Luận án tiến sĩ: Tổng hợp chất lai từ triterpenoid với nhóm benzamide và hydroxamate

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp các chất lai từ triterpenoid chứa nhóm benzamide và hydroxamate, ứng dụng tiềm năng trong y học.

• Tác giả: Đinh Thị Cúc
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Văn Tuyến
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Tổng Hợp Chất Lai Từ Triterpenoid Chứa Benzamide Và Hydroxamate
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC SƠ ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất triterpenoid
• 1.1.1. Tổng hợp betulin và hoạt tính sinh học các dẫn xuất của betulin
• 1.1.2. Một số hợp chất lai của triterpenoid và hoạt tính chống HIV, chống ung thư
• 1.2. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các hợp chất benzamide
• 1.3. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các hợp chất hydroxamate
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Hóa chất và dung môi
• 2.2. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng
• 2.3. Phương pháp và thiết bị nghiên cứu
• 2.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 2.5. Tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide
• 2.5.1. Tổng hợp các dẫn xuất ester của betulin (76a-f)
• 2.5.2. Quy trình tổng hợp các hợp chất trung gian 79a-b và 69
• 2.5.3. Quy trình tổng hợp các hợp chất trung gian 81, 82 và 86
• 2.5.4. Quy trình tổng hợp các hợp chất 77a-e, 80, 83a, 84, 85, 87 và 88a
• 2.5.5. Quy trình tổng hợp các hợp chất 83b và 88b
• 2.6. Tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate
• 2.6.1. Quy trình tổng hợp các dẫn xuất amide trung gian 91, 93 và 95
• 2.6.2. Quy trình tổng hợp các hợp chất lai có chứa nhóm hydroxamate 89a-h, 90a-b, 92a-b, 94a-b, 96a-b
• 2.7. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất lai có chứa nhóm benzamide và hydroxamate
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide
• 3.1.1. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulin có chứa nhóm benzamide qua cầu nối ester
• 3.1.2. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của diacid pentacyclic triterpenoid có chứa nhóm benzamide
• 3.1.3. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulinic acid có chứa nhóm benzamide
• 3.1.4. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid khác có chứa nhóm benzamide
• 3.2. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm hydroxamate
• 3.2.1. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của betulin có chứa nhóm hydroxamate qua cầu nối ester
• 3.2.2. Kết quả tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid khác có chứa nhóm hydroxamate qua cầu nối amide
• 3.3. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất lai
• NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN
• CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về triterpenoid và các hợp chất lai

Triterpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên có cấu trúc đa dạng và hoạt tính sinh học phong phú. Các hợp chất như betulin, betulinic acid, ursolic acid, và oleanolic acid đã được nghiên cứu rộng rãi nhờ khả năng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, và chống HIV. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của triterpenoid nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là hướng đi quan trọng trong hóa học hữu cơ. Các hợp chất lai của triterpenoid với các nhóm chức như benzamide và hydroxamate đang thu hút sự chú ý nhờ tiềm năng ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong điều trị ung thư.

1.1. Hoạt tính sinh học của triterpenoid

Triterpenoid như betulin và betulinic acid đã được chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thông qua cơ chế ức chế quá trình sinh tổng hợp protein p53. Các dẫn xuất ester và amide của betulin cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và chống ung thư đáng kể. Ví dụ, các dẫn xuất ester với nicotinic acid có khả năng kháng virus HPV-11 và điều hòa miễn dịch. Các hợp chất lai của triterpenoid với AZT và 3TC cũng cho thấy hoạt tính kháng HIV và chống ung thư vượt trội so với các hợp chất ban đầu.

1.2. Ứng dụng của benzamide và hydroxamate

Các hợp chất benzamide như MS-275 và MGCD-0103 đã được FDA phê duyệt trong điều trị ung thư bạch cầu và u hắc sắc tố. Hydroxamate như vorinostat và trichostatin A cũng được sử dụng trong điều trị ung thư máu và u lympho. Việc kết hợp các nhóm chức này với triterpenoid tạo ra các hợp chất lai có tiềm năng ứng dụng cao trong y học, đặc biệt là trong việc phát triển các loại thuốc chống ung thư mới.

II. Phương pháp tổng hợp và phân tích

Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai từ triterpenoid chứa benzamide và hydroxamate đòi hỏi các phương pháp hóa học tinh vi. Quy trình tổng hợp bao gồm các bước như oxi hóa, khử, và phản ứng với các tác nhân amine hoặc anhydrid acid. Các hợp chất tổng hợp được phân tích cấu trúc bằng các phương pháp vật lý và hóa học như phổ NMR, phổ khối lượng, và sắc ký lớp mỏng. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất lai được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư như KB và Hep-G2.

2.1. Tổng hợp các hợp chất lai

Các hợp chất lai được tổng hợp bằng cách kết hợp triterpenoid với các nhóm chức benzamide và hydroxamate thông qua các phản ứng ester hóa và amide hóa. Ví dụ, betulin được chuyển hóa thành các dẫn xuất ester và amide bằng cách phản ứng với các acid cacboxylic và amine tương ứng. Các hợp chất trung gian được tạo ra và tiếp tục phản ứng để hình thành các hợp chất lai cuối cùng.

2.2. Phân tích cấu trúc và hoạt tính

Cấu trúc của các hợp chất lai được xác định bằng phổ NMR và phổ khối lượng. Hoạt tính sinh học được đánh giá thông qua các thử nghiệm gây độc tế bào ung thư. Kết quả cho thấy nhiều hợp chất lai có hoạt tính chống ung thư cao, đặc biệt là các hợp chất chứa nhóm hydroxamate với giá trị IC50 thấp, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.

III. Kết quả và ứng dụng thực tiễn

Các hợp chất lai từ triterpenoid chứa benzamide và hydroxamate đã thể hiện hoạt tính chống ung thư đáng kể trên các dòng tế bào ung thư. Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc chống ung thư mới, đặc biệt là trong điều trị các bệnh ung thư kháng thuốc. Nghiên cứu tổng hợp này mở ra hướng đi mới trong việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, góp phần vào sự phát triển của ngành hóa dược và y học.

3.1. Hoạt tính chống ung thư

Các hợp chất lai chứa hydroxamate như 89a-h và 90a-b thể hiện hoạt tính chống ung thư mạnh trên các dòng tế bào KB và Hep-G2 với giá trị IC50 thấp. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của các hợp chất này trong điều trị ung thư, đặc biệt là các bệnh ung thư kháng thuốc.

3.2. Tiềm năng ứng dụng trong y học

Các hợp chất lai từ triterpenoid chứa benzamide và hydroxamate có thể được phát triển thành các loại thuốc chống ung thư mới. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại thuốc hiệu quả, góp phần chăm sóc sức khỏe cộng đồng và giảm tỷ lệ tử vong do ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh lý ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu thống kê được luận án dẫn giải, năm 2012 toàn cầu ước tính có 8,2 triệu người tử vong do ung thư; trong đó ung thư phổi (ung thư phế quản và khí quản) là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ 5 với 1,1 triệu nam giới và 0,5 triệu phụ nữ. Cùng với sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh, chi phí dành cho các loại thuốc điều trị ung thư đã tăng từ 80,8 tỷ USD năm 2010 lên 100,2 tỷ USD vào năm 2014. Mặc dù nhiều loại thuốc chống ung thư đã được phát triển, thực tiễn điều trị vẫn đối mặt với tình trạng kháng thuốc và nhiều thể bệnh chưa được chữa trị triệt để, đặt ra yêu cầu liên tục tìm kiếm và phát triển các tác nhân ức chế tế bào ung thư mới.

Trong lĩnh vực hóa dược, xu hướng thiết kế các phân tử lai (hybrid molecules) bằng cách kết hợp hai hay nhiều khung cấu trúc có hoạt tính sinh học khác nhau vào cùng một thực thể phân tử đang nhận được sự quan tâm lớn nhằm tạo ra các hợp chất có hiệu lực cao hơn và cơ chế tác động đa mục tiêu. Khung triterpenoid ngũ vòng thiên nhiên (như betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid) sở hữu nhiều hoạt tính sinh học giá trị (chống viêm, kháng virus, ức chế tế bào ung thư), trong khi các nhóm dược lực (pharmacophore) như benzamide và hydroxamate là các chất ức chế histone deacetylase (HDAC) đã được chứng minh hiệu quả lâm sàng trong điều trị ung thư. Tuy nhiên, các hợp chất lai kết hợp giữa khung triterpenoid với nhóm benzamide và hydroxamate vẫn còn rất ít được nghiên cứu. Đây là khoảng trống nghiên cứu chính mà luận án lựa chọn giải quyết.

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và nhóm hydroxamate nhằm tìm kiếm các hợp chất lai có hoạt tính sinh học cao, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra thuốc chống ung thư.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

1. Tổng hợp và phân lập các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và nhóm hydroxamate bằng các phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất tổng hợp được bằng các phương pháp vật lý và hóa học (phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HRMS và đo nhiệt độ nóng chảy).
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai tổng hợp được trên hai dòng tế bào ung thư người là KB (ung thư biểu mô) và Hep-G2 (ung thư gan).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng hóa học: Các triterpenoid ngũ vòng thiên nhiên và dẫn xuất (betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid, 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid, diacid pentacyclic triterpenoid); các anhydride acid dicarboxylic/cyclic; 1,2-diaminobenzene; các dẫn xuất hydroxylamine (NH2OH.HCl, HNMeOMe.HCl, HNMeOH.HCl, NH2OMe.HCl, NH2OAll.HCl).
• Đối tượng sinh học: Dòng tế bào ung thư biểu mô người KB (Human epidermoid carcinoma) và dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma).
• Địa điểm và thời gian thực hiện: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Hóa Dược và Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; hoàn thành và bảo vệ năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển hóa cấu trúc triterpenoid, các phân tử lai của triterpenoid, cùng các dẫn xuất benzamide và hydroxamate có hoạt tính ức chế HDAC và kháng ung thư:

• Nghiên cứu dẫn xuất và hợp chất lai của triterpenoid:

  • Oxana B. Kazakova và cộng sự (2010) đã chuyển hóa hai nhóm -OH ở vị trí C-3 và C-28 của betulin thành các dẫn xuất ester với nicotinic acid (hợp chất 6 và 7) có hoạt tính kháng virus ung thư cổ tử cung HPV-11, kháng HIV, bảo vệ gan và chống viêm; đồng thời tổng hợp các ester với acid carboxylic thơm (14, 15) có hoạt tính kháng khuẩn với đường kính vòng vô khuẩn 10–13 mm.
  • Sheng-Jie Yang và cộng sự (2015) tổng hợp các dẫn xuất ester-amide tại C-28 của betulin (16a-c) qua phản ứng với cyclic anhydride rồi ghép với amine; thử nghiệm trên các dòng tế bào MGC-803, PC3, Bcap-37, A375 và MCF-7 cho thấy hoạt tính ức chế với IC50 từ 4–18 µM, trong đó dẫn xuất 16c mang vòng piperidine thể hiện hoạt tính mạnh nhất (IC50 lần lượt là 4,3; 4,5; 5,2; 7,5 và 5,2 µM).
  • Harish Komera và cộng sự (2010) tổng hợp các carbamate 18–21 từ betulin với ethyl/phenyl isocyanate trong DCM ở 60°C trong 48 giờ, ghi nhận hợp chất 18 và 20 có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư phổi A549.
  • Nguyễn Văn Tuyến và cộng sự (2012) tổng hợp các phân tử lai giữa betulin với AZT (25a-b) và 3TC (26a-b) qua liên kết ester; hợp chất 25a và 25b có hoạt tính kháng HIV cao (EC50 đạt 0,1–0,3 µM, so với d4T là 7,3 µM, AZT là 0,47 µM, 3TC là 3,3 µM). Nhóm tác giả tiếp tục tổng hợp các dẫn xuất lai triterpenoid-AZT qua cầu nối triazole-ester (29) và triazole-amide (31), cho thấy khả năng gây độc tế bào Hep-G2 với IC50 lần lượt là 8,55 µM và 5,91 µM; hợp chất 31 còn ức chế dòng tế bào KB với IC50 đạt 8,1 µM.

• Nghiên cứu về dẫn xuất benzamide và hoạt tính ức chế HDAC:

  • Suzuki và cộng sự (1999) công bố tác dụng ức chế HDAC in vitro và in vivo của nhóm benzamide. Các hoạt chất tiêu biểu gồm Chidamide (CS055, được FDA phê duyệt năm 2015 điều trị u lympho tế bào T ngoại vi), Entinostat (MS-275, ức chế HDAC1 và HDAC3 với IC50 lần lượt là 0,51 µM và 1,7 µM), Mocetinostat (MGCD0103) và Tacedinaline (CI-994, ức chế HDAC 1, 2, 3, 8 với IC50 tương ứng 0,9; 0,9; 1,2 và >20 µM; ức chế tế bào BCLO ở chuột với IC50 = 2,5 µM).
  • Yoshiyuki Hirata và cộng sự (2018) tổng hợp dãy benzamide 42a-f từ tiền chất chloromethyl benzamide 40 với các dẫn xuất piperazine trong DMF/THF có NaH, sau đó giải phóng nhóm bảo vệ Boc bằng TFA; ghi nhận hợp chất 42c gây chết tế bào thần kinh vỏ não ở nồng độ dưới 1 µM.
  • Rui Xie và cộng sự (2017) tổng hợp các dithiocarbamate benzamide M101, M122, M133 qua phản ứng ghép với 1,2-diaminobenzene nhờ xúc tác BOP/Et3N, trong đó M122 ức chế dòng tế bào HeLa và HCT116 với IC50 lần lượt là 0,79 µM và 0,54 µM.
  • Jin Cai và cộng sự (2015) thiết kế dãy benzamide chứa nhân 1,2,4-oxadiazole 52a-j, ghi nhận các chất 52b, 52e, 52f và 52j có hoạt tính mạnh trên dòng U937 và HCT116 (IC50 từ 0,97–2,33 µM; riêng 52j đạt IC50 = 0,38 µM trên dòng U937).

• Nghiên cứu về dẫn xuất hydroxamate và hoạt tính ức chế HDAC:

  • Lớp chất hydroxamate có khả năng liên kết ion kẽm tại tâm hoạt động của HDAC. Các thuốc tiêu biểu đã được phê duyệt gồm Vorinostat/SAHA (FDA phê duyệt năm 2006 điều trị u lympho da tế bào T), Belinostat (PXD-101), Panobinostat (LBH-589 điều trị đa u tủy, AML, ALL, MDS), Trichostatin A (TSA) và CUDC-101.
  • Nguyễn Hải Nam và cộng sự (2018) tổng hợp các quinazolinone hydroxamate 57a-d qua phản ứng ester trung gian với NH2OH.HCl/NaOH, cho thấy IC50 từ 0,62–1,50 µM trên ba dòng tế bào SW620, PC3, NCI-H23. Nhóm tác giả tiếp tục thay đổi nhân phenyl của SAHA bằng benzothiazole tạo dãy 59a-g (chất 59g có IC50 = 0,32; 0,34; 0,39 µg/ml trên dòng SW620, AsPC-1, NCI-H460 và ức chế 49,00% khối u PC-3 in vivo ở liều 30 mg/kg, tương đương SAHA đạt 48,30%) và khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazole tạo dãy 61a-o (chất 61b có IC50 trên AsPC-1, SW620, NCI-H460 lần lượt là 0,63; 0,34 và 0,11 µM).
  • Trần Khắc Vũ và cộng sự (2016) tổng hợp dẫn xuất dihydroartemisinin-hydroxamate 64a-e qua trung gian 10β-aminoartemisinin, trong đó chất 64a có IC50 từ 6,41–14,17 µg/mL trên các dòng Hep-G2, MCF-7 và HL-60.
  • Chao Ding và cộng sự (2016) tổng hợp các dẫn xuất 6-(1,2,3-triazol-4-yl)-4-aminoquinazolin hydroxamate 67a-e ức chế EGFR/HER2 và HDAC, với 67b và 67d ức chế tăng sinh năm dòng tế bào ung thư (A549, A431, BT-474, SK-BR-3, NCI-H1975) ở IC50 từ 0,49–8,76 µM.
  • Wiemann và cộng sự (2015, 2016) tổng hợp các dẫn xuất hydroxamate từ betulinic acid (70a-d, 71a-k), ursolic acid và oleanolic acid (73a-h, 75a-c); trong đó chất 71a thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rất cao trên 518A2, A2780, A549, MCF7 và NIH 3T3 với IC50 từ 1,1–1,6 µM (Bảng 1.1).

Vị trí của luận án: Luận án kế thừa chiến lược lai hóa phân tử và tận dụng nguồn khung triterpenoid dồi dào, mở rộng hướng gắn kết đồng thời nhóm chức benzamide (qua liên kết amide với 1,2-diaminobenzene) hoặc hydroxamate (qua liên kết amide với các hydroxylamine thế) vào các vị trí carboxyl hoặc hydroxyl tại C-3/C-28 của các triterpenoid ngũ vòng thông qua các cầu nối linh động.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và chiến lược thiết kế phân tử

Nghiên cứu dựa trên nguyên lý lai hóa phân tử trong hóa dược: kết hợp khung triterpenoid ngũ vòng (lupane, ursane, oleanane) có hoạt tính gây độc tế bào nội tại với các nhóm khóa hoạt động ức chế HDAC (nhóm kẹp kẽm - Zinc Binding Group, ZBG) gồm o-aminoanilide (benzamide) và acid hydroxamic (hydroxamate). Phân tử lai được kết nối trực tiếp hoặc thông qua các cầu nối dicarboxylic aliphatic/alicyclic nhằm khảo sát ảnh hưởng của độ dài và độ cứng của mạch nối tới hoạt tính sinh học.

Hóa chất, dung môi và kỹ thuật thực nghiệm tổng hợp

• Hóa chất và dung môi: Hóa chất tổng hợp hữu cơ mua từ Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ) với độ tinh khiết >98%. Dung môi phản ứng được làm khô và tinh chế theo tiêu chuẩn khan.
• Phản ứng tạo liên kết ester: Cho betulin phản ứng với các cyclic anhydride (succinic, glutaric, 2,2-dimethylsuccinic, 3-methylglutaric, cyclohex-4-ene-1,2-dicarboxylic, 2-methylsuccinic anhydride) trong dung môi DCM khan, có mặt base xúc tác triethylamine (Et3N) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
• Phản ứng oxy hóa chọn lọc: Sử dụng tác nhân Jones (hỗn hợp CrO3 trong H2SO4 loãng) để oxy hóa nhóm 3β-OH thành ketone và chuyển hóa mạch nhánh trong môi trường acetone ở 0°C đến nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
• Phản ứng khử chọn lọc: Sử dụng NaBH4 trong hỗn hợp dung môi MeOH/THF (0–5°C, 10 giờ) để khử chọn lọc nhóm carbonyl C-3.
• Phản ứng acetyl hóa bảo vệ nhóm hydroxyl: Sử dụng anhydride axetic (Ac2O) với xúc tác Et3N trong DCM ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ.
• Phản ứng tạo liên kết amide/benzamide: Sử dụng hệ tác nhân ghép nối peptide BOP (benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate), phối hợp xúc tác DMAP (4-dimethylaminopyridine) và Et3N trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ với 1,2-diaminobenzene.
• Phản ứng tạo nhóm hydroxamate: Tạo liên kết giữa nhóm carboxylic của dẫn xuất triterpenoid với các hydroxylamine (NH2OH.HCl, HNMeOMe.HCl, HNMeOH.HCl...) qua phản ứng với oxalyl chloride hoặc hệ ghép nối amide.

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc

• Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Sử dụng bản mỏng silica gel (Merck) để theo dõi tiến trình phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm; định tính bằng độ dịch chuyển Rf dưới ánh sáng tử ngoại và thuốc thử hiện màu.
• Sắc ký cột: Phân lập và tinh chế sản phẩm trên pha tĩnh silica gel cỡ hạt 100–200 mesh (Merck); pha động sử dụng hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate với các tỷ lệ khác nhau (8:2 hoặc 7:3).
• Xác định nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy Buchi Melting Point B-545.
• Phổ hồng ngoại (IR): Ghi trên máy Spectrum Two (PerkinElmer) bằng phương pháp ép viên KBr rắn.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trên máy Bruker XL-500; dung môi đo gồm CDCl3 hoặc DMSO-d6; chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).
• Phổ khối lượng phân giải cao (HRMS): Đo trên hệ thống LC-MS/MS Q-Exactive (hãng Thermo) sử dụng nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) để xác định chính xác khối lượng phân tử ion mảnh.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) theo quy trình chuẩn của Mosmann (1983). Thử nghiệm được tiến hành trên hai dòng tế bào ung thư người:

• KB: Tế bào ung thư biểu mô người (Human epidermic carcinoma).
• Hep-G2: Tế bào ung thư gan người (Hepatocellular carcinoma).
• Giá trị đánh giá: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển tế bào (IC50, tính bằng µM hoặc µg/mL).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Chương I trình bày tổng quan lý thuyết và thực nghiệm gồm 5 tiểu mục chính:

1. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất triterpenoid: Giới thiệu cấu trúc của các triterpenoid pentacyclic phổ biến gồm betulin (1), betulinic acid (2), ursolic acid (3), oleanolic acid (4) và 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5). Phân tích khả năng biến đổi hóa học tại các vị trí hoạt động C-3, C-28 và nối đôi C-20(29).
2. Tổng hợp betulin và hoạt tính sinh học các dẫn xuất của betulin: Trình bày nguồn gốc tự nhiên của betulin từ vỏ cây bạch dương (Betula alba, chiếm tới 30% trọng lượng khô dịch chiết vỏ); tổng quan các phản ứng tạo dẫn xuất ester (6–13), dẫn xuất amide (14), dẫn xuất ester-amide (16a-c) và dẫn xuất carbamate (18–21).
3. Một số hợp chất lai của triterpenoid và hoạt tính chống HIV, chống ung thư: Điểm lại các công trình tổng hợp phân tử lai triterpenoid kết hợp thuốc kháng virus AZT và 3TC qua liên kết ester (23, 25a-b, 26a-b) hoặc qua cầu nối triazole (29, 31).
4. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các hợp chất benzamide: Tổng quan các chất ức chế HDAC nhóm benzamide (MS-275, CI-994, MGCD-0103, CS055), quy trình tổng hợp các dẫn chất benzamide 42a-f của Hirata, dãy dẫn chất dithiocarbamate benzamide M101–M133 của Xie, và dãy 1,2,4-oxadiazole benzamide 52a-j của Cai.
5. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các hợp chất hydroxamate: Tổng quan các chất ức chế HDAC nhóm hydroxamate (Vorinostat/SAHA, Belinostat, Panobinostat, TSA, CUDC-101), các nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất quinazolinone hydroxamate (57a-d), benzothiazole hydroxamate (59a-g), 5-phenyl-1,3,4-thiadiazole hydroxamate (61a-o) của Nguyễn Hải Nam; dẫn xuất artemisinin hydroxamate (64a-e) của Trần Khắc Vũ; aminoquinazolin hydroxamate (67a-e) của Ding; và các dẫn xuất hydroxamate đi từ betulinic acid (70a-d, 71a-k), ursolic acid, oleanolic acid (73a-h, 75a-c) của Wiemann.

Bảng tổng hợp hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn xuất hydroxamate từ betulinic acid theo công bố của Wiemann và cộng sự được trích dẫn trong Chương I:

Hợp chất	518A2 (IC50, µM)	A2780 (IC50, µM)	A549 (IC50, µM)	MCF7 (IC50, µM)	NIH 3T3 (IC50, µM)
Betulinic acid (2)	9,4 ± 0,7	8,8 ± 0,9	17,1 ± 1,1	10,2 ± 1,2	16,1 ± 1,4
68	4,5 ± 0,1	18,3 ± 0,5	6,2 ± 0,4	11,0 ± 0,5	>30
69	29,0 ± 2,0	20,4 ± 1,9	25,9 ± 2,5	25,9 ± 2,0	13,1 ± 0,9
71a	1,6 ± 0,1	1,3 ± 0,1	1,3 ± 0,1	1,4 ± 0,1	1,1 ± 0,1
71b	2,4 ± 0,2	3,7 ± 0,5	5,3 ± 0,6	3,9 ± 0,6	2,0 ± 0,5
71e	3,5 ± 0,3	2,0 ± 0,1	4,3 ± 0,7	2,3 ± 0,3	2,9 ± 0,6
70b	6,3 ± 0,2	3,0 ± 0,2	6,0 ± 0,3	10,2 ± 0,9	5,0 ± 0,4

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

Chương II mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, điều kiện phản ứng, phương tiện kỹ thuật và quy trình tổng hợp từng hợp chất cụ thể:

1. Tổng hợp các dẫn xuất ester của betulin (76a-f): Phản ứng giữa 1,0 mmol betulin (1) và 4,0 mmol anhydride tương ứng với 1,2 mmol Et3N trong 5 ml DCM ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

   • Hợp chất 76a (dẫn xuất succinic): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 236–237°C.
   • Hợp chất 76b (dẫn xuất glutaric): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 210–212°C.
   • Hợp chất 76c (dẫn xuất 2,2-dimethylsuccinic): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 205–207°C.
   • Hợp chất 76d (dẫn xuất 3-methylglutaric): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 220–222°C.
   • Hợp chất 76e (dẫn xuất cyclohex-4-ene-1,2-dicarboxylic): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 175–177°C.
   • Hợp chất 76f (dẫn xuất 2-methylsuccinic): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 203–205°C.

2. Tổng hợp các hợp chất trung gian 79a-b và 69: Tiến hành oxy hóa bằng tác nhân Jones (3,9 mmol CrO3 trong H2SO4) trong acetone ở 0°C đến nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

   • Hợp chất 79a: Tinh thể trắng, hiệu suất 90%, nhiệt độ nóng chảy 272–274°C; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 4,78 (1H, s, Ha-29), 4,53 (1H, d, J = 1,5 Hz, Hb-29), 2,98–3,07 (1H, m, H-19), 1,65 (3H, s, H-30), 0,98 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-24), 0,92 (3H, s, H-26), 0,89 (3H, s, H-27), 0,87 (3H, s, H-25); HRMS m/z [M+H]+ tìm thấy 441,3278 (tính toán lý thuyết C29H45O3: 441,3290).
   • Hợp chất 79b: Tinh thể trắng, hiệu suất 60%, nhiệt độ nóng chảy 270–271°C; HRMS m/z [M+H]+ tìm thấy 455,3156 (tính toán C29H43O4: 455,3167).
   • Hợp chất 69: Tinh thể trắng, hiệu suất 73%, nhiệt độ nóng chảy 165–167°C; HRMS m/z [M+H]+ tìm thấy 455,3236 (tính toán C30H47O3: 455,3447).

3. Tổng hợp các hợp chất trung gian 81, 82 và 86:

   • Khử hợp chất 79a (1,0 mmol) bằng NaBH4 (4,0 mmol) trong MeOH/THF ở 0–5°C trong 10 giờ thu được hợp chất 81: Tinh thể trắng, hiệu suất 78%, nhiệt độ nóng chảy 213–215°C; HRMS m/z [M+H]+ tìm thấy 443,3468 (tính toán C29H47O3: 443,3447).
   • Acetyl hóa hợp chất 81 bằng Ac2O/Et3N trong DCM (15 giờ ở nhiệt độ phòng) thu được hợp chất 82: Tinh thể trắng, hiệu suất 88%, nhiệt độ nóng chảy 214–216°C.
   • Acetyl hóa ursolic acid (3) thu được hợp chất 86: Tinh thể trắng, hiệu suất 79%, nhiệt độ nóng chảy 195–197°C.

4. Tổng hợp các hợp chất lai benzamide 77a-e, 80, 83a, 84, 85, 87 và 88a: Hòa tan các dẫn xuất acid (76a-e, 79b, 82, 2, 69, 86, 5; 1,0 mmol) trong DMF, thêm BOP (1,0 mmol), DMAP (2,0 mmol), Et3N (1,2 mmol) khuấy 5–10 phút, sau đó cho 1,2-diaminobenzene (1,2 mmol) phản ứng trong 15 giờ ở nhiệt độ phòng. Chiết bằng ethyl acetate và tinh chế qua cột sắc ký.

5. Tổng hợp các dẫn xuất amide trung gian 91, 93, 95 và các hợp chất lai hydroxamate 89a-h, 90a-b, 92a-b, 94a-b, 96a-b.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương III tập trung biện luận hóa học, phân tích cấu trúc phổ và đánh giá hoạt tính sinh học của các dãy chất tổng hợp được:

• Phân tích tổng hợp dãy chất lai benzamide: Luận án thảo luận cơ chế hình thành liên kết amide (-CONH-) thông qua hoạt hóa nhóm carboxyl bằng tác nhân BOP, có sự hỗ trợ của xúc tác DMAP và base Et3N. Phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR chứng minh sự xuất hiện của các proton thơm đặc trưng của nhân 1,2-diaminobenzene (các tín hiệu đa mũi trong vùng δ 6,6–7,4 ppm), các tín hiệu proton nhóm amine tự do (-NH2) và nhóm amide (-CONH-), cùng các carbon carbonyl amide tại vùng δ 170–176 ppm (Bảng 3.1 đến 3.8).
• Phân tích tổng hợp dãy chất lai hydroxamate: Biện luận cơ chế tạo nhóm hydroxamate (-CONH-OH hoặc -CON(Me)-OH) tại C-28 của betulin qua cầu nối ester hoặc gắn trực tiếp vào vị trí carboxyl của betulinic acid, ursolic acid và oleanolic acid qua cầu nối amide. Dữ liệu phổ HRMS xác nhận khối lượng phân tử chính xác của các phân tử lai 89a-h, 90a-b, 92a-b, 94a-b và 96a-b (Bảng 3.9 và 3.10).
• Đánh giá hoạt tính chống ung thư: Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào in vitro bằng phép thử MTT trên hai dòng tế bào ung thư người KB và Hep-G2 được tổng hợp trong Bảng 3.11 (dãy benzamide) và Bảng 3.12 (dãy hydroxamate), từ đó xác lập mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) giữa độ dài cầu nối ester/amide và bản chất khung triterpenoid.

Đặc trưng vật lý của các dẫn xuất trung gian ester và acid triterpenoid tổng hợp trong luận án:

Hợp chất	Cấu trúc / Tên IUPAC tóm tắt	Dạng tồn tại	Hiệu suất (%)	Điểm chảy (°C)	HRMS m/z [M+H]+ (Tìm thấy / Tính toán)
76a	Dẫn xuất betulin-3a-succinate	Tinh thể trắng	—	236–237	—
76b	Dẫn xuất betulin-3a-glutarate	Tinh thể trắng	—	210–212	—
76c	Dẫn xuất betulin-3a-2,2-dimethylsuccinate	Tinh thể trắng	—	205–207	—
76d	Dẫn xuất betulin-3a-3-methylglutarate	Tinh thể trắng	—	220–222	—
76e	Dẫn xuất betulin-3a-cyclohex-4-enecarboxylate	Tinh thể trắng	—	175–177	—
76f	Dẫn xuất betulin-3a-2-methylsuccinate	Tinh thể trắng	—	203–205	—
79a	Acid 9-oxo-lup-1-en-carboxylic	Tinh thể trắng	90%	272–274	441,3278 / 441,3290
79b	Acid 9,12-dioxo-lup-1-en-carboxylic	Tinh thể trắng	60%	270–271	455,3156 / 455,3167
69	Acid 9-oxo-betulinic	Tinh thể trắng	73%	165–167	455,3236 / 455,3447
81	Acid 9-hydroxy-lup-1-en-carboxylic	Tinh thể trắng	78%	213–215	443,3468 / 443,3447
82	Acid 9-acetoxy-lup-1-en-carboxylic	Tinh thể trắng	88%	214–216	—
86	Acid 10-acetoxy-ursolic	Tinh thể trắng	79%	195–197	—

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Đã nghiên cứu xây dựng thành công các quy trình tổng hợp bán phần các hợp chất lai mới kết hợp giữa các triterpenoid ngũ vòng thiên nhiên (betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid, 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid) với nhóm chức ức chế HDAC benzamide (o-aminoanilide) và hydroxamate.
2. Đã tổng hợp và phân lập tinh khiết một dãy lớn các hợp chất trung gian và sản phẩm lai mục tiêu:
   • Dãy dẫn xuất ester của betulin (76a-f).
   • Dãy dẫn xuất trung gian oxy hóa và khử triterpenoid (79a-b, 69, 81, 82, 86).
   • Dãy hợp chất lai triterpenoid-benzamide (77a-e, 80, 83a-b, 84, 85, 87, 88a-b).
   • Dãy hợp chất lai triterpenoid-hydroxamate (89a-h, 90a-b, 92a-b, 94a-b, 96a-b) cùng các chất trung gian amide (91, 93, 95).
3. Đã xác định đầy đủ và chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất mới tổng hợp được bằng việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại: phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) và phổ khối lượng phân giải cao (HRMS-ESI).
4. Đã đánh giá sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất lai trên hai dòng tế bào ung thư người KB và Hep-G2 bằng phép thử MTT, cung cấp dữ liệu thực nghiệm về mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học, nhóm thế, độ dài cầu nối và hoạt tính sinh học của các phân tử lai.

Kiến nghị và định hướng ứng dụng

• Các hợp chất lai có hoạt tính gây độc tế bào tốt được đề xuất làm cấu trúc dẫn đường (lead compounds) cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo.
• Cần tiếp tục nghiên cứu cơ chế phân tử chính xác, bao gồm khả năng ức chế trực tiếp enzyme histone deacetylase (HDAC) và các thử nghiệm in vivo nhằm phục vụ mục tiêu phát triển thuốc chống ung thư.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Thử nghiệm hoạt tính sinh học trong phạm vi luận án mới dừng lại ở sàng lọc độc tính tế bào in vitro trên hai dòng tế bào ung thư người (KB và Hep-G2) bằng phương pháp MTT; chưa thực hiện đánh giá độc tính tế bào trên các dòng tế bào lành đối chứng, chưa đo hoạt tính ức chế trực tiếp trên từng isoform enzyme HDAC chuyên biệt, và chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng u trên mô hình động vật in vivo.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng thử nghiệm độc tính tế bào trên các dòng ung thư khác; thực hiện các phép thử ức chế enzyme HDAC in vitro; khảo sát dược động học, độ ổn định hóa học và đánh giá hiệu quả ức chế khối u trên mô hình chuột in vivo đối với các dẫn xuất có hoạt tính tốt nhất.

Giá trị tham khảo

• Đối tượng hưởng lợi:
  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
  • Giảng viên và nghiên cứu viên tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành tổng hợp hữu cơ và phát triển thuốc mới.
  • Các nhà hóa dược quan tâm đến kỹ thuật chuyển hóa khung triterpenoid thiên nhiên và chiến lược thiết kế phân tử lai ức chế enzyme HDAC.
• Phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình thực nghiệm chi tiết về phản ứng ester hóa chọn lọc betulin bằng các cyclic anhydride.
  • Kỹ thuật oxy hóa chọn lọc bằng tác nhân Jones và khử ketone bằng NaBH4 trên khung triterpenoid ngũ vòng.
  • Quy trình tạo liên kết amide trực tiếp giữa triterpenoid acid với 1,2-diaminobenzene sử dụng hệ xúc tác BOP/DMAP/Et3N.
  • Bộ số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối phân giải cao (HRMS) của các dẫn xuất triterpenoid biến tính.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án sử dụng những hợp chất triterpenoid ban đầu nào để làm khung cấu trúc tổng hợp phân tử lai?
Luận án sử dụng các triterpenoid ngũ vòng gồm betulin (1), betulinic acid (2), ursolic acid (3), oleanolic acid (4), cùng dẫn xuất 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5) và các diacid pentacyclic triterpenoid.

2. Hệ tác nhân nào được sử dụng để ghép nối tạo liên kết benzamide với 1,2-diaminobenzene?
Phản ứng ghép nối tạo liên kết amide giữa nhóm carboxyl của dẫn xuất triterpenoid với 1,2-diaminobenzene được thực hiện trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, sử dụng hệ tác nhân gồm 1,0 mmol chất phản ứng, 1,0 mmol chất tạo liên kết BOP, 2,0 mmol chất xúc tác DMAP và 1,2 mmol base Et3N.

3. Tác nhân và điều kiện nào được áp dụng cho phản ứng oxy hóa chọn lọc vị trí C-3 của dẫn xuất triterpenoid?
Phản ứng oxy hóa sử dụng tác nhân Jones (3,9 mmol CrO3 trong H2SO4) được nhỏ chậm vào dung dịch cơ chất (1 mmol) hòa tan trong 10 ml acetone ở 0°C trong 20 phút, sau đó khuấy từ 0°C đến nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

4. Những phương pháp hóa lý và thiết bị nào được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất lai tổng hợp được?
Cấu trúc các hợp chất được xác định bằng: đo nhiệt độ nóng chảy (máy Buchi B-545); phổ hồng ngoại IR (máy PerkinElmer Spectrum Two, ép viên KBr); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trên máy Bruker XL-500 (dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6); và phổ khối lượng phân giải cao HRMS ghi trên máy LC-MS/MS Q-Exactive (Thermo) bằng nguồn ion hóa ESI.

5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất lai được đánh giá trên những dòng tế bào ung thư nào và bằng phương pháp gì?
Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá in vitro bằng phương pháp MTT (theo Mosmann) trên hai dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma) và ung thư gan Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đinh Thị Cúc đã nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc một hệ thống các hợp chất lai mới giữa khung triterpenoid ngũ vòng thiên nhiên với nhóm benzamide và hydroxamate. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của các chất trung gian và sản phẩm mục tiêu được chứng minh bằng các phương pháp phổ nghiệm IR, 1H-NMR, 13C-NMR và HRMS. Kết quả đánh giá độc tính tế bào in vitro trên hai dòng tế bào KB và Hep-G2 bằng phép thử MTT đã xác định được những hợp chất lai có hoạt tính sinh học, đóng góp dữ liệu thực nghiệm phục vụ định hướng nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư từ nguồn hoạt chất thiên nhiên biến tính.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất triterpenoid Một số hợp chất triterpenoid như betulin (1), betulinic acid (2), ursolic acid (3), oleanolic acid (4), 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5) là những hợp chất có hoạt tính chống ung thư da, kháng khuẩn, kháng nầm, chống viêm, chống HIV…. Đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của các chất này nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.1: Cấu trúc một số hợp chất triterpenoid 1. Tổng hợp betulin và hoạt tính sinh học các dẫn xuất của betulin Betulin hay 20(29)-lupene-3,28-diol (1), lần đầu tiên được phân lập vào năm 1788 từ loài Betula alba (Betulaceae), là một trong các hợp chất thiên nhiên phổ biến thuộc nhóm triterpenoid khung lupan.

Betulin được tìm thấy ở nhiều loài thực vật, nhiều nhất là trong thành phần vỏ cây bạch dương (chiếm tới 30% trọng lượng khô của dịch chiết từ vỏ của loài B. Ngoài ra, betulin cũng được tìm thấy ở nhựa của loài cây này [17] và được phát hiện có nhiều hoạt tính như hoạt tính gây độc tế bào đối với tế bào ung thư da, ung thư não và nhiều dòng tế bào ung thư ở người. Chính vì betulin có nhiều hoạt tính sinh học lý thú, nên betulin ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên 4 cứu chuyển hóa thành các dẫn xuất khác nhau nhằm tìm kiếm các cấu trúc hóa học mới và hoạt tính sinh học lý thú của chúng. Betulin có hai nhóm chức OH liên kết với C-3 và C-28 và một nối đôi 20(29) của nhánh isopropylenyl tại C-19.

Đây là các trung tâm hoạt động rất dễ bị thay thế hoặc chuyển hóa trong các phản ứng hóa học mà vẫn giữ được nguyên khung triterpenoid, chính vì thế nên khả năng chuyển hóa của betulin rất phong phú. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng việc chuyển hóa nhóm chức OH ở C-3 hoặc C-28 của hợp chất betulin đã cho các dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt. Dưới đây là một số dẫn xuất có hoạt tính sinh học của betulin. Dẫn xuất ester của betulin: Năm 2010 nhà khoa học người Nga Oxana B.

Kazakova và các cộng sự của ông đã nghiên cứu chuyển hóa thành công hai nhóm OH ở vị trí C-3 và C-28 của betulin qua một loạt các phản ứng để tạo thành các dẫn xuất ester, các dẫn xuất ester với nicotinic acid 6 và 7 có hoạt tính kháng lại chủng virut ung thư cổ tử cung HPV-11. Ngoài ra, hợp chất 6 còn có hoạt tính điều hòa miễn dịch, kháng HIV, bảo vệ gan, chống viêm, chống loét (sơ đồ 1.1: Tổng hợp dẫn xuất ester của betulin và nicotinic acid Một số dẫn xuất ester của betulin và các acid cacboxylic thơm cũng đã được tổng hợp và được thử hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả cho thấy hợp chất 14 5 và 15 có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên nhiều dòng vi khuẩn với đường kính vô khuẩn từ 10 – 13 mm (sơ đồ 1.2: Tổng hợp dẫn xuất ester 8-13 Dẫn xuất amide của betulin: Sơ đồ 1.3: Tổng hợp dẫn xuất amide 14 Đầu tiên là oxi hóa nhóm 3β-OH của betulin thành ketone, C-28 thành nhóm COOH, sau đó là khử chọn lọc bằng tác nhân NaBH4 thu được betulinic 6 acid (2), sau đó cho phản ứng với các amino acid khác nhau sẽ thu được các dẫn xuất amide [26]. Dẫn xuất ester- amide của betulin: Năm 2015, tác giả Sheng-Jie Yang và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp thành công các dẫn xuất ester-amide ở C-28 của betulin bừng cách cho betulin phản ứng với các anhydrid acid khác nhau thu được các dẫn xuất ester – acid, sau đó cho các dẫn xuất này phản ứng với các tác nhân amine khác nhau bằng dung môi DCM thu được các dẫn xuất ester-amide 16a-c.

Các hợp chất này sau đó được nghiên cứu thử hoạt tính chống ung thư trên các dòng tế bào ung thư ở người như MGC- 803 (ung thư dạ dày), PC3 (ung thư tiền liệt tuyến), Bcap-37 (ung thư biểu mô cổ tử cung), A375 (ung thư da) và MCF-7 (ung thư vú). Kết quả cho thấy, hợp chất 15 và 16a-c có hoạt tính tốt với giá trị IC50 từ 4-18 M. Riêng hợp chất 16c có chứa nhóm piperidin trong nhóm chức amide thể hiện hoạt tính tốt nhất đối với 5 dòng tế bào trên với giá trị IC50 tương ứng lần lượt là 4,3 μM; 4,5 μM; 5,2 μM; 7,5 μM, và 5,2 μM (sơ đồ 1.4: Tổng hợp một số dẫn xuất ester-amide 16a-c Dẫn xuất carbamate của betulin: 7 Nưm 2010, Harish Komera và các cộng sự đã cho betulin phản ứng với ethyl isocyanate và phenyl isocyanate trong dung môi DCM ở 600C trong 48 giờ, thu được các dẫn xuất carbamate 18-21 theo sơ đồ 1. Hợp chất 18 và 20 thể hiện hoạt tính diệt tế bào ung thư phổi A549 [28].5: Tổng hợp một số dẫn xuất carbamate 18-21 Hướng nghiên cứu lai hóa các hợp chất có hoạt tính sinh học để tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học tính mạnh hơn, chọn lọc hơn là một hướng nghiên cứu được nghiên cứu nhiều mà các nhà khoa học luôn mong đợi.

Một số hợp chất lai của triterpenoid và hoạt tính chống HIV, chống ung thư Năm 2012, tác giả Nguyễn Văn Tuyến và cộng sự đã tổng hợp nhiều hợp chất lai giữa betulin với Zidovudine (AZT), betulin với dẫn xuất của Lamivudine (3TC) bằng cách cho betulin (1) phản ứng với ethyl chloroformate trong dung môi DCM và bổ sung thêm triethyl amine thu được dẫn xuất 22, 24 sau đó cho phản ứng với AZT, 3TC trong dung môi DCM ở 250C trong 24 giờ thu được các dẫn xuất 25a-b, 26a-b theo các sơ đồ 1.6: Tổng hợp chất lai 23, 25a-b của betulin và AZT qua liên kết ester Sơ đồ 1.7: Tổng hợp chất lai 26a-b của betulin và 3TC qua liên kết ester Các dẫn xuất lai giữa AZT và các triterpenoid 25a và 25b và hai dẫn xuất lai giữa 3TC và betulin 26a và 26b được thử hoạt tính chống virut HIV và 9 được so sánh với các thuốc kháng HIV truyền thống AZT, 3TC và d4T với gía trị EC50 tương ứng của d4T, AZT và 3TC trong phép thử đối chứng này là 7,3 µM; 0,47 µM và 3,3 µM. Kết quả cho thấy các hợp chất 25a và 25b có hoạt tính kháng HIV cao hơn nhiều so với các thuốc truyền thống với các giá trị EC50 từ 0,1 µM tới 0,3 µM. Riêng hai dẫn xuất lai 26a và 26b thì lại có hoạt tính kháng HIV thấp hơn một chút so với các thuốc truyền thống 3TC và d4T với giá trị EC50 lần lượt là 10 µM (26a) và 10 µM - 25 µM (26b). Ngoài ra, tác giả Nguyễn Văn Tuyến và các cộng sự còn nghiên cứu tổng hợp thành công các hợp chất lai của triterpenoid với AZT qua cầu nối ester và amide bằng cách cho các triterpenoid phản ứng với các propagyl bromide và propagyl amine để tạo các dẫn xuất ester và amide, sau đó cho các dẫn xuất này phản ứng với AZT thu được các các hợp chất lai 29 và 31 có hoạt tính chống ung thư KB và Hep-G2 cao [30, 31] (sơ đồ 1.8: Tổng hợp dẫn chất lai triterpenoid-AZT qua cầu nối ester-triazole 10 Sơ đồ 1.9: Tổng hợp dẫn chất lai triterpenoid-AZT qua cầu nối amide-triazole Kết quả thử hoạt tính chống ung thư cho thấy cả hai hợp chất 29 và 31 đều có hoạt tính cao đối với dòng tế bào Hep-G2 với giá trị IC50 lần lượt là 8,55 µM và 5,91 µM, riêng hợp chất 31 còn có hoạt tính mạnh đối với dòng tế bào KB (IC50 = 8,1 µM).2: Cấu trúc một số hợp chất triterpenoid-AZT qua cầu triazole-ester và triazole-amide có hoạt tính sinh học cao 1.

Tổng hợp và hoạt tính sinh học của các hợp chất benzamide Năm 1999, Suzuki và các cộng sự đã bắt đầu công bố các dẫn chất benzamide khi nó có tác dụng ức chế HDAC in vitro và in vivo [32]. Một số hợp chất thuộc nhóm này phải kể đến như MS-275, CI-994, MGCD-103, CS005.3: Cấu trúc một số hợp chất benzamide Hợp chất chidamide (CS055) đã được FDA phê duyệt vào năm 2015 để điều trị ung thư hạch tế bào T ngoại vi [33]. Các hợp chất Tacedinaline (CI994) [34], Entinostat (MS-275) [35], Mocetinostat (MGCD0103) [36] (hình 1.3) hiện đang trải qua các thử nghiệm lâm sàng khác nhau để điều trị các loại ung thư khác nhau. Riêng hợp chất MS-275 không những ức chế HDAC1 và HDAC3 với giá trị IC50 lần lượt là 0,51 μM và 1,7 μM, mà nó còn làm giảm sự acetyl hóa quá mức của histon trong nhiều loại ung thư, giảm sự biểu thị quá mức của p21WAF1/CIP1 và gelsolin.

CI-994 có tác dụng ức chế HDAC 1, 2, 3 và 8 ở người với giá trị IC50 lần lượt là 0,9; 0,9; 1,2 và > 20 μM. Ngoài ra, nó cũng đã được chứng minh có tác dụng trên tế bào ung thư ở người và chuột. Nghiên cứu in vitro cho thấy CI-994 có tác dụng thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình trên các tế bào lympho chuột, ức chế sự tăng trưởng của tế bào BCLO bệnh bạch cầu chuột với IC50 là 2,5 μM. Một ưu điểm lớn nữa của CI-994 được quan tâm nhiều đó là nó được xem như một loại thuốc chống phân bào đường uống [37].

Dựa 12 trên những hoạt tính sinh học này, một số dẫn xuất benzamide gần đây đã được nghiên cứu thiết kế và tổng hợp thành tác nhân chống ung thư [38, 39]. Năm 2018 tác gỉa Yoshiyuki Hirata và các cộng sự [40] bằng cách cho tert-butyl 2-(4-(chloromethyl)benzamide)-4-(thiophen-2-yl) phenylcarbamate (40) phản ứng với các tác nhân khác nhau như 4-etyl-2,3-dioxo-1-piperazine, cyclo-L-prolylglycine, 1-methylpiperazine- 2,5-dione, 1-methyl-piperazine-2- one, tert-butyl 3-oxopiperazine-1-carboxylate, hay 1-ethylpiperazine, trong dung môi DMF hay THF trong sự có mặt của natri hydrid (NaH) thu được các dẫn chất trung gian 41a-f, sau đó phá nhóm Boc bằng TFA thu được các dẫn chất benzamide 42a-f (sơ đồ 1. Các chất 42a-f được thử hoạt tính với các tế bào thần kinh vỏ não bằng cách ủ các tế bào thần kinh với các hợp chất 42a-f thì thấy rằng hợp chất 42c có tỉ lệ làm chết tế bào thần kinh nhiều nhất ở dưới 1M. Đây là kết quả rất có ý nghĩa cho việc nghiên cứu thuốc của các nhà khoa học.10: Tổng hợp các hợp chất benzamide 42a-f (a) 4-ethyl-2,3-dioxo-1-piperazine, NaH, DMF; (b) cyclo-L-prolylglycine, NaH, DMF; (c) 1-methylpiperazine- 2,5-dione, NaH, DMF; (d) 1-methyl- piperazine-2-one, NaH, THF; (e) tert-butyl 3-oxopiperazine-1-carboxylate, NaH, THF; (f) 1-ethylpiperazine, NaH, THF; (h) TFA, CH2Cl2, NaHCO3.

Tiếp theo, năm 2017 tác giả Rui Xie và các cộng sự [41] đã dùng các amine cho phản ứng với CS2 và acid 4-(bromometyl) benzoic trong sự có mặt của K3PO4 thu được các dẫn chất trung gian dithiocarbamate. Sau đó, các chất trung gian dithiocarbamate cho phản ứng trực tiếp với 1,2-diaminobenzene thu được các hợp chất benzamide M101, M122, M133 (sơ đồ 1.