Cải thiện lực liên kết: Nhóm thế fluoro có thể tham gia vào liên kết hydro và các tương tác khác với vị trí hoạt động của enzyme, làm tăng ái lực liên kết của các dẫn xuất flavonol đối với -glucosidase. Điều này có thể dẫn đến khả năng ức chế tốt hơn.

Hiệu ứng điện tử: Nhóm fluoro có độ âm điện cao và sự hiện diện của chúng có thể ảnh hưởng đến sự phân bố điện tử trong phân tử flavonoid, giúp cải thiện tương tác với vị trí hoạt động của -glucosidase. Sự đa dạng cấu trúc: Việc thêm nhóm fluoro tại các vị trí khác nhau trên khung flavonoid có thể tạo ra nhiều dẫn xuất khác nhau, mỗi loại có hoạt tính ức chế riêng biệt. Sự đa dạng cấu trúc này cho phép tối ưu hóa khả năng ức chế -glucosidase thông qua nghiên cứu cấu trúc-hoạt tính. Vì vậy, trong nghiên cứu này, tôi sử dụng các dẫn xuất 7-fluoroflavonol thuộc nhóm flavonol làm chất thử.

Mục tiêu là xác định khả năng ức chế -glucosidase của các dẫn xuất, đồng thời tìm hiểu loại tương tác, cơ chế ức chế và phương trình động học bằng phương pháp đo phổ phát huỳnh quang. Chất đối chứng được sử dụng là acarbose. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế -glucosidase Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để đánh giá khả năng ức chế -glucosidase ở giai đoạn in vitro. Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp tạo màu sử dụng chất nền tổng hợp p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (pNPG).

Trong phương pháp này, chất nền pNPG không màu bị thủy phân bởi -glucosidase, giải phóng p-nitrophenol có màu vàng (hình 1. Lượng p-nitrophenol giải phóng sẽ được đo độ hấp thu ở bước sóng 405 nm. Phản ứng giữa -glucosidase và pNPG 6 Từ đó, xác định phần trăm ức chế của các dẫn xuất 7-fluoroflavonol bằng công thức (1): Amẫu thử − Amẫu chứng trắng % Ức chế -glucosidase = (1 − )  100 (%) (1) Amẫu chứng − Amẫu trắng Trong đó: Amẫu thử là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm, enzyme và pNPG. Amẫu chứng trắng là độ hấp thu của mẫu gồm chất thử, dung dịch đệm và pNPG.

Amẫu chứng là độ hấp thu của mẫu gồm enzyme, dung dịch đệm và pNPG. Amẫu trắng là độ hấp thu của mẫu gồm dung dịch đệm và pNPG. Sau khi xác định phần trăm ức chế ở các nồng độ khác nhau, tiến hành xây dựng đồ thị và tìm IC50 theo phương trình đồ thị. Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang Khi chiếu xạ liên tục vào phân tử có khả năng phát huỳnh quang F (fluorophore), phân tử sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F) (hình 1.