Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hoá kháng viêm của chitooligosaccharide và dẫn xuất phenolic chitooligosaccharide

Luận án tiến sĩ nghiên cứu chuyên sâu về hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm của chitooligosaccharide và dẫn xuất phenolic. Tìm hiểu ứng dụng tiềm năng trong y sinh.

• Tác giả: Bùi Văn Hoài
• Người hướng dẫn: PGS. Ngô Đại Nghiệp
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hoá, kháng viêm của chitooligosaccharide và dẫn xuất phenolic-chitooligosaccharide
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. CHITIN, CHITOSAN, CHITOOLIGOSACCHARIDE VÀ CÁC DẪN XUẤT
• 1.1.1. Chitooligosaccharide và các dẫn xuất
• 1.2. PHƯƠNG PHÁP TẠO CHITOOLIGOSACCHARIDE TỪ CHITOSAN
• 1.2.1. Phương pháp hóa học
• 1.2.2. Phương pháp vật lý
• 1.2.3. Phương pháp enzym
• 1.3. HỢP CHẤT PHENOLIC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 1.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO DẪN XUẤT PHENOLIC - CHITOOLIGOSACCHARIDE
• 1.5. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHITOOLIGOSACCHARIDE VÀ CÁC DẪN XUẤT
• 1.5.1. Hoạt tính kháng oxy hóa
• 1.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
• 1.5.3. Hoạt tính kháng viêm
• 1.5.3.1. Khái quát viêm và các con đường tín hiệu trong đáp ứng viêm
• 1.5.3.2. Tín hiệu dẫn truyền theo con đường IκB/NF-κB và phản ứng viêm
• 1.5.3.3. Con đường tín hiệu thông qua các protein kinase hoạt hóa mitogen và phản ứng viêm
• 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 1.6.1. Các nghiên cứu ngoài nước
• 1.6.2. Các nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 2.2.2. Phương pháp tạo chitooligosaccharide
• 2.2.2.1. Phương pháp thủy phân chitosan tạo chitooligosaccharide
• 2.2.2.2. Phương pháp tạo bột chitooligosaccharide
• 2.2.3. Phương pháp tổng hợp tạo dẫn xuất COS gắn nhóm acid phenolic
• 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp có sử dụng DNS
• 2.2.5. Phân tích khối lượng phân tử của COS
• 2.2.6. Phương pháp Folin-Ciocalteu và công thức xác định hiệu quả tổng hợp
• 2.2.7. Phân tích đặc điểm dẫn xuất COS
• 2.2.8. Phương pháp xác định năng lực khử
• 2.2.9. Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH•
• 2.2.10. Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do hydroxyl •OH
• 2.2.11. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 2.2.12. Đánh giá mức độ gây độc tế bào bằng phương pháp MTT
• 2.2.13. Hoạt tính bảo vệ DNA của tế bào RAW 264.7
• 2.2.14. Hoạt tính bảo vệ protein màng thông qua hàm lượng carbonyl
• 2.2.15. Hoạt tính bảo vệ lipid màng theo phương pháp TBARS
• 2.2.16. Phương pháp Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
• 2.2.17. Phương pháp Western blot
• 2.2.18. Phương pháp Bradford
• 2.2.19. Phương pháp xác định NO
• 2.2.20. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
• 2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ TẠO CHITOOLIGOSACCHARIDE TỪ CHITOSAN
• 3.1.1. Khảo sát các thí nghiệm tại tâm của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitosan tạo COS
• 3.1.2. Kết quả tối ưu hóa
• 3.1.3. Kết quả thí nghiệm xác minh điểm tối ưu
• 3.1.4. Kết quả phân tích khối lượng phân tử COS
• 3.1.5. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun
• 3.1.6. Kết quả sấy phun tạo bột chitooligosaccharide
• 3.1.7. Đặc điểm bột COS
• 3.1.8. Khả năng bắt gốc tự do DPPH• của các phân đoạn COS
• 3.2. KẾT QUẢ TẠO DẪN XUẤT CHITOOLIGOSACCHARIDE GẮN ACID PHENOLIC
• 3.2.1. Kết quả tạo dẫn xuất COS gắn acid gallic
• 3.2.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp đến quá trình tạo dẫn xuất
• 3.2.1.2. Phân tích đặc điểm dẫn xuất GA-COS
• 3.2.2. Kết quả tạo dẫn xuất COS gắn acid syringic
• 3.2.2.1. Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp đến quá trình tạo dẫn xuất
• 3.2.2.2. Phân tích đặc điểm dẫn xuất SA-COS
• 3.2.3. Kết quả tạo dẫn xuất COS gắn acid caffeic
• 3.2.3.1. Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp đến quá trình tạo dẫn xuất
• 3.2.3.2. Phân tích đặc điểm dẫn xuất CA-COS
• 3.2.4. Kết quả tạo dẫn xuất COS gắn acid ferulic
• 3.2.4.1. Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp đến quá trình tạo dẫn xuất
• 3.2.4.2. Phân tích đặc điểm dẫn xuất FA-COS
• 3.3. HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA COS VÀ CÁC DẪN XUẤT
• 3.3.1. Năng lực khử của COS và các dẫn xuất
• 3.3.2. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH• của COS và các dẫn xuất
• 3.3.3. Hoạt tính bắt gốc tự do •OH của COS và các dẫn xuất
• 3.3.4. Khả năng gây độc tế bào của COS và các dẫn xuất
• 3.3.5. Khả năng bảo vệ DNA tế bào của COS và các dẫn xuất
• 3.3.6. Khả năng bảo vệ protein màng tế bào của COS và các dẫn xuất
• 3.3.7. Khả năng bảo vệ lipid màng tế bào của COS và các dẫn xuất
• 3.4. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA COS VÀ CÁC DẪN XUẤT
• 3.4.1. Khảo sát khả năng ức chế NO của COS và các dẫn xuất
• 3.4.2. Khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6 và TNF-α bằng phương pháp RT-PCR
• 3.4.2.1. Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện COX-2
• 3.4.2.2. Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện iNOS
• 3.4.2.3. Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện IL-1β
• 3.4.2.4. Kết quả phân tích khả năng làm giảm biểu hiện IL-6
• 3.4.2.5. Kết quả khả năng làm giảm biểu hiện TNF-α
• 3.4.3. Khảo sát mức độ làm giảm biểu hiện protein trong con đường MAPK bằng phương pháp Western blot
• 3.4.3.1. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện protein iNOS
• 3.4.3.2. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện NF-κB (p50)
• 3.4.3.3. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện NF-κB (p65)
• 3.4.3.4. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện JNK
• 3.4.3.5. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện p38
• 3.4.3.6. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện ERK1/2
• 3.4.3.7. Kết quả khảo sát khả năng làm giảm biểu hiện MNK1
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH

Tóm tắt

I. Chitooligosaccharide COS là gì Tổng quan luận án tiến sĩ

Luận án tiến sĩ này tập trung vào Chitooligosaccharide (COS), một dạng Oligosaccharide có nguồn gốc từ Chitosan. Chitosan lại là một Polysaccharide được tìm thấy trong vỏ của các loài giáp xác. COS thu hút sự chú ý lớn nhờ hoạt tính sinh học tiềm năng, đặc biệt là khả năng kháng oxi hóa và kháng viêm. Luận án này đi sâu vào việc nghiên cứu các đặc tính này, mở ra hướng đi mới trong ứng dụng COS vào lĩnh vực y sinh và thực phẩm chức năng. Stress oxi hóa và viêm là hai yếu tố chính liên quan đến nhiều bệnh mãn tính, vì vậy, việc tìm kiếm các hợp chất có khả năng chống lại chúng là vô cùng quan trọng. Luận án này sẽ làm rõ những cơ chế hoạt động của Chitooligosaccharide và mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn của nó.

1.1. Nguồn gốc và đặc tính của Chitooligosaccharide COS

Chitooligosaccharide (COS) có nguồn gốc từ chitin, polysaccharide có trong vỏ tôm, cua và các loài giáp xác khác. COS được tạo ra thông qua quá trình thủy phân chitosan, một dẫn xuất của chitin. Quá trình này có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học, vật lý hoặc enzyme. Đặc tính Chitooligosaccharide bao gồm khả năng hòa tan trong nước, trọng lượng phân tử thấp và độ nhớt thấp hơn so với chitosan, giúp chúng dễ dàng được hấp thụ và sử dụng trong cơ thể. Mức độ deacetyl hóa cũng ảnh hưởng đến tính chất của COS.

1.2. Tại sao Chitooligosaccharide COS lại được quan tâm

COS thu hút sự quan tâm lớn vì tiềm năng hoạt tính sinh học đa dạng của nó. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng COS có khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và nhiều hoạt tính khác. Những đặc tính này làm cho COS trở thành một ứng cử viên tiềm năng cho nhiều ứng dụng, bao gồm dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và nông nghiệp. COS cũng được coi là an toàn và có khả năng phân hủy sinh học, làm cho nó trở thành một lựa chọn thân thiện với môi trường.

II. Thách thức và vấn đề trong nghiên cứu về Chitooligosaccharide

Mặc dù Chitooligosaccharide (COS) hứa hẹn nhiều tiềm năng, nhưng vẫn còn những thách thức cần vượt qua trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng. Một trong những thách thức lớn nhất là sản xuất COS với quy mô lớn và chi phí hợp lý. Các phương pháp hiện tại có thể tốn kém hoặc phức tạp. Hơn nữa, cần có các nghiên cứu sâu hơn về sinh khả dụng và độc tính của COS để đảm bảo an toàn khi sử dụng. Việc tối ưu hóa quá trình sản xuất Chitooligosaccharide và cải thiện độ tinh khiết của sản phẩm cũng là những vấn đề quan trọng cần được giải quyết. Cần có nhiều nghiên cứu hơn để hiểu rõ cơ chế kháng oxi hóa và cơ chế kháng viêm của COS ở cấp độ phân tử.

2.1. Khó khăn trong quá trình chiết xuất và sản xuất Chitooligosaccharide COS

Việc chiết xuất Chitooligosaccharide (COS) từ nguồn tự nhiên và sản xuất chúng ở quy mô lớn là một thách thức. Các phương pháp thủy phân hiện tại có thể tạo ra hỗn hợp COS với các kích thước khác nhau, gây khó khăn cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm. Việc tìm kiếm các enzyme hiệu quả và thân thiện với môi trường để thủy phân chitosan cũng là một vấn đề quan trọng. Nguồn Chitooligosaccharide cũng cần được khai thác và quản lý bền vững.

2.2. Vấn đề về tính ổn định và sinh khả dụng của Chitooligosaccharide COS

Tính ổn định của COS trong các điều kiện khác nhau (ví dụ: nhiệt độ, pH) cũng là một vấn đề cần được xem xét. COS có thể bị phân hủy hoặc biến đổi trong quá trình lưu trữ hoặc chế biến, ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chúng. Sinh khả dụng của COS, tức là khả năng được hấp thụ và sử dụng bởi cơ thể, cũng là một yếu tố quan trọng cần được nghiên cứu. Cần có các phương pháp để cải thiện tính ổn định và sinh khả dụng của COS để tối đa hóa hiệu quả của chúng.

III. Phương pháp tạo Chitooligosaccharide COS và dẫn xuất phenolic

Luận án này tập trung vào hai phương pháp chính để tạo ra Chitooligosaccharide (COS) và các dẫn xuất của nó. Thứ nhất là phương pháp thủy phân chitosan, sử dụng enzyme để cắt mạch chitosan thành các đoạn COS ngắn hơn. Thứ hai là phương pháp tổng hợp hóa học để gắn các nhóm phenolic (ví dụ: axit gallic, axit caffeic) vào chuỗi COS, tạo ra các dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn. Các thử nghiệm in vitro và thử nghiệm in vivo được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa và kháng viêm của COS và các dẫn xuất này. Đánh giá hoạt tính này rất quan trọng để xác định tiềm năng ứng dụng của chúng.

3.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phân chitosan tạo Chitooligosaccharide COS

Luận án này tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện thủy phân chitosan bằng enzyme để tạo ra COS với kích thước và độ tinh khiết mong muốn. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme và thời gian phản ứng được điều chỉnh để đạt được hiệu quả thủy phân cao nhất. Quá trình sản xuất Chitooligosaccharide được theo dõi và kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo chất lượng sản phẩm. Trọng lượng phân tử của COS được phân tích để xác định thành phần và kích thước của các đoạn COS.

3.2. Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất COS gắn acid phenolic

Để tăng cường hoạt tính kháng oxi hóa và kháng viêm của COS, luận án này nghiên cứu phương pháp gắn các acid phenolic (như acid gallic, acid caffeic) vào chuỗi COS. Các phản ứng hóa học được thực hiện để tạo ra các dẫn xuất COS mới với các tính chất hóa học và tính chất vật lý khác nhau. Cấu trúc của các dẫn xuất này được xác định bằng các phương pháp phân tích hóa học để đảm bảo sự thành công của quá trình tổng hợp.

IV. Chitooligosaccharide COS dẫn xuất Kháng oxi hóa và kháng viêm

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả Chitooligosaccharide (COS) và các dẫn xuất phenolic của nó đều có hoạt tính kháng oxi hóa và kháng viêm đáng kể. COS có khả năng loại bỏ các gốc tự do, bảo vệ tế bào khỏi stress oxi hóa. Các dẫn xuất phenolic-COS cho thấy hoạt tính mạnh mẽ hơn so với COS gốc, chứng tỏ việc gắn các nhóm phenolic đã tăng cường khả năng chống lại phản ứng viêm. Nghiên cứu cũng khám phá cơ chế kháng oxi hóa và cơ chế kháng viêm của các hợp chất này ở cấp độ tế bào, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các loại thuốc và thực phẩm chức năng mới.

4.1. Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của COS và các dẫn xuất

Các phương pháp xác định năng lực khử và khả năng bắt gốc tự do (DPPH, hydroxyl) được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của COS và các dẫn xuất. Kết quả cho thấy các dẫn xuất phenolic-COS có khả năng trung hòa các gốc tự do và ngăn chặn quá trình stress oxi hóa hiệu quả hơn so với COS gốc. Chất chống oxy hóa trong COS giúp bảo vệ DNA, protein và lipid khỏi tổn thương do gốc tự do gây ra.

4.2. Nghiên cứu tác dụng kháng viêm của COS và các dẫn xuất trên tế bào

Luận án này cũng nghiên cứu tác dụng kháng viêm của COS và các dẫn xuất trên dòng tế bào RAW 264.7, một dòng tế bào miễn dịch. Kết quả cho thấy COS và các dẫn xuất có khả năng ức chế sản xuất các cytokine gây viêm (ví dụ: TNF-α, IL-6, IL-1β) và giảm biểu hiện các enzyme liên quan đến viêm (ví dụ: COX-2, iNOS). Nghiên cứu cũng khám phá các con đường tín hiệu mà COS và các dẫn xuất tác động để đạt được hiệu quả kháng viêm.

V. Ứng dụng tiềm năng của Chitooligosaccharide COS Y sinh Thực phẩm

Với những hoạt tính sinh học ưu việt, Chitooligosaccharide (COS) và các dẫn xuất của nó hứa hẹn nhiều ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực y sinh và thực phẩm. Trong y học, COS có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc điều trị các bệnh viêm, bệnh mãn tính liên quan đến stress oxi hóa. Trong ngành thực phẩm, COS có thể được sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên, kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm và tăng cường giá trị dinh dưỡng. Ngoài ra, COS còn có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp để cải thiện sức khỏe cây trồng và bảo vệ thực vật.

5.1. Chitooligosaccharide COS trong điều trị các bệnh viêm và mãn tính

Các nghiên cứu cho thấy COS có thể giúp giảm phản ứng viêm trong các bệnh như viêm khớp, viêm ruột và bệnh Alzheimer. Cơ chế kháng viêm của COS bao gồm ức chế sản xuất các cytokine gây viêm và điều hòa hoạt động của các tế bào miễn dịch. COS cũng có thể giúp bảo vệ các tế bào khỏi tổn thương do stress oxi hóa, một yếu tố quan trọng trong nhiều bệnh mãn tính.

5.2. Sử dụng Chitooligosaccharide COS trong bảo quản thực phẩm

Hoạt tính kháng khuẩn của COS có thể được sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc trong thực phẩm, kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm. COS cũng có thể giúp cải thiện tính chất của thực phẩm, chẳng hạn như độ ẩm, độ cứng và màu sắc. Việc sử dụng COS trong bảo quản thực phẩm là một giải pháp an toàn và thân thiện với môi trường so với các chất bảo quản hóa học.

VI. Kết luận và hướng phát triển nghiên cứu Chitooligosaccharide

Luận án tiến sĩ này đã đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về hoạt tính kháng oxi hóa và kháng viêm của Chitooligosaccharide (COS) và các dẫn xuất phenolic của nó. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng COS trong lĩnh vực y sinh và thực phẩm. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá an toàn và sinh khả dụng của COS ở người. Các nghiên cứu trong tương lai cũng nên tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất Chitooligosaccharide và phát triển các ứng dụng mới của COS trong các lĩnh vực khác nhau.

6.1. Các bước tiếp theo trong nghiên cứu về Chitooligosaccharide COS

Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào các thử nghiệm lâm sàng trên người để đánh giá hiệu quả của COS trong điều trị các bệnh viêm và mãn tính. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của COS ở cấp độ phân tử để phát triển các loại thuốc và thực phẩm chức năng hiệu quả hơn. Nano Chitooligosaccharide cũng là một lĩnh vực tiềm năng cần được khám phá.

6.2. Tiềm năng phát triển các sản phẩm từ Chitooligosaccharide COS

COS có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm mới trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong dược phẩm, COS có thể được sử dụng để tạo ra các loại thuốc điều trị các bệnh viêm, ung thư và bệnh tim mạch. Trong thực phẩm chức năng, COS có thể được sử dụng để tăng cường hệ miễn dịch, cải thiện sức khỏe đường ruột và chống lão hóa. Trong mỹ phẩm, COS có thể được sử dụng để làm dịu da, giảm viêm và bảo vệ da khỏi tác hại của ánh nắng mặt trời.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng stress oxy hóa phát sinh từ các tác nhân ngoại sinh (tia cực tím, khói bụi, hóa chất ô nhiễm) và các quá trình chuyển hóa nội sinh (tại ty thể, peroxisome, mạng lưới nội chất) sản sinh lượng lớn các gốc tự do dạng oxy phản ứng (ROS) và nitơ phản ứng (RNS). Sự gia tăng quá mức các gốc tự do này làm biến đổi cấu trúc màng tế bào, tổn thương DNA và kích hoạt các con đường truyền tín hiệu nội bào như MAPK và NF-κB. Quá trình này thúc đẩy sự biểu hiện quá mức của các enzym gây viêm (iNOS, COX-2) và các cytokine tiền viêm (TNF-α, IL-1β, IL-6), dẫn đến các phản ứng viêm cấp tính hoặc mãn tính, là căn nguyên của nhiều bệnh lý mạn tính nguy hiểm như ung thư, thoái hóa thần kinh, xơ vữa động mạch và đái tháo đường.

Chitosan là polymer sinh học tự nhiên, sở hữu các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa. Tuy nhiên, chitosan có khối lượng phân tử lớn và độ nhớt cao, không hòa tan trong nước ở pH trung tính và không được đường tiêu hóa của người hấp thu do thiếu hệ enzym đặc hiệu (chitinase, chitosanase). Do đó, việc cắt mạch chitosan thành chitooligosaccharide (COS) nhằm cải thiện độ tan và khả năng hấp thu là cần thiết. Mặc dù vậy, COS tự do vẫn có hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm ở mức độ vừa phải. Việc gắn kết các hợp chất acid phenolic vào khung polymer COS giúp gia tăng hoạt tính sinh học của vật liệu. Tuy nhiên, các phương pháp tổng hợp dẫn xuất trước đây chủ yếu sử dụng các tác nhân xúc tác hóa học như carbodiimide (DCC, EDC/NHS) – vốn tiềm ẩn độc tính và khó loại bỏ hoàn toàn khỏi sản phẩm. Vì vậy, việc nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sản xuất COS bằng enzym không đặc hiệu, tổng hợp dẫn xuất phenolic-COS bằng hệ xúc tác gốc tự do thân thiện môi trường và làm sáng tỏ cơ chế tác động lên các con đường tín hiệu MAPK và NF-κB là khoảng trống khoa học cần giải quyết.

Luận án tiến sĩ ngành Hóa sinh học (mã số: 62420116) của nghiên cứu sinh Bùi Văn Hoài, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Ngô Đại Nghiệp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP.HCM (năm 2023), được triển khai với các mục tiêu và nội dung cụ thể:

• Mục tiêu chung: Nghiên cứu tạo chế phẩm chitooligosaccharide và các dẫn xuất chitooligosaccharide gắn hợp chất acid phenolic có hoạt tính sinh học, làm tiền đề cho việc ứng dụng trong thực phẩm và dược phẩm.
• Các nội dung nghiên cứu chính:
  1. Nội dung 1: Khảo sát điều kiện tối ưu để tạo COS (tối ưu hóa thủy phân chitosan bằng cellulase, tối ưu hóa quá trình sấy phun tạo bột COS, phân tích đặc điểm bột COS và lựa chọn phân đoạn COS 1–10 kDa để gắn acid phenolic).
  2. Nội dung 2: Nghiên cứu tạo dẫn xuất COS (ghép 4 nhóm acid phenolic gồm acid gallic, acid syringic, acid caffeic, acid ferulic vào vòng pyranose của COS bằng hệ xúc tác redox acid ascorbic/H₂O₂; phân tích đặc điểm và cấu trúc dẫn xuất).
  3. Nội dung 3: Phân tích so sánh hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm của COS và 4 dẫn xuất phenolic-COS (khảo sát độc tính trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7; đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro; đánh giá hoạt tính kháng viêm ở mức độ biểu hiện gen bằng RT-PCR và mức độ biểu hiện protein bằng Western blot trên tế bào RAW 264.7 được cảm ứng bởi LPS).
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: Chitosan, enzym cellulase thương phẩm, 4 loại acid phenolic (acid gallic, acid syringic, acid caffeic, acid ferulic), phân đoạn COS 1–10 kDa và dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7. Các nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Thí nghiệm Thực hành (Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM) và Bộ môn Sinh hóa, Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu về chitin và chitosan từ các phát hiện ban đầu của Henry Braconnot (1811), Odier (1823), Roughet (1859), đến các ứng dụng sinh học hiện đại như thử nghiệm giảm kháng thể IgE và interleukin của Bae và cộng sự (2013). Về phương pháp phân cắt chitosan tạo COS, tác giả điểm lại ba nhóm giải pháp: phương pháp hóa học dùng acid vô cơ (hiệu suất thấp, nguy cơ độc tính theo ghi nhận của các tài liệu chuyên ngành); phương pháp vật lý bằng chiếu xạ tia gamma (chi phí năng lượng cao); và phương pháp sinh học sử dụng enzym. Luận án phân tích tính ưu việt của enzym không đặc hiệu thương mại như cellulase so với chitosanase đặc hiệu vốn có giá thành cao và khó sản xuất ở quy mô lớn.

Về tổng hợp dẫn xuất phenolic-COS, các nghiên cứu trước đây đã áp dụng nhiều giải pháp ghép cộng:

• Phương pháp sử dụng carbodiimide (DCC, EDC/NHS): Công trình của Dai-Hung Ngo và cộng sự (2011) tổng hợp dẫn xuất gallic acid-COS (G-COS) bằng xúc tác DCC, chứng minh khả năng dọn gốc tự do và ức chế NF-κB; nghiên cứu của Eom và cộng sự (2012) tổng hợp 8 dẫn xuất PA-COS bằng DCC/NHS; Vo và cộng sự (2017) khảo sát G-COS trên dòng tế bào biểu mô phổi A549; Yan Sun và cộng sự (2022) tổng hợp 6 dẫn xuất phenolic-COS bằng DCC/NHS. Điểm hạn chế chung của nhóm nghiên cứu này là sự tồn dư của xúc tác hóa học độc hại trong sản phẩm.
• Phương pháp xúc tác enzym (tyrosinase, laccase): Liu và cộng sự (2014) dùng tyrosinase gắn caffeic acid; Yang và cộng sự (2016) dùng laccase từ Pleurotus ostreatus gắn các acid cinnamic/benzoic. Hạn chế của enzym là oxy hóa acid phenolic thành o-quinone tạo liên kết Schiff-base, làm giảm một phần hoạt tính sinh học.
• Phương pháp sử dụng gốc tự do trung gian: Park và cộng sự (2018) bước đầu ứng dụng cặp xúc tác oxy hóa khử acid ascorbic/H₂O₂ để gắn acid gallic lên COS, tuy nhiên chưa tối ưu hóa toàn diện các điều kiện phản ứng và chưa khảo sát sâu trên nhiều loại acid phenolic khác nhau cũng như chưa phân tích đầy đủ các con đường truyền tín hiệu MAPK.
• Tình hình nghiên cứu trong nước: Các nghiên cứu của Ngô Đại Nghiệp và cộng sự (2012, 2013, 2014) đã tổng hợp các dẫn xuất HB-COS, HBC/CC, AE-COS, MBCOS, DMABCOS. Tuy nhiên, các công trình này chủ yếu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoặc đánh giá enzym đơn lẻ, chưa ứng dụng quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa quy trình sản xuất COS và chưa đánh giá cơ chế kháng viêm toàn diện của dẫn xuất gắn acid phenolic trên con đường MAPK và NF-κB.

Hướng nghiên cứu	Tác giả và năm công bố	Phương pháp / Tác nhân	Giới hạn ghi nhận trong văn bản
Ghép Gallic acid vào COS	Dai-Hung Ngo và cs. (2011); Vo và cs. (2017)	Xúc tác DCC trong dung môi hữu cơ	Tồn dư chất xúc tác độc hại DCC, khó loại bỏ triệt để.
Ghép 8 loại acid phenolic vào COS	Eom và cs. (2012)	Xúc tác DCC / NHS	Tồn dư xúc tác hóa học; chưa khảo sát sâu các tín hiệu nội bào.
Ghép acid phenolic bằng enzym	Liu và cs. (2014); Yang và cs. (2016)	Tyrosinase, Laccase	Oxy hóa nhóm chức phenolic thành o-quinone, làm suy giảm hoạt tính.
Ghép Gallic acid bằng gốc tự do	Park và cs. (2018)	Acid ascorbic / H₂O₂	Chưa tối ưu hóa điều kiện phản ứng; chỉ thử nghiệm trên acid gallic.
Dẫn xuất COS tại Việt Nam	Ngô Đại Nghiệp và cs. (2012–2014)	Biến tính hóa học (AE-COS, MBCOS...)	Chưa ứng dụng QHTN đa yếu tố; chưa đánh giá toàn diện con đường MAPK.

Luận án đã lựa chọn giải quyết khoảng trống: thiết lập quy trình tối ưu hóa đa yếu tố sản xuất COS bằng cellulase thương mại kết hợp sấy phun; tổng hợp có hệ thống 4 dẫn xuất phenolic-COS (GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS) thông qua hệ xúc tác gốc tự do 'OH an toàn; và làm sáng tỏ cơ chế phân tử điều hòa đồng thời hai con đường truyền tín hiệu viêm chính là NF-κB và MAPK trên mô hình đại thực bào RAW 264.7.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Luận án dựa trên nền tảng hóa sinh học polymer và sinh học phân tử tế bào:

1. Cấu trúc và phản ứng cắt mạch chitosan: Chitosan là polymer mạch thẳng cấu tạo từ các đơn phân D-glucosamine liên kết qua liên kết β-1,4-glycoside. Enzym cellulase (gồm endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase và β-glucosidase) có khả năng nhận diện và phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1,4-O-glycoside trong phân tử chitosan do sự tương đồng cấu trúc lập thể giữa chitosan và cellulose tại khung đường pyranose.
2. Cơ chế tổng hợp dẫn xuất bằng gốc tự do: Dung dịch acid ascorbic trong môi trường acid yếu phản ứng với H₂O₂ sinh ra gốc tự do hydroxyl (•OH). Gốc •OH này có hoạt tính cao, tách nguyên tử hydro từ nhóm amino (-NH₂) và hydroxyl (-OH) trên khung pyranose của COS, tạo tâm hoạt động tự do để gắn nhóm carboxyl (-COOH) của acid phenolic tạo liên kết cộng hóa trị bền vững mà không cần xúc tác carbodiimide độc hại.
3. Con đường truyền tín hiệu đáp ứng viêm: Quá trình kích hoạt đại thực bào bởi lipopolysaccharide (LPS) thông qua thụ thể TLR4 kích hoạt phức hợp IKK, dẫn đến phosphoryl hóa và phân hủy protein ức chế IκBα. Điều này giải phóng các tiểu phần NF-κB (p50 và p65) chuyển vị vào nhân tế bào. Đồng thời, dòng thác tín hiệu protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) gồm ba nhánh p38, JNK và ERK1/2 bị phosphoryl hóa kích hoạt, dẫn đến tăng cường phiên mã các gen tiền viêm (iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Thiết kế quy hoạch thực nghiệm (QHTN): Luận án áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mô hình bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) với thiết kế tâm xoay đa hợp (Central Composite Design - CCD) để tối ưu hóa quá trình thủy phân 5 yếu tố từng phần và tối ưu hóa 3 yếu tố toàn phần trong công đoạn sấy phun thu hồi bột COS.
• Phương pháp phân tích hóa lý và cấu trúc:
  • Xác định hàm lượng đường khử giải phóng bằng thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS).
  • Phân tích khối lượng phân tử và độ đa phân tán của COS bằng sắc ký gel thấm qua (GPC/HPLC).
  • Xác định hàm lượng phenolic liên kết bằng phương pháp Folin-Ciocalteu và sắc ký bản mỏng (TLC).
  • Phân tích cấu trúc dẫn xuất bằng quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR).
  • Quan sát hình thái vi cấu trúc bề mặt hạt bột bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro:
  • Đo năng lực khử (reducing power) dựa trên sự khử phức sắt Fe³⁺ thành Fe²⁺.
  • Xác định khả năng dọn gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) và gốc hydroxyl (•OH).
  • Đo mức độ bảo vệ DNA tế bào RAW 264.7 bị tổn thương do tác nhân oxy hóa bằng điện di gel agarose.
  • Xác định mức độ bảo vệ protein màng tế bào thông qua định lượng hàm lượng carbonyl.
  • Xác định mức độ bảo vệ lipid màng tế bào thông qua định lượng chất phản ứng với acid thiobarbituric (TBARS/MDA).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7:
  • Đánh giá mức độ độc tế bào bằng phương pháp đo độ hấp thụ màu MTT.
  • Định lượng nồng độ oxit nitric (NO) tiết ra môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử Griess.
  • Phân tích mức độ biểu hiện mRNA của các gen COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α bằng kỹ thuật phiên mã ngược và phản ứng chuỗi polymerase (RT-PCR).
  • Định lượng nồng độ protein tế bào bằng phương pháp Bradford.
  • Phân tích mức độ biểu hiện của các protein iNOS, NF-κB (p50, p65), JNK, p38, ERK1/2 và MNK1 bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot.
• Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê, kiểm tra sự tương thích của mô hình hồi quy và kiểm định ý nghĩa thống kê của các hệ số phương trình hồi quy.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày hệ thống cơ sở lý thuyết về nguồn gốc, cấu trúc hóa học của chitin (các dạng đồng hình α, β, γ), chitosan và chitooligosaccharide. Tác giả phân tích cơ chế phân cắt chitosan theo ba con đường (hóa học, vật lý, sinh học), trong đó khẳng định tính khả thi của enzym cellulase thương phẩm. Chương này cũng phân loại các acid phenolic tự nhiên thuộc hai nhóm chính: nhóm acid hydroxybenzoic (acid gallic, acid syringic, acid protocatechuic, acid vanillic) và nhóm acid hydroxycinnamic (acid caffeic, acid ferulic, acid p-coumaric, acid sinapinic), phân tích con đường chuyển hóa sinh học của chúng qua phản ứng liên hợp giai đoạn I và giai đoạn II trong cơ thể.

Tác giả so sánh chi tiết ba kỹ thuật ghép phenolic vào COS: phương pháp carbodiimide (dùng EDC/NHS hoặc DCC), phương pháp enzym (laccase, tyrosinase) và phương pháp gốc tự do (acid ascorbic/H₂O₂). Nội dung chương cũng cung cấp cơ chế bệnh sinh của stress oxy hóa và phản ứng viêm, chi tiết hóa các tầng tín hiệu của con đường IκB/NF-κB (vai trò của thụ thể NLRP3, IKK, IκBα, p50, p65) và con đường MAPK (gồm ba nhánh kinase p38, ERK1/2, JNK và kinase hạ nguồn MNK1). Phần cuối chương tổng kết các công trình nghiên cứu liên quan trong và ngoài nước, từ đó xác lập tính cấp thiết của đề tài.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu sinh học (chitosan, tế bào đại thực bào RAW 264.7), các chủng hóa chất chuẩn và thiết bị phân tích sử dụng. Chương này thiết lập sơ đồ khối nghiên cứu tổng quát gồm 3 giai đoạn chính: tạo COS, tổng hợp dẫn xuất phenolic-COS, và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro.

Tác giả quy định cụ thể các quy trình thực nghiệm:

1. Quy trình thủy phân và sấy phun: Bố trí ma trận quy hoạch thực nghiệm 5 yếu tố (nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, hoạt độ cellulase, thời gian) và 3 yếu tố sấy phun (nồng độ chất khô, nhiệt độ gió vào, tốc độ nhập liệu).
2. Quy trình tổng hợp 4 dẫn xuất phenolic-COS: Thiết lập phản ứng ghép acid gallic (GA), acid syringic (SA), acid caffeic (CA) và acid ferulic (FA) với COS bằng cặp xúc tác acid ascorbic/H₂O₂ ở nhiệt độ phòng.
3. Quy trình kiểm tra cấu trúc: Sắc ký bản mỏng (TLC), phổ UV-Vis, phổ ¹H-NMR và kính hiển vi SEM.
4. Quy trình sinh học phân tử và tế bào: Nuôi cấy tế bào RAW 264.7 trong môi trường DMEM; quy trình RT-PCR một bước (chuỗi trình tự mồi đặc hiệu cho COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α và điều kiện chu kỳ nhiệt); quy trình phân tích Western blot tách điện di SDS-PAGE và ủ kháng thể đặc hiệu nhận diện các protein iNOS, p50, p65, JNK, p38, ERK1/2 và MNK1.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo từng nội dung nghiên cứu:

• Tối ưu hóa sản xuất chitooligosaccharide từ chitosan: Quá trình khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (RSM) cho thấy các điều kiện tối ưu của phản ứng thủy phân chitosan bằng cellulase gồm: nồng độ cơ chất 0,76%, hoạt độ enzym cellulase 8,97 IU/g, pH 5,9, nhiệt độ 49°C và thời gian thủy phân 180 phút. Ở điều kiện này, sản phẩm COS thu được có khối lượng phân tử trung bình (MW) là 4,3 kDa qua phân tích sắc ký gel thấm qua (GPC). Quá trình sấy phun tạo bột COS đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ chất khô nhập liệu 14,3% (w/v), nhiệt độ khí vào 138°C và lưu lượng nhập liệu 5,2 mL/phút; bột COS tạo thành có kích thước hạt đồng đều dưới ảnh chụp SEM.
• Tổng hợp và xác định đặc điểm 4 dẫn xuất phenolic-COS: Đã tổng hợp thành công 4 dẫn xuất: GA-COS, SA-COS, CA-COS và FA-COS. Kết quả sắc ký lớp mỏng TLC, quang phổ UV-Vis và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ¹H-NMR chứng minh sự tạo thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm carboxyl của các acid phenolic và khung COS.
• Hoạt tính kháng oxy hóa của COS và các dẫn xuất: Cả 4 dẫn xuất phenolic-COS đều thể hiện năng lực khử và khả năng dọn gốc tự do (DPPH• và •OH) cao hơn so với COS ban đầu. Trên mô hình tế bào RAW 264.7, các dẫn xuất thể hiện khả năng bảo vệ cấu trúc tế bào vượt trội: ngăn ngừa sự đứt gãy DNA, làm giảm nồng độ carbonyl hóa protein màng và làm giảm sự tích tụ malondialdehyde (MDA) trong thử nghiệm peroxy hóa lipid màng (TBARS).
• Hoạt tính kháng viêm trên tế bào RAW 264.7 cảm ứng bởi LPS: Thử nghiệm MTT xác nhận COS và các dẫn xuất ở nồng độ khảo sát không gây độc cho tế bào đại thực bào. Các dẫn xuất thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ sự sản sinh oxit nitric (NO). Ở mức độ biểu hiện gen, kết quả RT-PCR chứng minh dẫn xuất phenolic-COS làm suy giảm rõ rệt lượng mRNA của các gen COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6 và TNF-α. Ở mức độ biểu hiện protein, phân tích Western blot khẳng định các dẫn xuất ức chế biểu hiện protein iNOS, ức chế các tiểu phần NF-κB (p50, p65) và các kinase thuộc con đường MAPK gồm ERK1/2, p38, JNK và MNK1.

Nhóm chỉ tiêu đánh giá	Phương pháp phân tích	Kết quả chính ghi nhận từ thực nghiệm
Tối ưu thủy phân tạo COS	RSM / CCD (5 yếu tố), GPC	Nồng độ cơ chất 0,76%; enzym 8,97 IU/g; pH 5,9; 49°C; 180 phút; MW đạt 4,3 kDa.
Tối ưu sấy phun tạo bột	RSM / CCD (3 yếu tố), SEM	Nồng độ chất khô 14,3%; nhiệt độ 138°C; lưu lượng 5,2 mL/phút.
Cấu trúc dẫn xuất	TLC, UV-Vis, ¹H-NMR	Gắn thành công GA, SA, CA, FA vào COS bằng xúc tác acid ascorbic/H₂O₂.
Độc tính tế bào	Thử nghiệm MTT	COS và 4 dẫn xuất không gây độc tế bào RAW 264.7 ở nồng độ khảo sát.
Kháng oxy hóa in vitro	DPPH•, •OH, DNA, Carbonyl, TBARS	4 dẫn xuất có hoạt tính dọn gốc tự do và bảo vệ DNA, protein, lipid màng cao hơn COS.
Kháng viêm (mức độ gen)	RT-PCR	Ức chế tổng hợp NO; làm giảm biểu hiện mRNA của COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α.
Kháng viêm (mức độ protein)	Western blot	Ức chế biểu hiện protein iNOS, NF-κB (p50, p65), JNK, p38, ERK1/2 và MNK1.

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết toàn bộ các kết quả đạt được về mặt công nghệ và cơ chế sinh học: hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất COS kích thước phân tử 4,3 kDa và quy trình sấy phun; thiết lập phương pháp tổng hợp 4 dẫn xuất phenolic-COS bằng xúc tác redox xanh; khẳng định hoạt tính kháng oxy hóa và cơ chế kháng viêm đa đích của các dẫn xuất trên mô hình tế bào. Đồng thời, tác giả đưa ra các kiến nghị tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo trên động vật thực nghiệm và phát triển ứng dụng chế phẩm trong các công thức sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được những đóng góp khoa học và thực tiễn cụ thể:

1. Tối ưu hóa quy trình sản xuất COS bằng enzym: Xác lập thông số tối ưu cho quá trình thủy phân chitosan bằng enzym cellulase thương phẩm (nồng độ cơ chất: 0,76%; hoạt độ cellulase: 8,97 IU/g; pH: 5,9; nhiệt độ: 49°C; thời gian: 180 phút), tạo ra sản phẩm chitooligosaccharide có khối lượng phân tử trung bình xác định là 4,3 kDa.
2. Tối ưu hóa quy trình sấy phun thu hồi sản phẩm: Xác định các thông số kỹ thuật tối ưu để thu hồi bột COS bằng công nghệ sấy phun (nồng độ chất khô: 14,3% w/v; nhiệt độ gió vào: 138°C; tốc độ nhập liệu: 5,2 mL/phút), cho sản phẩm bột có kích thước hạt đồng đều.
3. Phát triển phương pháp tổng hợp dẫn xuất xanh: Đã tổng hợp thành công 4 dẫn xuất phenolic-COS (GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS) thông qua hệ xúc tác gốc tự do acid ascorbic/H₂O₂, cung cấp giải pháp kỹ thuật an toàn thay thế cho phương pháp sử dụng xúc tác carbodiimide độc hại.
4. Làm sáng tỏ cơ chế tác động kháng viêm và kháng oxy hóa: Chứng minh các dẫn xuất phenolic-COS có hoạt tính bảo vệ toàn diện các đại phân tử sinh học (DNA, protein màng, lipid màng); làm sáng tỏ cơ chế kháng viêm thông qua việc ức chế giải phóng NO, làm giảm biểu hiện gen tiền viêm (COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α) và ức chế các phân tử tín hiệu nội bào quan trọng thuộc con đường NF-κB (p50, p65) và MAPK (iNOS, ERK1/2, p38, JNK, MNK1) trên mô hình tế bào đại thực bào RAW 264.7 cảm ứng bởi LPS.
5. Đề xuất ứng dụng: Đề xuất sử dụng COS và 4 dẫn xuất phenolic-COS làm nguồn nguyên liệu hoạt tính sinh học ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến viêm và stress oxy hóa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Các thử nghiệm hoạt tính sinh học và cơ chế phân tử của COS và các dẫn xuất phenolic-COS mới chỉ được tiến hành trên mô hình in vitro và mô hình nuôi cấy tế bào đại thực bào chuột (RAW 264.7 cảm ứng bởi LPS), chưa được khảo sát trên các mô hình động vật sống in vivo.
  • Phạm vi nghiên cứu tập trung vào phân đoạn COS 1–10 kDa và 4 hợp chất acid phenolic đại diện (gallic, syringic, caffeic, ferulic), chưa mở rộng khảo sát trên toàn bộ các hợp chất phenolic tự nhiên khác.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Tiến hành các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm (chuột) để đánh giá dược động học, độ an toàn sinh học lâu dài và hiệu quả kháng viêm đường tiêu hóa hoặc toàn thân.
  • Nghiên cứu công nghệ bào chế, độ ổn định và khả năng tương thích của bột dẫn xuất phenolic-COS trong các dạng sản phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên thuộc các chuyên ngành Hóa sinh học, Công nghệ sinh học, Hóa dược và Công nghệ thực phẩm: Cung cấp phương pháp luận quy hoạch thực nghiệm (RSM/CCD) để tối ưu hóa quá trình sinh học, quy trình phản ứng ghép hữu cơ xanh sử dụng gốc tự do, và hệ thống kỹ thuật sinh học phân tử đánh giá đường truyền tín hiệu tế bào (RT-PCR, Western blot).
• Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp phát triển sản phẩm sinh dược phẩm: Tham khảo dữ liệu thực nghiệm về thông số thủy phân cellulase, chế độ vận hành sấy phun tạo bột và các bằng chứng về cơ chế ức chế các cytokine tiền viêm nhằm định hướng phát triển các sản phẩm bổ trợ sức khỏe từ nguồn phụ phẩm giáp xác.

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện tối ưu hóa để sản xuất chitooligosaccharide (COS) bằng enzym cellulase trong luận án được xác định như thế nào?
Quá trình tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố xác định các thông số: nồng độ cơ chất 0,76%, hoạt độ enzym cellulase 8,97 IU/g chitosan, pH môi trường 5,9, nhiệt độ thủy phân 49°C và thời gian phản ứng 180 phút. Sản phẩm COS thu được có khối lượng phân tử trung bình là 4,3 kDa.

2. Vì sao luận án lựa chọn cặp xúc tác acid ascorbic/H₂O₂ để tổng hợp dẫn xuất phenolic-COS?
Các phương pháp truyền thống dùng carbodiimide (DCC, EDC/NHS) để lại dư lượng hóa chất độc hại khó loại bỏ hoàn toàn, trong khi phương pháp dùng enzym (laccase, tyrosinase) làm oxy hóa vòng thơm tạo o-quinone gây giảm hoạt tính. Cặp xúc tác oxy hóa khử acid ascorbic/H₂O₂ tạo ra gốc tự do hydroxyl (•OH) ở nhiệt độ phòng, kích hoạt phản ứng ghép nhóm carboxyl của acid phenolic vào COS mà không sinh độc tính, an toàn và thân thiện môi trường.

3. Bốn dẫn xuất phenolic-COS được tổng hợp và nghiên cứu trong luận án gồm những chất nào?
Bốn dẫn xuất được tổng hợp từ phân đoạn COS (1–10 kDa) gắn với 4 loại acid phenolic gồm: GA-COS (gắn acid gallic), SA-COS (gắn acid syringic), CA-COS (gắn acid caffeic) và FA-COS (gắn acid ferulic).

4. Khả năng kháng viêm của COS và các dẫn xuất phenolic-COS được chứng minh qua những chỉ dấu phân tử nào?
Trên mô hình tế bào đại thực bào RAW 264.7 cảm ứng bởi LPS, các dẫn xuất thể hiện khả năng làm giảm sản sinh NO; ức chế mức độ biểu hiện mRNA của 5 gen tiền viêm (COX-2, iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α qua RT-PCR); đồng thời làm giảm mức độ biểu hiện của protein iNOS, các tiểu phần phiên mã NF-κB (p50, p65) và các protein kinase thuộc con đường MAPK gồm JNK, p38, ERK1/2 và MNK1 (qua Western blot).

5. Quy trình sấy phun tạo bột COS được xác lập ở những thông số kỹ thuật nào?
Quy trình sấy phun thu hồi bột COS được tối ưu hóa với nồng độ chất khô dung dịch nhập liệu là 14,3% (w/v), nhiệt độ gió vào buồng sấy là 138°C và tốc độ bơm nhập liệu là 5,2 mL/phút.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Bùi Văn Hoài đã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất chitooligosaccharide có khối lượng phân tử trung bình 4,3 kDa từ chitosan bằng enzym cellulase thương phẩm kết hợp sấy phun. Công trình đã tổng hợp thành công 4 dẫn xuất phenolic-COS (GA-COS, SA-COS, CA-COS, FA-COS) thông qua hệ xúc tác gốc tự do acid ascorbic/H₂O₂ an toàn, thân thiện môi trường. Các kết quả thực nghiệm in vitro và sinh học phân tử đã chứng minh các dẫn xuất có khả năng bảo vệ DNA, protein, lipid màng tế bào trước stress oxy hóa và kháng viêm đa đích thông qua ức chế đồng thời hai con đường truyền tín hiệu NF-κB và MAPK trên tế bào đại thực bào RAW 264.7. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu công nghệ phục vụ định hướng ứng dụng các dẫn xuất phenolic-COS trong lĩnh vực thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN 1. Chitin, chitosan, chitooligosaccharide và các dẫn xuất 1. Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là N- acetylglucosamine (GlcNAc), và được liên kết với nhau qua liên kết B-1,4-0- glycoside. Chitin được tìm thấy trong vỏ các loài giáp xác, biểu bì côn trùng và thành tế bao nam, v.

Chitin tồn tại dưới 3 dạng hình thái là a, B, y chitin, 3 dạng này khác nhau về tính hydrat hóa và kích thước của đơn vi cấu trúc tạo thành chitin. Cấu trúc của a-chitin là các mạch được sắp xếp song song và ngược chiều, trong khi B- chitin là các mạch được sắp xếp song song và cùng chiều, và dang phức tạp y chitin được sắp xếp cứ hai mạch song song cùng chiều thì có một mạch ngược chiều [8]. Chitin được cô lập lần đầu tiên vào năm 1811, bởi nhà nghiên cứu hóa học và dược học người pháp Henry Braconnot (1787-1855), là một polysaccharide được phan lập từ nam va được đặt tên là fungine. Sau đó vào năm 1823, Odier đã tìm thấy một chất tương tự như fungine trong bộ khung xương của côn trùng và đặt tên cho chất đó là chitin.

Năm 1859, Roughet đã cho thấy chitin có thé hòa tan trong dung môi sau khi được biến đổi bang tác nhân hóa hoc. Chitin là nguyên liệu để tạo chitosan và chitooligosacchride. Chitin đã thu hút nhiều ứng dụng trong điều trị bệnh như chữa lành vết thương và được cho là một vật liệu sinh học đầy hứa hẹn cho kỹ thuật mô và công nghệ tế bào gốc [9]. Bae và cộng sự, (2013) đã cho thấy uống chitin (dạng alpha và beta) có thé mang lại lợi ích là ngăn ngừa bệnh di ứng với thực phẩm.

Nghiên cứu được tóm tắt như sau: chitin với kích thước nhỏ hơn 20 micromet được trộn với thức ăn cho chuột. Kết quả nghiên cứu trên mô hình chuột cho thấy alpha chitin làm giảm lượng đáng kế kháng thé IgE trong huyết thanh (31-47%), trong khi beta chitin không có chức năng này, cả hai dạng chitin làm giảm mức interleukin (IL) như IL4, IL5, IL10 và IL13 [10]. Kha năng ứng dụng của chitosan rộng hon chitin bởi chitosan có khả năng hòa tan tốt trong môi trường acid yếu, trong khi chitin không tan trong môi trường nước và acid [9]. Chitosan Chitosan là polymer sinh học tự nhiên, không độc hại và là một polysaccharide mạch thắng, được cấu tạo từ các đơn phân D-glucosamine liên kết với nhau qua các liên kết beta-1,4-glucoside, vì vậy chitosan còn được gọi là poly-1,4-glucosamine.

Công thức phân tử của chitosan: [CeH1104N]n và M chitosan = (161,07)n. Cấu tạo hóa học của chitosan được thê hiện hình 1. Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi acid hữu cơ. Không giống như chitin, chitosan không là thành phần của các loài động vật và hiếm khi tim thấy trong tự nhiên.

Nguôn tự nhiên cua chitin thường tim thấy trong vỏ cua, tôm, xương mực trong khi chitosan thì không tìm thấy [11]. Trong tế bào nắm thì có cả chitin lẫn chitosan tự nhiên, chúng hiện diện trong thành tế bao nam. Chitosan là thành phan quan trọng trong thành tế bào nắm Zygomycetes [12]. Chitosan tồn tại hai dạng khác nhau trong thành tế bao nắm, một là dạng chitosan tự do, hai là dang chitosan liên kết glucan [11].

Chitosan tự nhiên có thể chiết xuất trực tiếp các nguồn nguyên liệu. Chất lượng và sỐ lượng của chitosan thu nhận từ nguồn nam phụ thuộc vào loài nắm, điều kiện lên men và quy trình chiết xuất. Chitosan thu nhận từ động vật giáp xác có khối lượng phân tử cao, trong khi chitosan thu nhận từ nguồn nắm có khối lượng phân tử thấp hơn [11]. OH OH OH HO HO HO OH NH» NH» NH n Hình 1.1: Cầu trúc hóa học cua chitosan [13] Chitosan thương mại phan lớn được thu nhận từ quá trình deacetyl của chitin tự nhiên và sản lượng hàng năm vải triệu tấn [14].

Sản lượng tiêu thụ chitosan trên thị trường thế giới vượt mức 118.000 tan năm 2018 và giá trị dự kiến đạt 6.8 tỉ USD vào năm 2024 [15]. Phần lớn chitosan được sử dụng tập trung vào các lĩnh vực như mỹ phẩm, y học, phân bón hữu cơ, bé sung ché do an,. Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin bằng dung dich kiềm. Do vậy, chitosan và chitin có thể được phân biệt cơ bản dựa vao sự acetyl hóa của đơn phân D-glucosamine.

Theo quy ước nếu mức độ deacetyl > 50% thì gọi là chitosan còn nhỏ hơn 50% thì gọi là chitin. Trong dung môi acid hữu cơ như acid acetic, acid formic, acid lactic chitosan tôn tại dang muối va hòa tan. Chitosan chứa ba nhóm chức năng phản ứng chính là amino, N-acetamide va hydroxyl. Tinh chất hóa ly của chitosan phụ thuộc chủ yếu vào nhóm amino, N-acetamide [17].

Chitosan được phân loại theo mức độ deacetyl, mức độ polyme hóa và khối lượng phân tử [18]. Chitosan được sử dụng làm nguyên liệu sinh hóa bởi những hoạt tính kháng khuẩn, giảm cholesterol, giảm huyết áp, kháng viêm, kháng oxy hóa, v. Ngoài ra, chitosan là nguyên liệu rẻ tiền, dễ phân hủy sinh học, không độc vì vậy được ứng dụng rất nhiều và đa dạng trong công nghiệp thực pham [19]. Mặc dù, chitosan có nhiều chức năng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, nhưng chúng có khối lượng phân tử lớn và độ nhớt cao nên rất khó dé cơ thé người và động vật hấp thu.

Hơn nữa, chitosan không được ruột non hấp thu vì hệ tiêu hóa của động vật, đặc biệt là hệ tiêu hóa của cơ thé người không có hệ enzym chitinase và chitosanase dé thủy phân chúng thành những chất có khối lượng phân tử thấp dé cơ thé hấp thu. Vi vậy, ảnh hưởng của chitin và chitosan trong cơ thé vẫn chưa rõ ràng. Tuy nhiên, trong những năm gan đây đã có nhiều nghiên cứu chuyên chitosan thành dẫn xuất có khối lượng phân tử thấp hơn, những dẫn xuất phân tử thấp này được dự báo có hoạt tính sinh học và khả năng ứng dụng cho cơ thể tốt hơn chitosan [3]. Chitooligosaccharide và các dẫn xuất Chitooligosaccharide (COS) là dẫn xuất của chitosan có thể được thu nhận bằng hai phương pháp: hóa học va sinh học (sử dụng enzym).

Trường hợp thủy phân chitosan dé thu COS bằng phương pháp hóa học gây độc cho cơ thé cao. Trong khi đó, thủy phân chitosan dé thu COS bằng enzym không độc cho cơ thé và thân thiện môi trường. Ngoài ra, chitooligosacchatide cũng có thé thu nhận bằng phương pháp vật lý [3]. Chitooligosaccharide là dang oligomer của chitosan nên có được hau hết những hoạt tính sinh học của chitosan như kháng oxy hóa, kháng nắm, kháng khuẩn, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, v.

Các tính chất này phụ thuộc rất nhiều vào độ polymer hóa, độ deacetyl hóa, sự phân bồ điện tích và ban chất các biến đồi hóa học trên phân tử của COS. Khác với chitosan, COS có khối lượng phân tử nhỏ hơn nên dễ đi vào máu tạo nên các tác động sinh học một cách có hệ thống lên cơ thể [20]. Các nghiên cứu cũng cho thấy khả năng vượt trội của dẫn xuất COS so với COS về đặc tính và hoạt tính sinh học như khả năng kháng oxy hóa [21], kháng viêm [22], hạ huyết áp [23]. kháng tế bào ung thư [24], bắt gốc tự do [5], phòng ngừa bệnh alzheimer [21, 25], v.

Phương pháp tạo chitooligosaccharide từ chitosan Có nhiều phương pháp được dé xuất tao COS từ chitosan, có thé chia làm ba loại chính như sau: Phân cắt băng tác nhân hóa học: acid vô cơ (HCI, HF, H2SO4, H3POa, HNO¿, v.), acid hữu cơ (CH3COOH, HCOOH, v.), chất oxy hóa (O3, HaO, v. Phân cắt bang tac nhan ly hoc nhu chiéu xa nhu tia gamma v. Phân cắt bằng tác nhân sinh học (enzym): chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase, v. Sơ đồ tạo COS từ chitosan bằng phương pháp hóa học và enzym được trình bày ở hình 1.

Chitin Ỷ Deacetyl Ỷ Chitosan M Cắt mạch | Hóa học | Vật lý Enzym | Acid HCl, HNO; Chiéu xa, vi song Dac hiéu: chitosanase Không đặc hiệu: Cellulase, lipase, | hemicellulase, pectinase v.2: Quy trình tao chitooligosacharide từ chitosan 1. Phương pháp hóa hoc Phương pháp hóa học sử dụng acid mạnh đề thủy phân chitosan rất phô biến và là phương pháp nhanh đề sản xuất hàng loạt các COS. Nguyên tắc của phương pháp này là sự thủy phân ngẫu nhiên liên kết O-glycoside giữa các đơn phân của phân tử chitosan dé tao COS [20]. Phương pháp thủy phân bang acid có ưu điểm là chu ki sản xuất ngắn, tác nhân thuỷ phân dé tìm.

Tuy nhiên, hiệu suất thu nhận COS còn thấp, khả năng gây độc cao của sản phẩm là hạn chế khi áp dụng phương pháp hóa học quy mô công nghiệp [28]. Phương pháp vật lý Quá trình thủy phân chitosan bằng chiếu xạ đã thu hút được sự chú ý đáng kể vì đây là một quá trình tương đối đơn giản, không sử dụng xúc tác hóa học, được thực hiện ở nhiệt độ phòng và có thé áp dụng trên quy mô lớn. Tuy nhiên chi phí tạo ra sản pham cao khi sử dụng liều xạ cao là hạn chế của phương pháp này [28]. Chiếu xa gamma thường được ứng dụng dé thuỷ phân chitosan, quá trình này có thê thực hiện ở nhiệt độ phòng và quy mô lớn.

Hiệu quả của quá trình thuỷ phân phụ thuộc vào liều xạ (0,5 — 200 kGy) va dung môi sử dụng (nước, acid acetic, hydrogen peroxyde v. Phương pháp enzym Các enzym phân cắt chitosan là các enzym nhận diện và thủy phân được chitosan. Định nghĩa về chitosanase (mã số EC 3.132) do Ủy ban về enzym đưa ra vào năm 2004 như sau: “chitosanase là enzym có khả năng phân cắt nội phân tử liên kết B-1,4 glycoside giữa các gốc D-glucosamine trong phân tử chitosan có mức acetyl hóa một phần”. Theo định nghĩa đã đề cập ở trên thì các enzym xúc tác thủy phân chitosan đã được nghiên cứu và công nhận như: chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase, protease, glucanase, lysozyme, v.

COS được sản xuất tir chitosan bởi enzym đặc hiệu như chitosanase và không đặc hiệu như cellulase, lipase, papain, lysozyme, hemicellulase, pectinase, pepsin, v. Han ché khi str dung enzym đặc hiệu là giá thành cao và su thiếu hụt về số lượng khi sử dụng quy mô lớn. Vì lý do này, các nhà nghiên cứu và sản xuất thường nghiên cứu và lựa chọn loại enzym không đặc hiệu thương mại, những enzym không đặc hiệu này cho hiệu quả tạo COS tương tự như enzym đặc hiệu trong khi giá thành lại thấp [7].1 Enzym dac hiéu Chitosanase có nhiều trong tự nhiên, được thu nhận từ các nguồn như vi khuẩn, nam. Hoạt tính của chitosanase cũng được tìm thấy ở thực vật và động vật.

Enzym đặc hiệu này xúc tác phân cắt liên kết B-1,4-glycoside một cách ngẫu nhiên dé tạo COS. Hiệu quả sử dụng chitosanase dé tao COS cao. Tuy nhiên, chi phí cao cho thu nhận chitosanase như tách chiết, tinh sạch, cô đặc, v.