I. Tổng Quan Nghiên Cứu LAMP CRISPR Cas Phát Hiện N
Viêm màng não là một căn bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao, có khả năng bùng phát thành dịch và để lại di chứng nặng nề. Trong đó, não mô cầu (Neisseria meningitidis) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn và việc chẩn đoán nhanh, chính xác là hết sức cần thiết trong phòng dịch và điều trị bệnh. Hướng dẫn của CDC và WHO khuyến cáo sử dụng phương pháp nuôi cấy và sinh học phân tử dựa trên phản ứng chuỗi - PCR để chẩn đoán xác định não mô cầu. Tuy nhiên, nuôi cấy Neisseria meningitidis thường cho kết quả sau 24 giờ và có tỷ lệ âm tính giả cao, do đó làm chậm trễ quá trình điều trị bệnh. PCR đã có những cải thiện hơn như thời gian chẩn đoán nhanh, chỉ sau vài giờ. Tuy nhiên, cả hai phương pháp này đều yêu cầu thực hiện trong các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn với quy trình nghiêm ngặt. Vì vậy, ứng dụng các phương pháp chẩn đoán mới thân thiện với người dùng hơn, hạn chế sử dụng các thiết bị đắt tiền, phù hợp với thực tế lâm sàng, dễ dàng triển khai sàng lọc trong cộng đồng hoặc chẩn đoán tại các khu căn cứ quân sự với trang thiết bị đơn giản là rất cần thiết, và có tính thực tiễn cao. Xuất phát từ những đặc điểm dịch tễ và diễn biến lâm sàng của bệnh do Neisseria meningitidis, các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ngày càng được quan tâm, tiêu biểu là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (Loop-mediate isothermal amplification - LAMP) để phục vụ chẩn đoán sớm, ngay tại chỗ, chính xác mầm bệnh. Kết hợp CRISPR-Cas với LAMP vào một xét nghiệm, qua đó xây dựng một phương pháp sàng lọc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
1.1. Neisseria Meningitidis Mối Đe Dọa và Tầm Quan Trọng Chẩn Đoán
Neisseria meningitidis (não mô cầu) là một vi khuẩn song cầu gram âm, có vỏ, hiếu khí, thuộc họ Neisseriaceae. Trên thế giới đã phân loại được 13 nhóm huyết thanh, trong đó có 6 loại huyết thanh (A, B, C, W135, X và Y) gây bệnh viêm màng não hoặc nhiễm khuẩn huyết ở người, chủ yếu ở đối tượng là trẻ em và thanh thiếu niên. Theo thống kê năm 2010, bệnh viêm màng não riêng do vi khuẩn Neisseria meningitidis xảy ra với 12.833 trường hợp chiếm tỷ lệ 0,123 ca/100.000 người. Bệnh viêm màng não riêng do vi khuẩn Neisseria meningitidis xảy ra với 12.833 trường hợp chiếm tỷ lệ 0,123 ca/100.000 người, là căn nguyên phổ biến thứ 2 chỉ sau Streptococcus pneumoniae. Việc chẩn đoán sớm và chính xác mầm bệnh là yếu tố then chốt trong việc giảm tỷ lệ tử vong và di chứng của bệnh.
1.2. LAMP và CRISPR Cas Giải Pháp Chẩn Đoán Tiềm Năng
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) có nhiều ưu điểm như giá thành rẻ, độ nhạy cao, thời gian khuếch đại nhanh (chỉ trong vòng 60 phút), có thể khuếch đại và kéo dài chuỗi trong một điều kiện nhiệt độ và chỉ yêu cầu thiết bị ủ nhiệt đơn giản. Hơn nữa, nhằm tăng tính đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán, kết hợp CRISPR-Cas với LAMP vào một xét nghiệm, qua đó xây dựng một phương pháp sàng lọc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể triển khai tại các cơ sở y tế với trang thiết bị hạn chế. Nhiều nghiên cứu công bố trên các tạp chí khoa học uy tín đã chỉ ra LAMP và CRISPR-Cas có thể kết hợp với nhau để phát hiện các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn. Cùng với yêu cầu cấp thiết một phương pháp có thể triển khai sàng lọc, phát hiện nhanh Neisseria meningitidis ngay tại thực địa, đề tài Nghiên cứu tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas được tiến hành.
II. Thách Thức Chẩn Đoán Nhanh N
Viêm màng não được coi là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, cần được chẩn đoán và điều trị càng sớm càng tốt. Biểu hiện bệnh chủ yếu là viêm màng não (70%), nhiễm khuẩn huyết đơn thuần (27%), và các biểu hiện lâm sàng khác (3%) [15]. Tỷ lệ tử vong do nhiễm não mô cầu có thể lên tới 50% ở những bệnh nhân không được điều trị. Điều trị sớm và tích cực có thể giảm tỷ lệ tử vong xuống khoảng 10 – 14% [8]. Sự phát triển và ứng dụng rộng rãi vác-xin phòng bệnh viêm màng não do não mô cầu giúp cải thiện tỷ lệ mắc mới. Tuy nhiên, ngay cả khi được điều trị, trong số những bệnh nhân sống sót vẫn có tới 11 – 19% bệnh nhân phải mang các biến chứng lâu dài. Neisseria meningitidis thường tiến triển nhanh, thời gian cửa sổ từ lúc xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong chỉ tính bằng giờ. Nghiên cứu của Thompson chỉ ra các triệu chứng không điển hình như sốt, chán ăn, buồn nôn và nôn xuất hiện trong 4-6 giờ đầu của bệnh.
2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Truyền Thống Trong Chẩn Đoán Nhanh
Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn thường mất nhiều thời gian, từ 24 giờ trở lên, và có thể cho kết quả âm tính giả, đặc biệt khi bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó. Điều này làm chậm trễ quá trình điều trị, ảnh hưởng đến tiên lượng của bệnh nhân. Mặc dù phương pháp sinh học phân tử như PCR và Realtime PCR có thể cho kết quả nhanh hơn, chỉ trong vài giờ, nhưng đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm hiện đại và quy trình phức tạp, không phù hợp cho các cơ sở y tế tuyến dưới hoặc trong các tình huống khẩn cấp như dịch bệnh.
2.2. Nguy Cơ Kháng Kháng Sinh và Sự Cần Thiết Của Chẩn Đoán Chính Xác
Việc sử dụng kháng sinh bao vây, mặc dù có thể hiệu quả trong việc ngăn chặn sự lây lan của bệnh, lại tiềm ẩn nguy cơ gia tăng tình trạng kháng kháng sinh ở Neisseria meningitidis. Theo báo cáo thống kê tại Pháp, năm 2012-2015 ghi nhận chỉ khoảng 2% não mô cầu giảm nhạy cảm với cephalosporin thế hệ III [17]. Do đó, việc chẩn đoán chính xác và nhanh chóng căn nguyên gây bệnh, đặc biệt là phân biệt Neisseria meningitidis với các tác nhân khác gây viêm màng não, là vô cùng quan trọng để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và giảm thiểu nguy cơ kháng kháng sinh.
III. Phương Pháp Tối Ưu Quy Trình LAMP CRISPR Cas Cho N
Đề tài “Nghiên cứu tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas” được tiến hành với hai mục tiêu chính: Tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas. Đánh giá ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu kỹ thuật của quy trình xét nghiệm vừa xây dựng và đánh giá sự tương đồng với phương pháp Realtime PCR trong chẩn đoán Neisseria meningitidis. Nghiên cứu bao gồm các bước: Thiết kế mồi/probe/gRNA cho phản ứng LAMP/ CRISPR-Cas. Tách chiết DNA chứng dương và DNA mẫu bệnh phẩm. Thiết lập dải nồng độ chuẩn dương. Biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp. Realtime PCR phát hiện N. Tối ưu phản ứng LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N. Đánh giá ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas . Phát hiện não mô cầu trên mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp LAMP-CRISPR-Cas và so sánh với Realtime-PCR
3.1. Thiết Kế Mồi và gRNA Đặc Hiệu Cho Phản Ứng LAMP CRISPR Cas
Quá trình thiết kế mồi và gRNA đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp LAMP-CRISPR-Cas. Mồi LAMP cần được thiết kế để khuếch đại một đoạn DNA đặc trưng của Neisseria meningitidis một cách nhanh chóng và hiệu quả. gRNA, mặt khác, cần hướng dẫn enzyme Cas9 đến đúng vị trí trên đoạn DNA đã khuếch đại, đảm bảo chỉ có Neisseria meningitidis mới bị phát hiện.
3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Phản Ứng LAMP Để Tăng Độ Nhạy
Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian ủ, nồng độ mồi, nồng độ enzyme Bst Large Fragment đều ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng LAMP. Việc tối ưu hóa các điều kiện này, thông qua các thử nghiệm và đánh giá, giúp tăng độ nhạy của phương pháp, cho phép phát hiện Neisseria meningitidis ngay cả khi nồng độ vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm rất thấp.
IV. Kết Quả Tối Ưu Hóa LAMP CRISPR Cas Phát Hiện N
Nghiên cứu này đã thành công trong việc tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas. Kết quả cho thấy quy trình đã tối ưu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể phát hiện Neisseria meningitidis trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác. Thêm vào đó, quy trình này có thể thực hiện tại các cơ sở y tế tuyến dưới với trang thiết bị hạn chế.
4.1. Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu Của Phương Pháp LAMP CRISPR Cas
Kết quả đánh giá cho thấy phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có độ nhạy cao, có thể phát hiện Neisseria meningitidis ở nồng độ thấp. Phương pháp cũng có độ đặc hiệu cao, không phát hiện nhầm lẫn với các vi khuẩn khác gây viêm màng não. Bảng 5 Bảng phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu thực tế của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N. meningitidis so với phương pháp Realtime PCR.
4.2. So Sánh LAMP CRISPR Cas với Realtime PCR Trong Chẩn Đoán
So sánh với phương pháp Realtime PCR, phương pháp LAMP-CRISPR-Cas cho kết quả tương đồng về độ chính xác. Tuy nhiên, phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có ưu điểm là thực hiện đơn giản hơn, không yêu cầu trang thiết bị phức tạp và có thể cho kết quả nhanh hơn, phù hợp cho các cơ sở y tế tuyến dưới và trong các tình huống khẩn cấp. Bảng 2.2 Bảng so sánh kết quả chẩn đoán giữa LAMP-CRISPR/Cas và Realtime PCR
V. Ứng Dụng Thực Tế và Triển Vọng Của LAMP CRISPR Cas Cho NM
Phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán và giám sát dịch tễ học Neisseria meningitidis. Đặc biệt, phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc nhanh Neisseria meningitidis trong cộng đồng, tại các khu căn cứ quân sự hoặc trong các tình huống dịch bệnh, giúp phát hiện sớm và điều trị kịp thời cho bệnh nhân.
5.1. Phát Triển Kit Chẩn Đoán LAMP CRISPR Cas Tiện Lợi và Nhanh Chóng
Việc phát triển một bộ kit chẩn đoán LAMP-CRISPR-Cas đơn giản và dễ sử dụng sẽ giúp tăng cường khả năng ứng dụng của phương pháp này trong thực tế. Bộ kit có thể bao gồm các thành phần cần thiết cho phản ứng, hướng dẫn sử dụng chi tiết và các vật tư tiêu hao, giúp người dùng dễ dàng thực hiện xét nghiệm mà không cần đến các thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp.
5.2. Giám Sát Dịch Tễ Học Neisseria Meningitidis Trong Cộng Đồng
Phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có thể được sử dụng để giám sát dịch tễ học Neisseria meningitidis trong cộng đồng, giúp phát hiện sớm các ổ dịch và có các biện pháp phòng ngừa kịp thời. Việc sàng lọc thường xuyên các đối tượng có nguy cơ cao, như trẻ em, thanh thiếu niên và người tiếp xúc gần với bệnh nhân, có thể giúp giảm thiểu sự lây lan của bệnh.
VI. Kết Luận Tương Lai Của Chẩn Đoán N
Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas trong việc phát hiện Neisseria meningitidis. Với những ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu và tính đơn giản, phương pháp này hứa hẹn sẽ đóng góp quan trọng vào việc chẩn đoán sớm, điều trị hiệu quả và kiểm soát dịch bệnh do Neisseria meningitidis gây ra.
6.1. Triển Vọng Phát Triển Các Phương Pháp Chẩn Đoán Nhanh Khác
Nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh khác, như sử dụng các cảm biến sinh học hoặc các kỹ thuật vi lỏng, cũng là một hướng đi tiềm năng trong tương lai. Các phương pháp này có thể cung cấp kết quả xét nghiệm trong vài phút, giúp đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng và kịp thời.
6.2. Đầu Tư Nghiên Cứu và Phát Triển Ứng Dụng LAMP CRISPR Cas
Để phương pháp LAMP-CRISPR-Cas có thể được ứng dụng rộng rãi trong thực tế, cần có sự đầu tư vào nghiên cứu và phát triển, đặc biệt là trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán chất lượng cao và đào tạo đội ngũ cán bộ y tế có đủ năng lực để thực hiện xét nghiệm. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học, các nhà sản xuất và các cơ quan y tế là rất quan trọng để đưa phương pháp này đến gần hơn với người bệnh.
