NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NEISSERIA MENINGITIDIS BẰNG KỸ THUẬT LAMP KẾT HỢP CRISPR-CAS

• Tác giả: Đào Thị Huyền
• Người hướng dẫn: TS. Ngô Tất Trung - Bệnh Viện Trung Ương Quân Đội 108
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di Truyền Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tối Ưu Quy Trình Phát Hiện Neisseria Meningitidis Bằng Kỹ Thuật LAMP Kết Hợp CRISPR-Cas
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh viêm màng não do não mô cầu
• 1.2. Dịch tễ bệnh viêm màng não trên thế giớ
• 1.3. Dịch tễ học viêm màng não ở Việt Nam
• 1.4. Vai trò của chẩn đoán sớm mầm bệnh trong nhiễm khuẩn do Neisseria meningitidis
• 1.5. Các phương pháp chẩn đoán Neisseria meningitidis hiện nay
• 1.5.1. Nuôi cấy vi khuẩn
• 1.5.2. Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực (Realtime PCR)
• 1.5.3. Phát hiện Neisseria meningitidis bằng phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas
• 1.5.3.1. Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp – LAMP
• 1.5.3.2. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats – CRISPR-Cas
• 1.5.3.3. Biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp và ứng dụng trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp LAMP
• 1.5.3.3.1. Protein tái tổ hợp và ứng dụng của chúng
• 1.5.3.3.2. Làm thế nào để sản xuất protein tái tổ hợp đạt chất lượng
• 1.5.3.3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp Bst large fragment ứng trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp
• 1.5.3.4. Tình hình nghiên cứu kết hợp LAMP và CRISPR-Cas trong phát hiện Neisseria meningitidis
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu, đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Nguyên vật liệu
• 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp, thời gian, địa điểm thực hiện nghiên cứu
• 2.2.2. Các bước tiến hành nghiên cứu
• 2.2.3. Thiết kế mồi/probe/gRNA cho phản ứng LAMP/ CRISPR-Cas
• 2.2.4. Tách chiết DNA chứng dương và DNA mẫu bệnh phẩm
• 2.2.5. Thiết lập dải nồng độ chuẩn dương
• 2.2.6. Biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp
• 2.2.7. Realtime PCR phát hiện N
• 2.2.8. Tối ưu phản ứng LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N
• 2.2.9. Đánh giá ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas
• 2.2.10. Phát hiện não mô cầu trên mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp LAMP-CRISPR-Cas và so sánh với Realtime-PCR
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas
• 3.2. Thiết kế mồi/probe/gRNA đặc hiệu
• 3.3. Kết quả tạo dải panel chứng dương
• 3.4. Tinh chế enzyme Bst Large Fragment (BstLF) tái tổ hợp và ứng dụng trong khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện Neisseria meningitidis
• 3.5. Kết quả tối ưu phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt LAMP
• 3.6. Kết quả tối ưu phản ứng cắt đặc hiệu bằng hệ thống CRISPR-Cas
• 3.7. Kết quả kết hợp LAMP và CRISPR-Cas đọc kết quả bằng que thử nhanh
• 3.8. Kết quả tách chiết DNA mẫu bệnh phẩm
• 3.9. Đánh giá tính ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas
• 3.10. Đánh giá ngưỡng phát hiện của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas
• 3.11. Đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas
• 3.12. Đánh giá sự tương đồng của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR/Cas so với Realtime PCR trong chẩn đoán Neisseria meningitidis trên mẫu bệnh phẩm thực tế
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: Quy trình đóng gói sinh phẩm
• PHỤ LỤC 2: Quy trình chẩn đoán Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-CAS

I. Tổng Quan Nghiên Cứu LAMP CRISPR Cas Phát Hiện N

Viêm màng não là một căn bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao, có khả năng bùng phát thành dịch và để lại di chứng nặng nề. Trong đó, não mô cầu (Neisseria meningitidis) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn và việc chẩn đoán nhanh, chính xác là hết sức cần thiết trong phòng dịch và điều trị bệnh. Hướng dẫn của CDC và WHO khuyến cáo sử dụng phương pháp nuôi cấy và sinh học phân tử dựa trên phản ứng chuỗi - PCR để chẩn đoán xác định não mô cầu. Tuy nhiên, nuôi cấy Neisseria meningitidis thường cho kết quả sau 24 giờ và có tỷ lệ âm tính giả cao, do đó làm chậm trễ quá trình điều trị bệnh. PCR đã có những cải thiện hơn như thời gian chẩn đoán nhanh, chỉ sau vài giờ. Tuy nhiên, cả hai phương pháp này đều yêu cầu thực hiện trong các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn với quy trình nghiêm ngặt. Vì vậy, ứng dụng các phương pháp chẩn đoán mới thân thiện với người dùng hơn, hạn chế sử dụng các thiết bị đắt tiền, phù hợp với thực tế lâm sàng, dễ dàng triển khai sàng lọc trong cộng đồng hoặc chẩn đoán tại các khu căn cứ quân sự với trang thiết bị đơn giản là rất cần thiết, và có tính thực tiễn cao. Xuất phát từ những đặc điểm dịch tễ và diễn biến lâm sàng của bệnh do Neisseria meningitidis, các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ngày càng được quan tâm, tiêu biểu là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (Loop-mediate isothermal amplification - LAMP) để phục vụ chẩn đoán sớm, ngay tại chỗ, chính xác mầm bệnh. Kết hợp CRISPR-Cas với LAMP vào một xét nghiệm, qua đó xây dựng một phương pháp sàng lọc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

1.1. Neisseria Meningitidis Mối Đe Dọa và Tầm Quan Trọng Chẩn Đoán

Neisseria meningitidis (não mô cầu) là một vi khuẩn song cầu gram âm, có vỏ, hiếu khí, thuộc họ Neisseriaceae. Trên thế giới đã phân loại được 13 nhóm huyết thanh, trong đó có 6 loại huyết thanh (A, B, C, W135, X và Y) gây bệnh viêm màng não hoặc nhiễm khuẩn huyết ở người, chủ yếu ở đối tượng là trẻ em và thanh thiếu niên. Theo thống kê năm 2010, bệnh viêm màng não riêng do vi khuẩn Neisseria meningitidis xảy ra với 12.833 trường hợp chiếm tỷ lệ 0,123 ca/100.000 người. Bệnh viêm màng não riêng do vi khuẩn Neisseria meningitidis xảy ra với 12.833 trường hợp chiếm tỷ lệ 0,123 ca/100.000 người, là căn nguyên phổ biến thứ 2 chỉ sau Streptococcus pneumoniae. Việc chẩn đoán sớm và chính xác mầm bệnh là yếu tố then chốt trong việc giảm tỷ lệ tử vong và di chứng của bệnh.

1.2. LAMP và CRISPR Cas Giải Pháp Chẩn Đoán Tiềm Năng

Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) có nhiều ưu điểm như giá thành rẻ, độ nhạy cao, thời gian khuếch đại nhanh (chỉ trong vòng 60 phút), có thể khuếch đại và kéo dài chuỗi trong một điều kiện nhiệt độ và chỉ yêu cầu thiết bị ủ nhiệt đơn giản. Hơn nữa, nhằm tăng tính đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán, kết hợp CRISPR-Cas với LAMP vào một xét nghiệm, qua đó xây dựng một phương pháp sàng lọc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể triển khai tại các cơ sở y tế với trang thiết bị hạn chế. Nhiều nghiên cứu công bố trên các tạp chí khoa học uy tín đã chỉ ra LAMP và CRISPR-Cas có thể kết hợp với nhau để phát hiện các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn. Cùng với yêu cầu cấp thiết một phương pháp có thể triển khai sàng lọc, phát hiện nhanh Neisseria meningitidis ngay tại thực địa, đề tài Nghiên cứu tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas được tiến hành.

II. Thách Thức Chẩn Đoán Nhanh N

Viêm màng não được coi là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, cần được chẩn đoán và điều trị càng sớm càng tốt. Biểu hiện bệnh chủ yếu là viêm màng não (70%), nhiễm khuẩn huyết đơn thuần (27%), và các biểu hiện lâm sàng khác (3%) [15]. Tỷ lệ tử vong do nhiễm não mô cầu có thể lên tới 50% ở những bệnh nhân không được điều trị. Điều trị sớm và tích cực có thể giảm tỷ lệ tử vong xuống khoảng 10 – 14% [8]. Sự phát triển và ứng dụng rộng rãi vác-xin phòng bệnh viêm màng não do não mô cầu giúp cải thiện tỷ lệ mắc mới. Tuy nhiên, ngay cả khi được điều trị, trong số những bệnh nhân sống sót vẫn có tới 11 – 19% bệnh nhân phải mang các biến chứng lâu dài. Neisseria meningitidis thường tiến triển nhanh, thời gian cửa sổ từ lúc xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong chỉ tính bằng giờ. Nghiên cứu của Thompson chỉ ra các triệu chứng không điển hình như sốt, chán ăn, buồn nôn và nôn xuất hiện trong 4-6 giờ đầu của bệnh.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Truyền Thống Trong Chẩn Đoán Nhanh

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường mất nhiều thời gian, từ 24 giờ trở lên, và có thể cho kết quả âm tính giả, đặc biệt khi bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó. Điều này làm chậm trễ quá trình điều trị, ảnh hưởng đến tiên lượng của bệnh nhân. Mặc dù phương pháp sinh học phân tử như PCR và Realtime PCR có thể cho kết quả nhanh hơn, chỉ trong vài giờ, nhưng đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm hiện đại và quy trình phức tạp, không phù hợp cho các cơ sở y tế tuyến dưới hoặc trong các tình huống khẩn cấp như dịch bệnh.

2.2. Nguy Cơ Kháng Kháng Sinh và Sự Cần Thiết Của Chẩn Đoán Chính Xác

Việc sử dụng kháng sinh bao vây, mặc dù có thể hiệu quả trong việc ngăn chặn sự lây lan của bệnh, lại tiềm ẩn nguy cơ gia tăng tình trạng kháng kháng sinh ở Neisseria meningitidis. Theo báo cáo thống kê tại Pháp, năm 2012-2015 ghi nhận chỉ khoảng 2% não mô cầu giảm nhạy cảm với cephalosporin thế hệ III [17]. Do đó, việc chẩn đoán chính xác và nhanh chóng căn nguyên gây bệnh, đặc biệt là phân biệt Neisseria meningitidis với các tác nhân khác gây viêm màng não, là vô cùng quan trọng để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và giảm thiểu nguy cơ kháng kháng sinh.

III. Phương Pháp Tối Ưu Quy Trình LAMP CRISPR Cas Cho N

Đề tài “Nghiên cứu tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas” được tiến hành với hai mục tiêu chính: Tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas. Đánh giá ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu kỹ thuật của quy trình xét nghiệm vừa xây dựng và đánh giá sự tương đồng với phương pháp Realtime PCR trong chẩn đoán Neisseria meningitidis. Nghiên cứu bao gồm các bước: Thiết kế mồi/probe/gRNA cho phản ứng LAMP/ CRISPR-Cas. Tách chiết DNA chứng dương và DNA mẫu bệnh phẩm. Thiết lập dải nồng độ chuẩn dương. Biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp. Realtime PCR phát hiện N. Tối ưu phản ứng LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N. Đánh giá ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas . Phát hiện não mô cầu trên mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp LAMP-CRISPR-Cas và so sánh với Realtime-PCR

3.1. Thiết Kế Mồi và gRNA Đặc Hiệu Cho Phản Ứng LAMP CRISPR Cas

Quá trình thiết kế mồi và gRNA đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp LAMP-CRISPR-Cas. Mồi LAMP cần được thiết kế để khuếch đại một đoạn DNA đặc trưng của Neisseria meningitidis một cách nhanh chóng và hiệu quả. gRNA, mặt khác, cần hướng dẫn enzyme Cas9 đến đúng vị trí trên đoạn DNA đã khuếch đại, đảm bảo chỉ có Neisseria meningitidis mới bị phát hiện.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Phản Ứng LAMP Để Tăng Độ Nhạy

Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ mồi, nồng độ enzyme Bst Large Fragment đều ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng LAMP. Việc tối ưu hóa các điều kiện này, thông qua các thử nghiệm và đánh giá, giúp tăng độ nhạy của phương pháp, cho phép phát hiện Neisseria meningitidis ngay cả khi nồng độ vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm rất thấp.

IV. Kết Quả Tối Ưu Hóa LAMP CRISPR Cas Phát Hiện N

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas. Kết quả cho thấy quy trình đã tối ưu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể phát hiện Neisseria meningitidis trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác. Thêm vào đó, quy trình này có thể thực hiện tại các cơ sở y tế tuyến dưới với trang thiết bị hạn chế.

4.1. Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu Của Phương Pháp LAMP CRISPR Cas

Kết quả đánh giá cho thấy phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có độ nhạy cao, có thể phát hiện Neisseria meningitidis ở nồng độ thấp. Phương pháp cũng có độ đặc hiệu cao, không phát hiện nhầm lẫn với các vi khuẩn khác gây viêm màng não. Bảng 5 Bảng phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu thực tế của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N. meningitidis so với phương pháp Realtime PCR.

4.2. So Sánh LAMP CRISPR Cas với Realtime PCR Trong Chẩn Đoán

So sánh với phương pháp Realtime PCR, phương pháp LAMP-CRISPR-Cas cho kết quả tương đồng về độ chính xác. Tuy nhiên, phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có ưu điểm là thực hiện đơn giản hơn, không yêu cầu trang thiết bị phức tạp và có thể cho kết quả nhanh hơn, phù hợp cho các cơ sở y tế tuyến dưới và trong các tình huống khẩn cấp. Bảng 2.2 Bảng so sánh kết quả chẩn đoán giữa LAMP-CRISPR/Cas và Realtime PCR

V. Ứng Dụng Thực Tế và Triển Vọng Của LAMP CRISPR Cas Cho NM

Phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán và giám sát dịch tễ học Neisseria meningitidis. Đặc biệt, phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc nhanh Neisseria meningitidis trong cộng đồng, tại các khu căn cứ quân sự hoặc trong các tình huống dịch bệnh, giúp phát hiện sớm và điều trị kịp thời cho bệnh nhân.

5.1. Phát Triển Kit Chẩn Đoán LAMP CRISPR Cas Tiện Lợi và Nhanh Chóng

Việc phát triển một bộ kit chẩn đoán LAMP-CRISPR-Cas đơn giản và dễ sử dụng sẽ giúp tăng cường khả năng ứng dụng của phương pháp này trong thực tế. Bộ kit có thể bao gồm các thành phần cần thiết cho phản ứng, hướng dẫn sử dụng chi tiết và các vật tư tiêu hao, giúp người dùng dễ dàng thực hiện xét nghiệm mà không cần đến các thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp.

5.2. Giám Sát Dịch Tễ Học Neisseria Meningitidis Trong Cộng Đồng

Phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có thể được sử dụng để giám sát dịch tễ học Neisseria meningitidis trong cộng đồng, giúp phát hiện sớm các ổ dịch và có các biện pháp phòng ngừa kịp thời. Việc sàng lọc thường xuyên các đối tượng có nguy cơ cao, như trẻ em, thanh thiếu niên và người tiếp xúc gần với bệnh nhân, có thể giúp giảm thiểu sự lây lan của bệnh.

VI. Kết Luận Tương Lai Của Chẩn Đoán N

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas trong việc phát hiện Neisseria meningitidis. Với những ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu và tính đơn giản, phương pháp này hứa hẹn sẽ đóng góp quan trọng vào việc chẩn đoán sớm, điều trị hiệu quả và kiểm soát dịch bệnh do Neisseria meningitidis gây ra.

6.1. Triển Vọng Phát Triển Các Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh Khác

Nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh khác, như sử dụng các cảm biến sinh học hoặc các kỹ thuật vi lỏng, cũng là một hướng đi tiềm năng trong tương lai. Các phương pháp này có thể cung cấp kết quả xét nghiệm trong vài phút, giúp đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng và kịp thời.

6.2. Đầu Tư Nghiên Cứu và Phát Triển Ứng Dụng LAMP CRISPR Cas

Để phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có thể được ứng dụng rộng rãi trong thực tế, cần có sự đầu tư vào nghiên cứu và phát triển, đặc biệt là trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán chất lượng cao và đào tạo đội ngũ cán bộ y tế có đủ năng lực để thực hiện xét nghiệm. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học, các nhà sản xuất và các cơ quan y tế là rất quan trọng để đưa phương pháp này đến gần hơn với người bệnh.

Tổng quan nghiên cứu

Viêm màng não do não mô cầu (Neisseria meningitidis) là một bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm với tỷ lệ tử vong lên đến 13% và khả năng bùng phát thành dịch cao. Trên toàn cầu, năm 2015 ghi nhận khoảng 8,7 triệu ca mắc viêm màng não, trong đó có 379.000 trường hợp tử vong. Tại Việt Nam, viêm màng não thường gặp ở trẻ dưới 15 tuổi, đặc biệt là nhóm dưới 1 tuổi chiếm 45,6%, với tỷ lệ tử vong khoảng 5,2%. Neisseria meningitidis là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây viêm màng não do vi khuẩn, chiếm tỷ lệ 0,46% trong các ca bệnh viêm màng não tại Việt Nam. Việc chẩn đoán sớm và chính xác mầm bệnh là yếu tố quyết định trong phòng ngừa dịch bệnh và điều trị hiệu quả.

Mục tiêu nghiên cứu là tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) kết hợp với hệ thống CRISPR-Cas, nhằm nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán, đồng thời đánh giá sự tương đồng với phương pháp Realtime PCR trên mẫu bệnh phẩm thực tế. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2022 đến tháng 9/2023 tại Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, với 139 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Neisseria meningitidis.

Ý nghĩa của nghiên cứu nằm ở việc phát triển một phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác, thân thiện với người dùng, có thể triển khai tại các cơ sở y tế với trang thiết bị hạn chế, đặc biệt phù hợp với điều kiện thực địa và các khu căn cứ quân sự. Phương pháp này góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh viêm màng não do não mô cầu, giảm thiểu tỷ lệ tử vong và di chứng lâu dài.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai nền tảng kỹ thuật chính: khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) và hệ thống CRISPR-Cas.

• Kỹ thuật LAMP: Là phương pháp khuếch đại DNA ở nhiệt độ không đổi, sử dụng enzyme DNA polymerase có hoạt tính dịch chuyển sợi (Bst DNA Polymerase) và bộ mồi gồm 4-6 đoạn đặc hiệu. LAMP có ưu điểm là thời gian khuếch đại nhanh (dưới 60 phút), độ nhạy cao, không cần thiết bị luân nhiệt phức tạp, phù hợp với điều kiện thực địa. Sản phẩm khuếch đại có cấu trúc vòng phức tạp, dễ dàng phát hiện bằng nhuộm màu hoặc đo độ đục.

• Hệ thống CRISPR-Cas: Sử dụng enzyme Cas12a có khả năng nhận biết và cắt đặc hiệu đoạn DNA mục tiêu dựa trên trình tự gRNA. Hoạt tính trans-cleavage của Cas12a cho phép cắt các đầu dò ssDNA gắn huỳnh quang, tạo tín hiệu phát hiện chính xác. Kết hợp CRISPR-Cas với LAMP giúp tăng độ đặc hiệu, giảm tỷ lệ dương tính giả.

Các khái niệm chính bao gồm: gen ctrA đặc hiệu cho Neisseria meningitidis, enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp, thiết kế mồi LAMP và gRNA CRISPR-Cas, ngưỡng phát hiện (limit of detection), độ đặc hiệu kỹ thuật.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 139 mẫu bệnh phẩm (dịch quệt nhày họng, máu, dịch não tủy) thu thập từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Neisseria meningitidis tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và nơi sinh sống của bệnh nhân.

• Phương pháp phân tích: Nghiên cứu mô tả cắt ngang, thực hiện tách chiết DNA bằng phương pháp hóa chất, biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp từ E.coli BL21(DE3)pLysS, thiết kế và tối ưu bộ mồi LAMP và gRNA CRISPR-Cas đặc hiệu gen ctrA. Phản ứng LAMP được thực hiện ở nhiệt độ 60-65°C trong 10-40 phút, kết quả được xác định bằng điện di gel agarose và đọc tín hiệu cắt probe bằng máy huỳnh quang hoặc que thử nhanh.

• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 10/2022 đến tháng 9/2023, gồm các bước: thiết kế mồi và gRNA, biểu hiện và tinh sạch enzyme, tối ưu phản ứng LAMP và CRISPR-Cas, đánh giá ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu, so sánh với phương pháp Realtime PCR.

• Phương pháp chọn mẫu: Mẫu bệnh phẩm được lựa chọn theo tiêu chuẩn nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm màng não mủ, lấy mẫu trước khi dùng kháng sinh.

• Phân tích thống kê: Sử dụng phần mềm SPSS để tính toán độ nhạy, độ đặc hiệu, phân tích thống kê Kappa đánh giá sự đồng thuận giữa phương pháp LAMP-CRISPR-Cas và Realtime PCR.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế mồi và gRNA đặc hiệu: Bộ mồi LAMP và gRNA CRISPR-Cas được thiết kế nhắm vào gen ctrA với các chỉ số nhiệt độ nóng chảy (Tm) từ 59-66°C, độ ổn định đầu 3’ (∆G ≤ –4 kcal/mol), và %GC từ 40-65%. Các trình tự được kiểm tra không bắt chéo với các chủng khác, đảm bảo tính đặc hiệu cao.

2. Biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment: Enzyme tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong E.coli BL21(DE3)pLysS, tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA đạt độ tinh khiết trên 90%, với kích thước protein khoảng 67,9 kDa. Nồng độ enzyme thu được phù hợp cho phản ứng LAMP, hoạt tính enzyme tương đương enzyme thương mại.

3. Tối ưu phản ứng LAMP và CRISPR-Cas: Phản ứng LAMP khuếch đại gen ctrA cho kết quả dải băng đặc trưng trên gel agarose, thời gian khuếch đại tối ưu là 30 phút ở 63°C. Phản ứng CRISPR-Cas cắt probe đặc hiệu trong khoảng nhiệt độ 37-42°C, thời gian cắt tối ưu 30 phút. Kết quả đọc bằng que thử nhanh cho phép phân biệt mẫu dương tính và âm tính rõ ràng.

4. Đánh giá ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu: Phương pháp LAMP-CRISPR-Cas đạt ngưỡng phát hiện 10 bản sao DNA/reaction với độ tin cậy 95%. Độ đặc hiệu kỹ thuật đạt 100% khi thử trên DNA của các vi khuẩn khác như Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae.

5. So sánh với Realtime PCR trên 139 mẫu bệnh phẩm: Phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có độ nhạy 92,5% và độ đặc hiệu 95,3% so với Realtime PCR. Phân tích thống kê Kappa cho thấy hệ số đồng thuận là 0,87, biểu thị sự tương đồng cao giữa hai phương pháp.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas có thể phát hiện nhanh và chính xác Neisseria meningitidis trên mẫu bệnh phẩm thực tế, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tương đương với phương pháp chuẩn Realtime PCR. Việc biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp trong nước giúp chủ động nguồn sinh phẩm, giảm chi phí và tăng khả năng ứng dụng thực tiễn.

Phương pháp LAMP-CRISPR-Cas khắc phục được hạn chế của nuôi cấy vi khuẩn (thời gian chờ >24 giờ, tỷ lệ âm tính giả cao) và PCR truyền thống (yêu cầu thiết bị đắt tiền, phòng thí nghiệm tiêu chuẩn). Đặc biệt, việc đọc kết quả bằng que thử nhanh giúp đơn giản hóa quy trình, phù hợp với điều kiện thực địa và các cơ sở y tế có trang thiết bị hạn chế.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này tương đương hoặc vượt trội hơn các kỹ thuật LAMP đơn thuần, nhờ sự bổ trợ của CRISPR-Cas trong việc giảm dương tính giả. Biểu đồ Venn thể hiện sự trùng khớp kết quả giữa LAMP-CRISPR-Cas và Realtime PCR trên 139 mẫu bệnh phẩm minh chứng cho tính khả thi của phương pháp trong thực tế.

Việc phát triển phương pháp này có ý nghĩa lớn trong kiểm soát dịch viêm màng não do não mô cầu, đặc biệt trong các khu vực có điều kiện cơ sở vật chất hạn chế hoặc trong các tình huống cần chẩn đoán nhanh tại hiện trường.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai phương pháp LAMP-CRISPR-Cas tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở: Đào tạo nhân viên y tế sử dụng bộ sinh phẩm và que thử nhanh, nhằm nâng cao khả năng phát hiện sớm Neisseria meningitidis, giảm thời gian chẩn đoán xuống dưới 1 giờ. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng; chủ thể: Sở Y tế, bệnh viện tuyến huyện.

2. Phát triển và sản xuất enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp trong nước: Chủ động nguồn enzyme phục vụ nghiên cứu và xét nghiệm, giảm chi phí nhập khẩu. Thời gian: 12-18 tháng; chủ thể: các viện nghiên cứu, doanh nghiệp công nghệ sinh học.

3. Xây dựng quy trình chuẩn và hướng dẫn kỹ thuật áp dụng LAMP-CRISPR-Cas: Đảm bảo tính đồng nhất và hiệu quả trong chẩn đoán, đồng thời tích hợp vào hệ thống giám sát dịch bệnh quốc gia. Thời gian: 6 tháng; chủ thể: Bộ Y tế, Trung tâm Kiểm soát bệnh tật.

4. Nghiên cứu mở rộng ứng dụng phương pháp cho các tác nhân gây viêm màng não khác: Tăng cường khả năng chẩn đoán đa tác nhân, nâng cao hiệu quả phòng chống dịch. Thời gian: 18-24 tháng; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu, trường đại học.

5. Tăng cường hợp tác quốc tế và đào tạo chuyên sâu: Nâng cao năng lực kỹ thuật và cập nhật công nghệ mới trong lĩnh vực chẩn đoán phân tử. Thời gian: liên tục; chủ thể: các tổ chức y tế, viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhân viên y tế và kỹ thuật viên phòng xét nghiệm: Nắm bắt quy trình chẩn đoán mới, nâng cao kỹ năng thực hành LAMP-CRISPR-Cas, áp dụng trong chẩn đoán nhanh tại cơ sở y tế.

2. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành di truyền học, vi sinh y học: Tham khảo phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp, kỹ thuật thiết kế mồi và gRNA, cũng như quy trình tối ưu phản ứng sinh học phân tử.

3. Cơ quan quản lý y tế và phòng chống dịch: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách, hướng dẫn kỹ thuật và triển khai xét nghiệm sàng lọc diện rộng, đặc biệt trong các vùng dịch và khu vực khó khăn.

4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và sản xuất sinh phẩm y tế: Tham khảo quy trình sản xuất enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp, phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh, mở rộng thị trường trong nước và quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có ưu điểm gì so với PCR truyền thống?
   Phương pháp này không cần thiết bị luân nhiệt phức tạp, thời gian chẩn đoán nhanh (dưới 1 giờ), chi phí thấp hơn và có thể thực hiện tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở hoặc điều kiện thực địa. Ví dụ, enzyme Bst Large Fragment hoạt động ở nhiệt độ cố định 63°C, giúp đơn giản hóa quy trình.

2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này như thế nào?
   Nghiên cứu cho thấy độ nhạy đạt 92,5% và độ đặc hiệu 95,3% so với phương pháp Realtime PCR, với ngưỡng phát hiện khoảng 10 bản sao DNA/reaction, đảm bảo phát hiện chính xác mầm bệnh trên mẫu bệnh phẩm thực tế.

3. Phương pháp có thể áp dụng cho các loại mẫu bệnh phẩm nào?
   Phương pháp được áp dụng trên dịch quệt nhày họng, máu và dịch não tủy, phù hợp với các mẫu thu thập từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Neisseria meningitidis, giúp linh hoạt trong thực tế lâm sàng.

4. Làm thế nào để đọc kết quả sau phản ứng?
   Kết quả có thể đọc bằng que thử nhanh dựa trên nguyên lý sắc ký ái lực, giúp phân biệt mẫu dương tính và âm tính rõ ràng mà không cần thiết bị phức tạp, thuận tiện cho việc chẩn đoán tại hiện trường.

5. Phương pháp có thể triển khai ở đâu?
   Phương pháp phù hợp với các cơ sở y tế tuyến cơ sở, các khu căn cứ quân sự, vùng sâu vùng xa hoặc nơi có điều kiện trang thiết bị hạn chế, giúp mở rộng khả năng sàng lọc và phát hiện sớm dịch bệnh.

Kết luận

• Phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas được tối ưu thành công để phát hiện Neisseria meningitidis với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tương đương Realtime PCR.
• Enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp được biểu hiện và tinh sạch thành công, chủ động nguồn sinh phẩm trong nước.
• Phương pháp cho phép đọc kết quả nhanh bằng que thử nhanh, phù hợp với điều kiện thực địa và cơ sở y tế hạn chế trang thiết bị.
• Nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm, hỗ trợ phòng chống dịch viêm màng não do não mô cầu tại Việt Nam.
• Đề xuất triển khai phương pháp tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở, phát triển sản xuất enzyme trong nước và mở rộng ứng dụng cho các tác nhân gây viêm màng não khác.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các cơ sở y tế và viện nghiên cứu áp dụng, đào tạo kỹ thuật viên, đồng thời phát triển sản phẩm sinh phẩm chẩn đoán thương mại dựa trên quy trình này để nâng cao năng lực phòng chống dịch bệnh.