Tổng quan luận án

Viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây tổn thương hệ thần kinh trung ương do vi rút thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae gây ra, lây truyền chủ yếu qua muỗi đốt sang người và động vật. Theo thống kê dịch tễ trong văn bản, khu vực lưu hành bệnh bao gồm gần 3 tỷ người tại châu Á và vùng Viễn Đông Liên bang Nga, với ước tính khoảng 25.000 ca bệnh mỗi năm; trong đó tỷ lệ tử vong chiếm từ 20% đến 30%, và 30% đến 50% số người sống sót phải chịu di chứng thần kinh vĩnh viễn (như liệt vận động, co giật, mù, điếc). Tại Việt Nam, hàng năm ghi nhận khoảng 2.000 trường hợp viêm não cấp nghi do vi rút, trong đó vi rút VNNB chiếm 70% đến 75%. Do chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, tiêm chủng vắc xin là biện pháp phòng bệnh chủ yếu.

Từ năm 1989, Việt Nam đã sản xuất và sử dụng vắc xin VNNB bất hoạt từ não chuột (vắc xin JEVAX). Mặc dù có hiệu quả phòng ngừa tốt, công nghệ nuôi cấy trên não chuột bộc lộ các hạn chế: hiệu suất thu hoạch thấp (khoảng 4–5 liều/não chuột), quy trình xử lý cồng kềnh, lượng chất thải lớn, yêu cầu chăn nuôi đàn chuột sạch nghiêm ngặt và nguy cơ tồn dư myelin gây phản ứng phụ thần kinh. Nhằm chuyển đổi sang công nghệ nuôi cấy tế bào thường trực có năng suất cao và an toàn hơn, Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã phát triển vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero sử dụng chủng vi rút Beijing-1 (vắc xin JECEVAX).

Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG/WHO) tại tài liệu hướng dẫn WHO TRS số 963 đã quy định các chỉ tiêu chung đối với vắc xin bất hoạt nhưng chưa ban hành quy chuẩn cụ thể cho từng chủng vi rút riêng biệt về hiệu giá tối thiểu, tính ổn định di truyền, số đời cấy chuyển giới hạn và điều kiện bảo quản ngân hàng chủng. Khoảng trống này đòi hỏi phải có nghiên cứu thiết lập bộ tiêu chuẩn kỹ thuật hoàn chỉnh cho chủng vi rút phục vụ sản xuất.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu (được đánh số theo văn bản):

  1. Nghiên cứu tính ổn định về hiệu giá, ổn định về di truyền và tính sinh miễn dịch của chủng vi rút sản xuất vắc xin VNNB theo thời gian (sau sản xuất: 0, 3, 4, 6, 8, 9, 10 năm) ở nhiệt độ Nitrogen lỏng; ở các nhiệt độ bảo quản khác (-20°C sau bảo quản: 1, 3, 6 tháng; 2–8°C sau bảo quản: 1, 3, 5, 7 ngày).
  2. Nghiên cứu sự tương đồng nucleotide và axít amin Protein E của chủng sản xuất so với các chủng VNNB lưu hành ở Việt Nam từ 1964–2014.
  3. Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trong 10 lô vắc xin JECEVAX được sản xuất từ lô WSV ở quy mô phòng thí nghiệm.
  4. Xây dựng 9 chỉ tiêu, phương pháp và tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Lô chủng giống gốc BV-MSV-0210 (Master Seed Virus) và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 (Working Seed Virus) của vi rút VNNB Beijing-1 (nguồn gốc từ Viện Kanonji, Đại học Osaka, Nhật Bản); 10 lô vắc xin JECEVAX dạng dung dịch tiêm sản xuất từ lô BV-WSV-0310.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Công ty VABIOTECH, Khoa Vi rút thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (NIHE), Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học, và Khoa Kiểm định Vắc xin Vi rút thuộc Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB).
  • Phạm vi thời gian: Dữ liệu chủng giống và các lô vắc xin được theo dõi, đánh giá ổn định từ năm 2010 đến năm 2020; phân tích dữ liệu dịch tễ các chủng VNNB lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 1964–2014.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu cấu trúc phân tử vi rút VNNB và quá trình phát triển các thế hệ vắc xin trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Nghiên cứu cấu trúc vi rút và kháng nguyên: Vi rút VNNB có đường kính 40–50 nm, hệ gen RNA sợi đơn dương dài khoảng 11.000 nucleotide, mã hóa 3 protein cấu trúc (C, preM/M, E) và 7 protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Protein E (Envelope, dài 500 axít amin tương ứng vùng gen 1.500 bp) là kháng nguyên bề mặt quan trọng nhất, mang các epitop gây ngưng kết hồng cầu (HA) và kích thích tạo kháng thể trung hòa (NT) bảo vệ cơ thể.
  • Các công trình phát triển vắc xin não chuột: Takanouchi và cộng sự (1938) lần đầu sản xuất vắc xin bất hoạt từ não chuột. Takaku (1965, 1968) áp dụng phương pháp hóa lý tinh chế vắc xin, hạ nồng độ protein tạp xuống 10–25 µg/ml. Fukai (1971, Viện Biken) hoàn thiện quy trình kiểm soát hàm lượng protein dưới 80 µg/ml, được WHO đưa vào tiêu chuẩn quốc tế.
  • Nghiên cứu vắc xin sống giảm độc lực và vắc xin tế bào: Yu và cộng sự (1973, 1981), Chen và Wang (1974) chọn lọc thành công chủng sống giảm độc lực SA14-14-2 trên tế bào thận chuột Hamster tiên phát (PHK). Viện Sản xuất Sinh phẩm Bắc Kinh, Thành Đô, Vũ Hán ứng dụng chủng Beijing-3 (P3) trên tế bào PHK. Tại Nhật Bản và Châu Âu, các chế phẩm vắc xin bất hoạt tinh khiết trên tế bào Vero như IC51 (IXIARO/JESPECT của Intercell/Novartis), JE-VC, BK-VJE (Biken), ENCEVAC/KD-287 (Kaketsuken) được cấp phép sử dụng.
  • So sánh các chủng sản xuất vắc xin: Kurane, Takasaki, Ku và cộng sự (1994) chứng minh chủng Beijing-1 có khả năng tạo hiệu giá kháng thể trung hòa cao, phổ miễn dịch chéo rộng hơn chủng Nakayama-NIH đối với các biến thể di truyền khác nhau của vi rút VNNB.
  • Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam: Đỗ Quang Hà (thập kỷ 1970) thử nghiệm nuôi cấy trên tế bào thận lợn tiên phát nhưng chưa đạt đáp ứng miễn dịch thực địa. Huỳnh Thị Phương Liên và cộng sự (VABIOTECH) tiếp nhận công nghệ Nhật Bản sản xuất thành công JEVAX (1989) và bắt đầu nghiên cứu vắc xin tế bào Vero JECEVAX từ năm 2006.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết: Mặc dù công nghệ sản xuất trên tế bào Vero đã được định hình, việc thiết lập ngân hàng chủng giống vi rút Beijing-1 thích ứng trên tế bào Vero tại Việt Nam đòi hỏi một hệ thống dữ liệu thực nghiệm toàn diện về: biến đổi di truyền qua các đời cấy chuyển, độ ổn định hiệu giá dưới các mức nhiệt độ lưu trữ dài hạn và ngắn hạn, độ tương đồng với các chủng vi rút đang lưu hành tại Việt Nam, cũng như mức độ an toàn và tính sinh miễn dịch của sản phẩm vắc xin tạo thành. Luận án thực hiện nhiệm vụ xác lập các tiêu chí định lượng và phương pháp kiểm định chuẩn hóa cho ngân hàng chủng này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và tiếp cận nghiên cứu

Luận án tiếp cận dựa trên các hướng dẫn quy chuẩn của TCYTTG về sản xuất và kiểm định vắc xin bất hoạt (WHO Technical Report Series số 878, 962, 963), nguyên tắc Thực hành tốt sản xuất thuốc (GMP) và Dược điển Việt Nam. Đánh giá chất lượng chủng vi rút được xây dựng thông qua hệ sinh thống 3 tầng dữ liệu: sinh học phân tử (tính ổn định bộ gen mã hóa kháng nguyên E), vi sinh vật học (in vitro trên dòng tế bào Vero, BHK-21, MRC-5) và sinh học thực nghiệm (in vivo trên động vật thí nghiệm).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng thiết kế thực nghiệm định lượng kết hợp phân tích phòng thí nghiệm:

  1. Phương pháp xác định danh tính và độ ổn định di truyền:

    • Nhận dạng kháng nguyên: Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA-Ag) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu VNNB sản xuất từ chuột Swiss.
    • Phân tích phân tử: Tách chiết RNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA mini; khuếch đại gen E (1.500 bp) bằng kỹ thuật RT-PCR với bộ kít SuperScript One-Step with Platinum Taq; giải trình tự nucleotide bằng máy giải trình tự thế hệ mới NGS và phần mềm chuyên dụng (bộ kít BigDye Terminator v3.1); so sánh độ tương đồng nucleotide và axít amin với chủng tham chiếu quốc tế Beijing-1 Kanonji (mã số L48961.1 trên NCBI) và các chủng vi rút VNNB phân lập tại Việt Nam giai đoạn 1964–2014.

  2. Phương pháp xác định hiệu giá vi rút và độ ổn định bảo quản:

    • Thử nghiệm tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit - PFU/ml) trên thảm tế bào BHK-21 và tế bào Vero, nhuộm cố định bằng dung dịch Crystal violet 5%.
    • Xác định liều gây chết 50% (LD50) qua đường tiêm nội sọ trên chuột nhắt trắng Swiss/ICR 1–3 ngày tuổi.
    • Đánh giá hiệu giá chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) lưu trữ trong nitrogen lỏng (-196°C) tại các mốc 0, 3, 4, 6, 8, 9, 10 năm; ở nhiệt độ -20°C sau 1, 3, 6 tháng; ở nhiệt độ 2–8°C sau 1, 3, 5, 7 ngày.

  3. Phương pháp kiểm tra tạp nhiễm sinh học:

    • Kiểm tra vô trùng: Nuôi cấy trong môi trường Canh thang Thioglycolate (FTM) ở nhiệt độ 30–35°C và 20–25°C để phát hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí và vi nấm.
    • Kiểm tra Mycoplasma: Nuôi cấy trên môi trường thạch và canh thang PPLO ở điều kiện hiếu khí và vi hiếu khí.
    • Kiểm tra vi rút ngoại lai: Thử nghiệm in vivo trên chuột nhắt trắng, chuột nhắt mút sữa, chuột lang, thỏ; thử nghiệm in vitro bằng cách gây nhiễm lên tế bào thận khỉ xanh (Vero CCL81), tế bào thận chuột Hamster sơ sinh (BHK-21) và tế bào lưỡng bội người (MRC-5) để theo dõi hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE).

  4. Phương pháp kiểm định chất lượng 10 lô vắc xin thành phẩm JECEVAX:

    • An toàn chung (an toàn không đặc hiệu): Tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng (11–13 g) và chuột lang (250–450 g), theo dõi sự thay đổi trọng lượng và triệu chứng trong 7 ngày.
    • An toàn đặc hiệu: Tiêm nội sọ chuột nhắt trắng 3 tuần tuổi để kiểm tra sự bất hoạt hoàn toàn của vi rút.
    • Thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogen test): Đo thân nhiệt tự động trên thỏ New Zealand bằng hệ thống Ellab (độ chính xác 0,1°C) sau khi tiêm tĩnh mạch tai; đánh giá mức tăng nhiệt độ tổng số.
    • Các chỉ số hóa lý: Định lượng Formaldehyde tồn dư, Thimerosal tồn dư, Protein tổng số, DNA tồn dư tế bào Vero, đo pH và tỷ trọng.
    • Thử nghiệm công hiệu (tính sinh miễn dịch): Đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKTTH) trên chuột nhắt trắng bằng thử nghiệm trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50), đối chiếu tương quan với mẫu chuẩn quốc tế vắc xin Beijing-1 (BR209).

Nguồn vật liệu và mẫu nghiên cứu

  • Mẫu nghiên cứu: Lô chủng gốc BV-MSV-0210 (30 lọ, thiết lập tháng 2/2010), lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 (50 lọ, thiết lập tháng 3/2010).
  • Vắc xin kiểm định: 10 lô vắc xin JECEVAX sản xuất từ năm 2010 đến 2018 (dung tích 0,5 ml/lọ và 1,0 ml/lọ, số lượng từ 85 đến 200 lọ/lô).
  • Động vật thí nghiệm: 80 chuột nhắt ổ Swiss/ICR (1–3 ngày tuổi), 600 chuột nhắt trắng (3 tuần tuổi, 11–13 g), 350 chuột nhắt trắng (4 tuần tuổi, 17–22 g), 40 chuột lang Việt Nam (250–450 g), 60 thỏ New Zealand (1,8–2,5 kg).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan nghiên cứu

Chương này trình bày toàn diện cơ sở sinh học và dịch tễ học của vi rút VNNB, lịch sử chế tạo vắc xin, đặc tính các dòng tế bào nuôi cấy và hướng dẫn chuẩn mực của WHO:

  • Cấu trúc phân tử Flavivirus: Hệ gen RNA đơn cực tính dương 11 kb, cấu tạo hạt vi rút gồm 6% RNA, 66% protein, 17% lipid và 9% carbohydrate; tỷ trọng 1,19–1,20 g/cm³ trong dung dịch đường và 1,22–1,24 g/cm³ trong CsCl, hệ số lắng 200S. Vi rút bền vững ở pH 7,0–9,0 (tối ưu tại pH 8,0); dễ bị phá hủy bởi dung môi hòa tan lipid, tia cực tím, formaldehyde và nhiệt độ cao (50°C trong 50 phút).
  • Chức năng protein và dịch tễ học phân tử: Protein E đảm nhiệm việc gắn kết thụ thể và hòa màng tế bào. Dựa trên trình tự gen E, vi rút VNNB được phân chia thành 5 kiểu gen (Genotype I đến V), trong đó các chủng vắc xin phổ biến (Nakayama, Beijing-1, Beijing-3, SA14-14-2) đều thuộc Genotype III. Tại Việt Nam, các chủng lưu hành tự nhiên thuộc Genotype I và III.
  • Đặc điểm dòng tế bào Vero: Dòng tế bào biểu mô thận khỉ xanh Châu Phi (Vero CCL81) do Yasumura và Kawakita thiết lập năm 1962. Văn bản phân tích lịch sử kiểm định độ an toàn sinh học của dòng tế bào này (không mang mầm bệnh ngoại lai, không tạo u bướu đến đời 169) và giới hạn đời cấy chuyển cho phép đưa vào sản xuất theo quy định quốc tế là đời P142 đến P150.
  • Lịch sử thiết lập chủng tại VABIOTECH: Chủng Beijing-1 nhận từ Viện Kanonji (đã qua 41 đời cấy chuyển - P41) được xem là P0 tại Việt Nam. Quy trình thiết lập hệ thống ngân hàng chủng trải qua 7 đời cấy chuyển liên tiếp: đời P1 (P42) nhân trên não chuột; các đời từ P2 (P43) đến P7 (P48) nhân trên tế bào Vero. Lô chủng giống gốc BV-MSV-0210 tương ứng đời P6 (P47), lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 tương ứng đời P7 (P48).
Sơ đồ cấy chuyển thiết lập ngân hàng chủng:
P0 (Kanonji P41)

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy cách các lô mẫu nghiên cứu, trang thiết bị, hóa chất, thiết kế thực nghiệm và quy trình thao tác chuẩn cho từng thử nghiệm kiểm định chất lượng.

Danh mục đối tượng nghiên cứu Ký hiệu lô Thời gian sản xuất Quy cách đóng gói Số lượng mẫu kiểm nghiệm
Chủng giống gốc BV-MSV-0210 Tháng 2/2010 1 ml/tuýp 30 tuýp
Chủng giống sản xuất BV-WSV-0310 Tháng 3/2010 1 ml/tuýp 50 tuýp
Vắc xin thử nghiệm (10 lô) J-VC010810 đến J-VC010818 2010 – 2018 0,5 ml/lọ và 1,0 ml/lọ 85 – 200 lọ/lô

Chương này quy định chi tiết tiêu chí đánh giá cho các thử nghiệm:

  • Hiệu giá vi rút: Đo bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử (PFU/ml) trên tế bào BHK-21 và đo độc lực LD50 trên não chuột nhắt Swiss sơ sinh.
  • Kiểm soát an toàn sinh học: Phương pháp kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn trên môi trường FTM (ủ 14 ngày), kiểm tra Mycoplasma trên môi trường thạch/canh thang PPLO, kiểm tra vi rút ngoại lai trên tế bào Vero, BHK-21, MRC-5 và động vật thí nghiệm theo Dược điển.
  • Kiểm định hóa lý và công hiệu vắc xin: Quy trình định lượng Formaldehyde bằng phản ứng so màu với acetylacetone, Thimerosal bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử, Protein tổng số theo phương pháp Bradford/Lowry, DNA tồn dư bằng Real-time PCR; thử nghiệm vô trùng, thử chất gây sốt trên thỏ và đánh giá công hiệu tương đối bằng PRNT50 so với mẫu chuẩn BR209.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm chi tiết qua 4 nội dung trọng tâm:

  1. Độ ổn định hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1:
    • Hiệu giá vi rút ban đầu: Lô chủng gốc BV-MSV-0210 đạt hiệu giá $8,72 \times 10^7\text{ PFU/ml}$ ($7,94\log\text{ PFU/ml}$); lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 đạt $3,93 \times 10^7\text{ PFU/ml}$ ($7,59\log\text{ PFU/ml}$). Thử nghiệm trên não chuột cho thấy giá trị LD50 của chủng gốc và chủng sản xuất đều đạt trên $7,5\log\text{ LD}_{50}/\text{ml}$.
    • Độ ổn định bảo quản trong nitrogen lỏng: Sau 10 năm lưu trữ (-196°C), hiệu giá của cả hai lô chủng duy trì ổn định, không suy giảm có ý nghĩa thống kê và luôn đạt $\ge 6\log\text{ PFU/ml}$.
    • Độ ổn định ở các nhiệt độ khác: Tại điều kiện -20°C, chủng sản xuất BV-WSV-0310 duy trì hiệu giá đạt yêu cầu trong 3 tháng (suy giảm rõ rệt sau 6 tháng). Tại điều kiện 2–8°C, hiệu giá duy trì đạt yêu cầu trong 3 ngày (giảm mạnh sau 5 và 7 ngày).
Điều kiện bảo quản Thời gian bảo quản kiểm tra Hiệu giá vi rút (log PFU/ml) Đánh giá độ ổn định
Nitrogen lỏng (-196°C) 0, 3, 4, 6, 8, 9, 10 năm Duy trì $\ge 7,0\log$ Đạt yêu cầu ổn định dài hạn ($\ge 10$ năm)
Tủ đông sâu (-20°C) 1 tháng, 3 tháng, 6 tháng 1–3 tháng: $\ge 6,0\log$; 6 tháng: $< 6,0\log$ Ổn định trong giới hạn 3 tháng
Tủ mát (2–8°C) 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày 1–3 ngày: $\ge 6,0\log$; 5–7 ngày: $< 5,0\log$ Ổn định trong giới hạn 3 ngày

  1. Độ ổn định di truyền và phân tích tương đồng phân tử:

    • Giải trình tự đoạn gen E (1.500 bp) chứng minh chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV-0310 có độ tương đồng 100% về trình tự nucleotide và axít amin so với nhau và so với chủng chuẩn tham chiếu Beijing-1 Kanonji. Không xuất hiện đột biến điểm hay sai lệch dịch mã qua các đời cấy chuyển từ P0 đến P7.
    • So sánh với các chủng VNNB hoang dại phân lập tại Việt Nam (1964–2014): mức độ tương đồng nucleotide đạt 92,7% đến 98,6%, tương đồng axít amin đạt 97,4% đến 99,4%. Các vị trí epitop quyết định tính kháng nguyên trên vỏ protein E hoàn toàn được bảo tồn.

  2. Kết quả kiểm định an toàn và công hiệu trên 10 lô vắc xin JECEVAX:

    • An toàn sinh học: 10/10 lô đạt độ vô trùng tuyệt đối, âm tính với Mycoplasma và không chứa vi rút ngoại lai.
    • An toàn động vật: 10/10 lô đạt thử nghiệm an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang (động vật tăng trọng bình thường, không có dấu hiệu bệnh lý); đạt thử nghiệm an toàn đặc hiệu trên chuột nhắt (100% chuột sống khỏe mạnh, không triệu chứng viêm não); thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ có tổng mức tăng nhiệt độ của 3 thỏ/lô dao động từ 0,2°C đến 0,6°C (đạt tiêu chuẩn $< 1,3^\circ\text{C}$).
    • Chỉ tiêu hóa lý: Hàm lượng Protein tổng số từ 12,5 đến 26,4 µg/ml (quy định $\le 80\ \mu\text{g/ml}$); Formaldehyde tồn dư từ 1,8 đến 4,2 µg/ml (quy định $\le 10\ \mu\text{g/ml}$); Thimerosal tồn dư từ 75 đến 98 µg/ml (quy định $\le 120\ \mu\text{g/ml}$); DNA tồn dư tế bào Vero từ 0,8 đến 2,4 ng/ml (quy định $\le 10\text{ ng/ml}$); pH ổn định trong khoảng 7,0 đến 7,2.
    • Tính sinh miễn dịch: Tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh kháng thể trung hòa trên chuột đạt 100%; công hiệu tương quan của 10 lô vắc xin thử nghiệm so với mẫu chuẩn quốc tế BR209 dao động từ 1,12 đến 1,48 (đạt tiêu chuẩn $\ge 1,0$).

  3. Bộ tiêu chuẩn chất lượng chủng vi rút Beijing-1 được xây dựng: Luận án đã tổng hợp và xác lập hệ thống 9 chỉ tiêu chất lượng hoàn chỉnh cho ngân hàng chủng phục vụ sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn

  1. Luận án là công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam thiết lập một cách có hệ thống cơ sở dữ liệu khoa học và xây dựng bộ tiêu chuẩn chất lượng cho ngân hàng chủng giống gốc (Master Seed Virus) và chủng sản xuất (Working Seed Virus) vi rút VNNB Beijing-1 nuôi cấy trên tế bào Vero.
  2. Xác định chính xác khung nhiệt độ và thời gian bảo quản duy trì hiệu giá vi rút $\ge 6\log\text{ PFU/ml}$: bảo quản trong nitrogen lỏng ổn định ít nhất 10 năm; bảo quản ở -20°C ổn định trong 3 tháng; bảo quản ở 2–8°C ổn định trong 3 ngày.
  3. Cung cấp bằng chứng sinh học phân tử khẳng định sự ổn định di truyền tuyệt đối (100% tương đồng nucleotide và axít amin đoạn gen E) của chủng Beijing-1 qua 7 đời cấy chuyển tại Việt Nam, đồng thời chứng minh mức độ tương đồng cao ($\ge 97,4%$ axít amin) với các chủng VNNB lưu hành tại Việt Nam qua các thời kỳ.
  4. Xây dựng và chuẩn hóa 9 chỉ tiêu chất lượng cùng phương pháp kiểm nghiệm tương ứng cho chủng vi rút phục vụ sản xuất vắc xin JECEVAX:
STT Chỉ tiêu chất lượng Phương pháp kiểm tra Tiêu chuẩn chấp thuận
1 Nhận dạng chủng ELISA / RT-PCR Đúng chủng vi rút VNNB Beijing-1
2 Thử nghiệm vô trùng Nuôi cấy FTM (20–25°C và 30–35°C) Vô trùng, không có vi khuẩn và vi nấm
3 Thử nghiệm Mycoplasma Nuôi cấy thạch và canh thang PPLO Âm tính
4 Vi rút ngoại lai (in vitro) Nuôi cấy trên tế bào Vero, BHK-21, MRC-5 Không gây hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE)
5 Vi rút ngoại lai (in vivo) Tiêm chuột nhắt, chuột mút sữa, chuột lang Động vật sống khỏe mạnh, không bệnh tích
6 Hiệu giá vi rút Tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK-21 $\ge 6,0\log\text{ PFU/ml}$
7 Độ ổn định di truyền Giải trình tự gen E (1.500 bp) Tương đồng 100% với chủng chuẩn Kanonji
8 Giới hạn đời cấy chuyển Theo dõi hồ sơ lý lịch cấy chuyển Chủng gốc $\le\text{P6 (P47)}$; Chủng sản xuất $\le\text{P7 (P48)}$
9 Đánh giá công hiệu chủng Đánh giá vắc xin thành phẩm (PRNT50) Tương quan công hiệu so với mẫu chuẩn $\ge 1,0$

Kiến nghị và ứng dụng

  • Kiến nghị đơn vị sản xuất (VABIOTECH) áp dụng chính thức bộ tiêu chuẩn cơ sở gồm 9 chỉ tiêu này để kiểm soát chất lượng các lô chủng giống vi rút VNNB Beijing-1.
  • Sử dụng toàn bộ hồ sơ dữ liệu kiểm định làm căn cứ kỹ thuật để hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành vắc xin JECEVAX tại Bộ Y tế, tiến tới thay thế hoàn toàn vắc xin não chuột truyền thống trong Chương trình Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Các dữ liệu kiểm tra tính sinh miễn dịch và tính an toàn của chủng trong phạm vi nghiên cứu của luận án được thực hiện trên 10 lô vắc xin sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm và trên mô hình động vật thực nghiệm; chưa tích hợp toàn bộ số liệu theo dõi đáp ứng miễn dịch dài hạn trên người từ các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng diện rộng.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục theo dõi độ ổn định hiệu giá của ngân hàng chủng bảo quản trong nitrogen lỏng tại các mốc thời gian dài hơn (15–20 năm); đồng thời nghiên cứu mở rộng đánh giá hiệu lực bảo vệ chéo của kháng thể tạo bởi vắc xin JECEVAX đối với các chủng vi rút VNNB thuộc Genotype I mới xuất hiện tại khu vực Đông Nam Á.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nhà sản xuất vắc xin và sinh phẩm: Cung cấp quy trình thao tác chuẩn (SOP) và thông số kỹ thuật chính xác cho việc thiết lập, nhân dòng, kiểm soát tạp nhiễm và lưu trữ ngân hàng chủng vi rút trên tế bào Vero.
  • Đối với cơ quan kiểm định quốc gia (NICVB): Là tài liệu tham khảo thực chứng để xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia, dược điển chuyên luận về kiểm định chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin phòng bệnh do vi rút.
  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Cung cấp phương pháp luận chuẩn mực trong thiết kế thực nghiệm đánh giá đặc tính sinh học, phân tích di truyền phân tử và kiểm soát chất lượng sinh phẩm y tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi rút Beijing-1 sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và số đời cấy chuyển tại Việt Nam được kiểm soát như thế nào?
Chủng Beijing-1 được tiếp nhận từ Viện Kanonji thuộc Đại học Osaka (Nhật Bản) ở đời cấy chuyển thứ 41 (P41, quy ước là P0 tại Việt Nam). Tại VABIOTECH, chủng được cấy chuyển 1 lần trên não chuột (P1) và 6 lần liên tiếp trên tế bào Vero; trong đó lô chủng gốc BV-MSV-0210 dừng ở đời P6 (P47 tính từ gốc) và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 dừng ở đời P7 (P48 tính từ gốc).

2. Điều kiện và thời gian bảo quản tối ưu để duy trì hiệu giá chủng vi rút Beijing-1 là gì?
Kết quả thực nghiệm xác định: trong môi trường nitrogen lỏng (-196°C), chủng vi rút duy trì hiệu giá $\ge 6\log\text{ PFU/ml}$ ổn định trong ít nhất 10 năm; ở nhiệt độ -20°C, hiệu giá duy trì đạt yêu cầu trong tối đa 3 tháng; ở nhiệt độ 2–8°C, hiệu giá chỉ duy trì đạt chuẩn trong vòng 3 ngày.

3. Mức độ ổn định di truyền của chủng Beijing-1 qua các đời cấy chuyển được đánh giá qua chỉ số nào?
Độ ổn định di truyền được xác định qua việc giải trình tự toàn bộ 1.500 nucleotide vùng gen E (mã hóa 500 axít amin của protein vỏ). Kết quả phân tích cho thấy cả chủng gốc BV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV-WSV-0310 đạt tỷ lệ tương đồng 100% về cả nucleotide và axít amin so với chủng tham chiếu quốc tế Beijing-1 Kanonji.

4. Các chỉ tiêu an toàn và hóa lý chính của 10 lô vắc xin thử nghiệm JECEVAX đạt kết quả ra sao so với quy chuẩn TCYTTG?
10 lô vắc xin đều đạt độ vô trùng, an toàn chung trên chuột nhắt/chuột lang, an toàn đặc hiệu trên chuột, thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ đạt chuẩn (mức tăng thân nhiệt từ 0,2 đến 0,6°C). Các chỉ số hóa lý đều nằm trong ngưỡng an toàn: protein tổng số 12,5–26,4 µg/ml ($\le 80\ \mu\text{g/ml}$), formaldehyde 1,8–4,2 µg/ml ($\le 10\ \mu\text{g/ml}$), thimerosal 75–98 µg/ml ($\le 120\ \mu\text{g/ml}$), DNA tồn dư tế bào Vero 0,8–2,4 ng/ml ($\le 10\text{ ng/ml}$).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý đã giải quyết trọn vẹn yêu cầu khoa học và thực tiễn trong việc xây dựng hệ thống tiêu chuẩn chất lượng cho ngân hàng chủng vi rút VNNB Beijing-1 nuôi cấy trên tế bào Vero tại Việt Nam. Công trình đã cung cấp đầy đủ các cứ liệu thực nghiệm về độ ổn định hiệu giá, tính toàn vẹn di truyền vùng gen E, cũng như chứng minh tính an toàn và tính sinh miễn dịch của sản phẩm vắc xin JECEVAX tạo thành từ lô chủng sản xuất. Bộ tiêu chuẩn 9 chỉ tiêu được đề xuất là cơ sở kỹ thuật cốt lõi giúp nhà sản xuất VABIOTECH kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu sinh học và hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành vắc xin bất hoạt thế hệ mới tại Việt Nam.