Luận án tiến sĩ xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng clostridium difficile mang gen độc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy

Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng clostridium difficile, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Đặng Thị Thùy Dương
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Thị Việt Hà
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile và đặc điểm dịch tễ học phân tử từ bệnh nhân tiêu chảy
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. LỜI CAM ĐOAN
• 1.2. LỜI CẢM ƠN
• 1.3. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1.4. DANH MỤC HÌNH
• 1.5. DANH MỤC BẢNG
• 1.6. MỞ ĐẦU
• 1.6.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.6.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.6.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
• 1.6.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 2.1. TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH
• 2.1.1. Định nghĩa Tiêu chảy sau dùng kháng sinh
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile

Nghiên cứu đã xác định tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện lớn ở Hà Nội. Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm đạt 24,9%, một con số đáng chú ý trong bối cảnh lạm dụng kháng sinh hiện nay. Việc xác định tỉ lệ này không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình dịch tễ học mà còn nhấn mạnh vai trò của Clostridium difficile trong các ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Theo nghiên cứu, tỉ lệ nhiễm có sự khác biệt rõ rệt giữa các bệnh viện và các đặc điểm nhân khẩu học của bệnh nhân. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả hơn trong môi trường bệnh viện.

1.1. Đặc điểm dịch tễ học

Đặc điểm dịch tễ học của Clostridium difficile cho thấy sự phân bố của các ribotype khác nhau giữa các bệnh viện. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các ribotype phổ biến như trf, 017, cc835 và og39 có mặt tại bốn bệnh viện ở Hà Nội. Sự phân bố này không chỉ phản ánh tình hình nhiễm trùng mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho các nhà dịch tễ học trong việc theo dõi và kiểm soát dịch bệnh. Việc phân tích các ribotype cũng giúp xác định mối liên hệ giữa các chủng vi khuẩn và các vụ dịch trong tương lai.

II. Đặc điểm dịch tễ học phân tử

Nghiên cứu đã phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang gen độc tố thông qua các phương pháp phân loại phân tử như PCR ribotyping và giải trình tự gen slpA. Kết quả cho thấy sự đa dạng gen giữa các chủng, với sự xuất hiện của hai phân nhóm slpAST mới là fr-23 và fr-24. Những phát hiện này không chỉ làm phong phú thêm kiến thức về Clostridium difficile mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới về nguồn gốc và sự lây lan của các chủng vi khuẩn này trong cộng đồng. Việc xác định các đặc điểm gen này có thể giúp các nhà nghiên cứu và các nhà quản lý y tế có những biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

2.1. Phân loại gen

Phân loại gen của Clostridium difficile cho thấy sự phân bố không đồng đều của các ribotype trong quần thể bệnh nhân. Các ribotype như trf và 017 được xác định là phổ biến nhất, cho thấy sự lây lan của các chủng này trong môi trường bệnh viện. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát hiện và kiểm soát các vụ dịch có thể xảy ra. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc theo dõi các ribotype này có thể giúp phát hiện sớm các chủng vi khuẩn mới nổi, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố là 24,9%, điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải tiến hành xét nghiệm phân tìm Clostridium difficile trong các ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Thông tin này sẽ hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong việc lựa chọn liệu pháp điều trị phù hợp, đồng thời giúp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện hiệu quả hơn. Hơn nữa, việc phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các biện pháp phòng chống dịch bệnh trong tương lai.

3.1. Ứng dụng trong y tế

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc xây dựng các chương trình giám sát và kiểm soát nhiễm khuẩn tại các bệnh viện. Việc xác định tỉ lệ nhiễm và đặc điểm dịch tễ học phân tử của Clostridium difficile sẽ giúp các nhà quản lý y tế có cái nhìn tổng quan về tình hình nhiễm trùng trong cộng đồng. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu gánh nặng cho ngành y tế mà còn nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu có tiêu đề đầy đủ là: "Xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang gen độc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện ở Hà Nội (2013 – 2015)". Tác giả thực hiện là Đặng Thị Thùy Dương, chuyên ngành Vi sinh vật học, mã số đào tạo 62420107, bảo vệ luận án tiến sĩ sinh học năm 2018 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Công trình được hướng dẫn khoa học bởi PGS. Bùi Thị Việt Hà và TS. Vũ Thị Thu Hường, thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số đề tài 106.65.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu được luận án nêu rõ xuất phát từ thực tế tiêu chảy sau dùng kháng sinh là biến chứng phổ biến khi sử dụng liệu pháp kháng sinh, làm xáo trộn cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây bệnh phát triển. Trong nhóm các căn nguyên vi sinh vật, Clostridium difficile là nguyên nhân nhiễm trùng đường ruột quan trọng hàng đầu, gây ra 10% đến 25% các trường hợp tiêu chảy sau dùng kháng sinh và 90% đến 100% các ca viêm đại tràng giả mạc. Trên thế giới, đặc biệt tại khu vực Bắc Mỹ và Châu Âu, vi khuẩn này gây bùng phát nhiều vụ dịch bệnh viện nghiêm trọng, là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do viêm dạ dày ruột. Ngược lại, tại khu vực Châu Á và Việt Nam, nhận thức và dữ liệu nghiên cứu về C. difficile còn hạn chế. Tình trạng quá tải bệnh viện, việc lạm dụng thuốc kháng sinh và khâu kiểm soát nhiễm khuẩn chưa triệt để làm gia tăng nguy cơ nhiễm trùng. Trước thời điểm nghiên cứu, các công bố trong nước chỉ dừng ở mức báo cáo một số ca bệnh lâm sàng đơn lẻ hoặc khảo sát sơ bộ trên cỡ mẫu nhỏ, hoàn toàn chưa có công trình nào đánh giá quy mô lớn về tỉ lệ nhiễm cũng như phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng vi khuẩn này.

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:

1. Xác định được tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện ở Hà Nội.
2. Phân tích được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang gen độc tố.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân bị tiêu chảy sau khi điều trị bằng kháng sinh, có độ tuổi từ 15 tuổi trở lên.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi khuẩn Kỵ khí thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương; thu thập bệnh phẩm tại bốn bệnh viện lớn ở Hà Nội gồm Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Lão khoa và Bệnh viện Đống Đa.
• Phạm vi thời gian: Thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm và dữ liệu dịch tễ diễn ra từ năm 2013 đến năm 2015.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại hệ thống tài liệu nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến vi khuẩn học, bệnh học, dịch tễ học và các kỹ thuật xét nghiệm đối với C. difficile:

• Về lịch sử vi khuẩn và danh pháp: Vi khuẩn được Hall và O'Toole phân lập lần đầu vào năm 1935 với tên gọi Bacillus difficile, sau đó được xếp vào chi Clostridium. Đến năm 2016, Lawson và cộng sự đã đề xuất phân loại lại thành Clostridioides difficile thuộc họ Peptostreptococcaceae. Năm 1978, vai trò gây bệnh của vi khuẩn chính thức được xác nhận khi được chứng minh là tác nhân gây viêm đại tràng giả mạc.
• Về tình hình dịch tễ thế giới: Tại Hoa Kỳ, dữ liệu thống kê cho thấy số ca tử vong do C. difficile tăng từ 793 trường hợp năm 1999 lên 7.251 năm 2009 và 44.500 ca vào năm 2014; chi phí chăm sóc y tế liên quan lên đến 4,8 tỉ USD năm 2008 và 5,4 tỉ USD năm 2014. Típ vi khuẩn độc lực cao BI/NAP1/027 gây ra các vụ dịch nghiêm trọng tại Quebec (Canada) giai đoạn 2005 – 2006 và tại 11 bang của Hoa Kỳ. Tại Anh, tỉ lệ nhiễm trùng tăng từ 4/10.000 bệnh nhân năm 2004 lên 83/10.000 bệnh nhân năm 2005; vụ dịch năm 2005 ghi nhận tỉ lệ tử vong 22%. Tại Châu Á, các nghiên cứu tại Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan ghi nhận ribotype 017 là chủng lưu hành chủ yếu trong bệnh viện, trong khi ribotype 018 (smz) chiếm ưu thế tại Nhật Bản.
• Về kỹ thuật chẩn đoán và phân loại phân tử: Hink và cộng sự chứng minh hiệu quả nuôi cấy phân lập bằng phương pháp sốc nhiệt ở 80°C. Bélanger và cộng sự ứng dụng Real-time PCR phát hiện trực tiếp gen độc tố tcdA và tcdB từ phân. Chankhamhaengdecha và cộng sự xây dựng kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện các gen tcdA, tcdB, cdtA, cdtB. Các nghiên cứu của Stubbs, Tenover, Bidet thiết lập phương pháp PCR ribotyping dựa trên vùng khoảng trống liên gen 16S-23S rRNA. Karjalainen và Kato phát triển kỹ thuật phân loại giải trình tự gen slpA (slpAST) mã hóa protein bề mặt S-layer.
• Về tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Trước năm 2012, các nghiên cứu về vi khuẩn kỵ khí chủ yếu tập trung vào Bacteroides fragilis và Clostridium perfringens trên động vật và môi trường (Vũ Nguyễn và cộng sự). Từ năm 2012, Phòng Vi khuẩn Kỵ khí thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bắt đầu ghi nhận các ca bệnh lâm sàng do C. difficile. Năm 2014, quy trình nuôi cấy hai bước QT-VKKK-05 được áp dụng trên 100 mẫu tại Bệnh viện Bạch Mai, ghi nhận tỉ lệ nhiễm 14%. Năm 2015, quy trình nested PCR QT-VK-5.3 được phát triển trên 115 mẫu tại Bệnh viện Bạch Mai, cho tỉ lệ phát hiện 22,6%. Năm 2016, một nghiên cứu cao học khảo sát trên 154 mẫu tại 3 bệnh viện ghi nhận tỉ lệ 22,7%.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Các nghiên cứu trước đây ở trong nước chỉ tiến hành trên cỡ mẫu nhỏ, phạm vi hẹp tại một hoặc hai bệnh viện, chưa phản ánh đầy đủ thực trạng nhiễm C. difficile ở người trưởng thành. Đặc biệt, môi trường phân lập CCMA chưa được kiểm định hiệu năng và ngưỡng phát hiện; chưa có công trình nào đánh giá so sánh song song giữa nested PCR và nuôi cấy trên cỡ mẫu lớn; hoàn toàn chưa có dữ liệu dịch tễ học phân tử về các ribotype và phân nhóm di truyền slpA của các chủng C. difficile lưu hành tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết vi sinh vật học phân tử và bệnh học truyền nhiễm:

• Đặc điểm vi khuẩn học: C. difficile là trực khuẩn Gram dương, kích thước 1x3 µm, kỵ khí tuyệt đối, có khả năng tạo nội bào tử chịu đựng được môi trường khô, nhiệt độ và các chất sát khuẩn thông thường.
• Đảo gây bệnh PaLoc (Pathogenicity Locus): Vùng gen kích thước 19,6 kb chứa các gen mã hóa hai độc tố chính là tcdA (độc tố ruột TcdA, 308 kDa, 2.710 gốc acid amin) và tcdB (độc tố tế bào TcdB, 270 kDa, 2.366 gốc acid amin), cùng các gen điều hòa tcdR, tcdC và gen vận chuyển tcdE. Ở các chủng không sinh độc tố (A-B-), toàn bộ đảo PaLoc được thay thế bằng một đoạn trình tự ngắn dài 115 bp. Cả TcdA và TcdB đều có cấu trúc 4 domain chức năng: GT (N-terminal glucosyltransferase domain), CPD (autocatalytic cysteine protease domain), TMD (central translocation domain) và RBD (C-terminal receptor binding domain).
• Độc tố kép CDT (binary toxin): Mã hóa trên vùng nhiễm sắc thể CdtLoc gồm hai gen cấu trúc cdtA, cdtB và gen điều hòa cdtR. CDT kích thích tế bào ruột hình thành các cấu trúc vi ống kích thước 5-100 µm giúp tăng khả năng bám dính của vi khuẩn, làm tăng tỉ lệ tử vong lên 60% so với bệnh nhân chỉ nhiễm chủng sinh TcdA hoặc TcdB.
• Phân loại kiểu độc tố: Phân chia thành các dòng A+B+, A-B+, A+B- và A-B-.

Phương pháp nghiên cứu thực tế gồm các kỹ thuật thực nghiệm:

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm vi sinh vật học và dịch tễ học phân tử.
• Đánh giá môi trường chọn lọc CCMA (Cycloserine – Cefoxitin – Mannitol Agar): Khảo sát tính năng suất, tính chọn lọc ức chế các vi khuẩn đường ruột khác và xác định giới hạn phát hiện ở các mật độ bào tử 10-50 bào tử/g, 10² bào tử/g và 10³ bào tử/g phân so sánh với môi trường GAM-HT.
• Nuôi cấy phân lập kỵ khí: Sử dụng hệ thống bình ủ GasPak tạo khí trường kỵ khí ổn định (80% N2, 10% CO2, 10% H2, oxy dưới 0,1%), kiểm soát bằng chỉ thị oxy, thời gian thao tác không vượt quá 20 phút.
• Phản ứng PCR đa mồi (Multiplex PCR): Khuếch đại đồng thời gen tcdA, tcdB và gen giữ nhà tpi (triose phosphate isomerase) làm chứng nội đặc hiệu nhận diện loài C. difficile.
• Phương pháp nested PCR (quy trình QT-VK-5.3): Sử dụng 4 cặp mồi qua 2 vòng khuếch đại gen để phát hiện trực tiếp gen độc tố tcdA từ DNA tách chiết từ mẫu phân bệnh nhân.
• Phương pháp PCR ribotyping: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng không mã hóa liên gen (ITS) giữa 16S và 23S rRNA, điện di sản phẩm kích thước từ 200 bp đến 700 bp trên gel agarose để phân nhóm kiểu gen dựa vào số lượng và kích thước các băng DNA.
• Phương pháp giải trình tự gen slpA (slpAST): Khuếch đại và giải trình tự vùng biến đổi đầu N của gen slpA (mã hóa protein S-layer bề mặt tế bào); xác định nhóm mới khi có sai khác trên 20 acid amin và phân nhóm phụ khi sai khác dưới 20 acid amin; phân tích mối quan hệ di truyền bằng phần mềm tin sinh học.
• Xử lý số liệu: Số liệu được phân tích thống kê y sinh học, sử dụng các chỉ số tỉ lệ phần trăm, tỉ suất chênh (OR), khoảng tin cậy 95% (95% CI) và giá trị p để xác định ý nghĩa thống kê. Đề tài được Hội đồng Đạo đức của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương thông qua.

Nguồn dữ liệu: Mẫu bệnh phẩm phân thu nhận từ bệnh nhân điều trị nội trú bị tiêu chảy sau dùng kháng sinh (≥ 15 tuổi) tại 4 bệnh viện ở Hà Nội; phiếu thu thập thông tin dịch tễ, tiền sử dùng thuốc kháng sinh, bệnh lý nền kèm theo; bộ 65 chủng vi khuẩn C. difficile thuần phân lập được.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan các vấn đề nghiên cứu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu liên quan đến tiêu chảy sau dùng kháng sinh và vi khuẩn C. difficile. Tác giả phân tích định nghĩa tiêu chảy sau dùng kháng sinh, cơ chế bệnh sinh do phá hủy cân bằng vi sinh đường ruột, nêu bật vai trò của C. difficile so với các căn nguyên khác như Clostridium perfringens típ A, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp. và Candida albicans. Nội dung chương trình bày chi tiết cấu trúc phân tử của locus PaLoc, cấu trúc 4 domain và cơ chế gây độc của TcdA, TcdB thông qua phản ứng glycosyl hóa bất hoạt protein Rho, Rac, Cdc42, dẫn đến sụp đổ khung xương tế bào; vai trò của độc tố kép CDT; các thể lâm sàng từ nhẹ đến viêm đại tràng giả mạc và biến chứng giãn đại tràng nhiễm độc (toxic megacolon > 7 cm); các yếu tố nguy cơ bao gồm việc điều trị bằng cephalosporin thế hệ 3, clindamycin, penicillin phổ rộng, tuổi cao trên 65, nằm viện kéo dài và sử dụng thuốc ức chế bơm proton. Chương 1 cũng tổng quan tình hình dịch tễ toàn cầu và trong nước, so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp chẩn đoán vi sinh (nuôi cấy, PCR, Real-time PCR, trung hòa độc tố tế bào CCCNA, ELISA/EIA) và các phương pháp phân loại phân tử.

Đặc điểm	Tiêu chảy do C. difficile	Tiêu chảy do các tác nhân khác
Kháng sinh liên quan phổ biến	Clindamycin, cephalosporins, penicillins	Clindamycin, cephalosporins hoặc amoxicillin kết hợp acid clavulanic
Mức độ và triệu chứng tiêu chảy	Cấp tính, dữ dội, 5-10 lần/ngày, mất nước, rối loạn điện giải, sốt, bạch cầu tăng cao	Mức độ trung bình
Hình ảnh nội soi hoặc cắt lớp	Viêm đại tràng, thường xuất hiện giả mạc	Không phát hiện tổn thương viêm
Biến chứng thường gặp	Giảm albumin máu, thủng ruột, sưng ruột, tái phát sau điều trị	Hiếm gặp, ngoại trừ mất nước nặng
Xét nghiệm độc tố vi khuẩn	Dương tính với độc tố của C. difficile	Âm tính
Đặc điểm dịch tễ học	Có thể bùng phát thành ổ dịch nội viện hoặc xuất hiện rải rác	Xuất hiện rải rác, không tạo thành dịch
Phác đồ điều trị đặc hiệu	Chỉ định Metronidazole hoặc Vancomycin; cấm chỉ định thuốc giảm nhu động ruột	Không chỉ định Metronidazole hay Vancomycin; thường sử dụng thuốc giảm nhu động ruột

Chương 1 cũng tổng hợp sự phân bố dịch tễ học các ribotype của C. difficile trên thế giới qua bảng số liệu sau:

Quốc gia	Giai đoạn	Ribotype phổ biến	Nguồn tham khảo
Vương quốc Anh	2007 - 2011 2012 - 2015	027, 001, 106 002, 005, 014, 015, 078	Wilcox và cộng sự; Dingle và cộng sự
Bỉ	2009 - 2011 2012 - 2014	027 014, 020	Viseur và cộng sự
Hoa Kỳ	2011	027, 014	Tickler và cộng sự
Chile	2012	012, 027, 046	Plaza-Garrido và cộng sự
Australia	2011 - 2012	014, 002	Foster và cộng sự
Nhật Bản	2009 - 2013	018, 369	Senoh và cộng sự
Hàn Quốc	2009 - 2010	018, 017, 001	Kim và cộng sự
Thái Lan	2015	014, 010, 017	Putsathit và cộng sự

Đồng thời, luận án so sánh các phương pháp phân loại phân tử vi khuẩn C. difficile làm cơ sở lựa chọn phương pháp:

Phương pháp	Kỹ thuật sử dụng	Cơ sở phân loại	Ưu điểm	Hạn chế
REA	Cắt enzyme HindIII, điện di gel agarose	Vị trí cắt enzyme giới hạn trên toàn bộ hệ gen	Khả năng phân loại cao	Băng DNA dày đặc, khó phân tích, khó trao đổi dữ liệu
PFGE	Cắt enzyme SmaI, điện di xung trường	Vị trí cắt enzyme giới hạn trên toàn bộ hệ gen	Khả năng phân loại cao	Đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian, khó chuẩn hóa giữa các phòng thí nghiệm
Toxinotyping	Phản ứng PCR và enzyme giới hạn	Vùng gen trong đảo gây bệnh PaLoc	Xác định biến thể độc tố	Mức độ phân loại thấp
PCR ribotyping	PCR và điện di gel agarose	Vùng khoảng trống liên gen ITS 16S-23S rRNA	Nhanh, dễ thực hiện, khả năng phân loại cao	Cần chủng tham chiếu để đối chiếu chuẩn
MLVA	PCR, giải trình tự và điện di mao quản	Các trình tự lặp lại ngẫu nhiên trên hệ gen	Khả năng phân giải rất cao	Giá thành cao, chưa được chuẩn hóa diện rộng
MLST	PCR và giải trình tự gen	Các locus gen giữ nhà (housekeeping genes)	Dữ liệu giải trình tự ổn định, dễ so sánh quốc tế	Chi phí xét nghiệm cao
slpAST	PCR và giải trình tự gen	Vùng biến đổi của gen slpA mã hóa S-layer	Dễ thực hiện, chi phí hợp lý, dễ trao đổi dữ liệu trực tuyến	Mức độ tương quan thấp hơn so với ribotyping và MLST

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình nghiên cứu thực nghiệm. Tác giả trình bày tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm phân từ các bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh có độ tuổi ≥ 15 tại bốn bệnh viện (Bạch Mai, Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Lão khoa, Đống Đa). Vật liệu gồm các chủng chuẩn vi sinh vật, môi trường chuyên dụng CCMA và GAM-HT, hệ thống sinh khí kỵ khí GasPak. Quy trình thực nghiệm chia thành 4 nội dung chính:

• Nội dung 1: Đánh giá hiệu năng môi trường CCMA qua tính năng suất, khả năng ức chế chọn lọc đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm và xác định giới hạn phát hiện bào tử vi khuẩn C. difficile ở các nồng độ pha loãng trong mẫu phân.
• Nội dung 2: So sánh kỹ thuật nested PCR phát hiện trực tiếp gen độc tố tcdA với phương pháp nuôi cấy phân lập hai bước trên môi trường CCMA kết hợp PCR đa mồi xác định tcdA, tcdB, tpi.
• Nội dung 3: Xác định tỉ lệ nhiễm vi khuẩn mang gen độc tố trên toàn bộ tập mẫu phân thu nhận được bằng cách phối hợp song song hai kỹ thuật.
• Nội dung 4: Phân tích dịch tễ học phân tử của 65 chủng C. difficile mang gen độc tố thuần phân lập được bằng kỹ thuật PCR ribotyping (khuếch đại vùng ITS 16S-23S) và giải trình tự vùng biến đổi gen slpA (slpAST). Chương này cũng trình bày rõ các biến số dịch tễ, thông tin nhân khẩu học, tiền sử kháng sinh, bệnh kèm theo, các kiểm định thống kê y học và phê duyệt y đức của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu và phân tích thực nghiệm thu được từ hai mục tiêu nghiên cứu:

• Đánh giá môi trường CCMA và so sánh kỹ thuật: Môi trường CCMA thể hiện tính chọn lọc cao, ức chế hoàn toàn các vi khuẩn đường ruột khác như E. coli, Proteus, các vi khuẩn kỵ khí khác như C. perfringens, B. fragilis, đồng thời cho phép khuẩn lạc C. difficile phát triển đặc trưng (màu vàng chuyển hóa mannitol, phát huỳnh quang dưới tia UV 360 nm, mùi phân ngựa). Xác định được giới hạn phát hiện của môi trường ở các ngưỡng nồng độ bào tử pha trong phân. Xét nghiệm song song cho thấy nested PCR có độ tương đồng cao với nuôi cấy phân lập, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 4 giờ so với 3 ngày của quy trình nuôi cấy.
• Tỉ lệ nhiễm C. difficile mang gen độc tố: Tỉ lệ nhiễm chung ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại 4 bệnh viện ở Hà Nội được xác định là 24,9%. Luận án phân tích sự biến thiên của tỉ lệ nhiễm qua các năm 2013, 2014, 2015; phân loại kiểu độc tố ghi nhận sự hiện diện của cả dòng A+B+ và dòng đột biến A-B+ (trong đó dòng A-B+ chiếm tỉ lệ đáng kể). Tỉ lệ nhiễm được phân tích chi tiết theo đặc điểm nhân khẩu học (tăng cao ở nhóm bệnh nhân lớn tuổi), giới tính, tiền sử sử dụng các nhóm kháng sinh đơn lẻ hoặc phối hợp (đặc biệt là nhóm cephalosporin và penicillin), tiền sử các bệnh lý mạn tính kèm theo, sự phân bố khác biệt giữa các khoa lâm sàng (hồi sức, truyền nhiễm, nội khoa) và giữa 4 cơ sở bệnh viện tham gia nghiên cứu.
• Đặc điểm dịch tễ học phân tử:
  • Kết quả PCR ribotyping: Phân loại 65 chủng vi khuẩn thuần đã xác định được 8 kiểu ribotype khác nhau lưu hành tại 4 bệnh viện. Bốn ribotype phổ biến nhất lần lượt là trf, 017, cc835 và og39. Trong đó, ribotype trf chiếm ưu thế lớn nhất và được nhận định có nguy cơ lây lan thành các vụ dịch nội viện. Kết quả so sánh dịch tễ học cho thấy sự vắng mặt của ribotype 027 (chủng độc lực cao phổ biến ở Âu - Mỹ), nhưng khẳng định sự lưu hành rộng rãi của ribotype 017 (chủng A-B+ đặc thù tại khu vực Châu Á).
  • Kết quả giải trình tự gen slpA: Phân loại 65 chủng thành 10 phân nhóm slpAST khác nhau, trong đó hai phân nhóm chiếm ưu thế là fr-01 và kr-03. Đáng chú ý, nghiên cứu phát hiện hai phân nhóm slpAST mới chưa từng được ghi nhận trong cơ sở dữ liệu quốc tế là fr-23 và fr-24. Trình tự gen của hai phân nhóm mới này đã được đăng ký và cấp mã số truy cập trên ngân hàng gen quốc tế GenBank. Phân tích cây phát sinh chủng loại di truyền gen slpA làm sáng tỏ mối quan hệ họ hàng giữa các chủng phân lập tại Hà Nội với các chủng chuẩn trên thế giới.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án nêu rõ những đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và giá trị thực tiễn:

1. Về dịch tễ học phân tử: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam chứng minh sự lưu hành của các chủng C. difficile thuộc 8 ribotype và 10 phân nhóm slpAST trên quần thể bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh (≥ 15 tuổi) tại 4 bệnh viện lớn ở Hà Nội. Các ribotype phổ biến nhất được ghi nhận là trf, 017, cc835 và og39; các phân nhóm slpAST chiếm ưu thế là fr-01 và kr-03. Kết quả là bước khởi đầu thiết lập dữ liệu dịch tễ học phân tử cho các nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn kỵ khí gây bệnh tại Việt Nam.
2. Về phát hiện di truyền mới: Luận án phát hiện hai phân nhóm slpAST mới chưa từng công bố trên thế giới, đặt tên là fr-23 và fr-24. Trình tự gen slpA của hai phân nhóm này đã được đăng ký chính thức trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank với các số truy cập tương ứng là LC176667 và LC189481. Phát hiện này có giá trị trong việc truy tìm nguồn gốc di truyền và sự lan truyền của các chủng vi khuẩn giữa các khu vực địa lý.
3. Về bằng chứng thực tiễn lâm sàng: Luận án xác định tỉ lệ nhiễm C. difficile mang gen độc tố là 24,9% ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại 4 bệnh viện lớn. Con số này khẳng định vai trò gây bệnh quan trọng của C. difficile, cung cấp bằng chứng khoa học cho việc cần thiết đưa xét nghiệm tìm vi khuẩn và độc tố vào quy trình chẩn đoán thường quy.

Các giải pháp và kiến nghị đề xuất từ kết quả nghiên cứu:

• Chỉ định xét nghiệm phân tìm C. difficile mang gen độc tố đối với tất cả các ca bệnh xuất hiện triệu chứng tiêu chảy sau khi điều trị kháng sinh tại các bệnh viện.
• Ứng dụng quy trình kỹ thuật nested PCR trực tiếp từ phân tại các khoa vi sinh lâm sàng nhằm rút ngắn thời gian chẩn đoán, hỗ trợ bác sĩ kịp thời điều chỉnh phác đồ điều trị thích hợp (sử dụng metronidazole hoặc vancomycin, ngừng kháng sinh liên quan).
• Tăng cường các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn nội viện: vệ sinh bề mặt môi trường bệnh viện bằng các hóa chất diệt được bào tử (như dung dịch sodium hypochlorite 1%), quản lý nghiêm ngặt quy trình rửa tay của nhân viên y tế nhằm ngăn chặn sự lây lan của các ribotype có tiềm năng gây dịch như trf và 017.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án căn cứ theo phạm vi thực tế được đề cập:

• Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát trên nhóm bệnh nhân từ 15 tuổi trở lên tại bốn bệnh viện trên địa bàn nội thành Hà Nội; chưa thu thập và đánh giá được dữ liệu trên nhóm đối tượng bệnh nhi dưới 15 tuổi (do Bệnh viện Nhi Trung ương không thuộc mạng lưới thu thập mẫu của đề tài).
• Luận án chưa khảo sát quy mô rộng ở các bệnh viện tuyến tỉnh và các khu vực địa lý khác nhau ngoài Hà Nội.
• Số lượng chủng đưa vào phân tích dịch tễ học phân tử là 65 chủng; nghiên cứu chưa thực hiện thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh (xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC) trên toàn bộ các chủng phân lập được để đánh giá mức độ kháng thuốc.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng nghiên cứu dịch tễ học phân tử của C. difficile trên nhiều nhóm quần thể bệnh nhân khác nhau, bao gồm nhóm bệnh nhi và bệnh nhân tại cộng đồng.
• Triển khai thu thập mẫu và giám sát vi khuẩn tại các cơ sở y tế ở các tỉnh thành thuộc các vùng miền khác nhau trên cả nước.
• Tiến hành các nghiên cứu chuyên sâu về tính kháng kháng sinh, cơ chế đề kháng và độc lực thực nghiệm của các chủng thuộc các ribotype ưu thế (trf, 017) cũng như hai phân nhóm gen mới phát hiện (fr-23, fr-24).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị đối với các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học thực nghiệm và Bệnh truyền nhiễm: Phần phương pháp luận về quy trình nuôi cấy kỵ khí bằng bình GasPak, quy trình đánh giá hiệu năng môi trường chọn lọc CCMA, kỹ thuật nested PCR chẩn đoán gen độc tố và các quy trình phân loại phân tử (PCR ribotyping, slpAST) là tài liệu chuẩn mực để tham khảo và ứng dụng trong phòng thí nghiệm.
• Bác sĩ lâm sàng thuộc các chuyên khoa Tiêu hóa, Truyền nhiễm, Hồi sức cấp cứu và Lão khoa: Dữ liệu về tỉ lệ nhiễm 24,9%, các yếu tố nguy cơ sử dụng kháng sinh và đặc điểm phân biệt lâm sàng giúp bác sĩ nâng cao nhận thức chẩn đoán phân biệt đối với tiêu chảy sau dùng kháng sinh, tránh bỏ sót ca bệnh viêm đại tràng giả mạc.
• Cán bộ kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện và các nhà quản lý y tế dự phòng: Cung cấp bằng chứng thực địa về sự lưu hành của các chủng vi khuẩn có khả năng gây dịch (ribotype trf, 017), làm căn cứ xây dựng quy trình giám sát dịch tễ, quy chuẩn khử khuẩn bề mặt và chính sách quản lý sử dụng kháng sinh hợp lý trong cơ sở y tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại 4 bệnh viện ở Hà Nội được xác định là bao nhiêu? Tỉ lệ nhiễm ghi nhận được trong nghiên cứu là 24,9% trên quần thể bệnh nhân từ 15 tuổi trở lên điều trị nội trú tại bốn bệnh viện (Bạch Mai, Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Lão khoa và Đống Đa) trong giai đoạn 2013 – 2015.

2. Những ribotype và phân nhóm slpAST nào của C. difficile chiếm ưu thế trong các chủng phân lập được? Trong số 65 chủng phân tích, phương pháp PCR ribotyping xác định 8 ribotype, trong đó 4 ribotype phổ biến nhất là trf, 017, cc835 và og39 (ribotype trf được đánh giá có nguy cơ gây dịch bệnh viện). Phương pháp slpAST xác định 10 phân nhóm, trong đó hai phân nhóm chiếm ưu thế lớn nhất là fr-01 và kr-03.

3. Luận án đã phát hiện ra những biến chủng phân tử mới nào và thông tin đăng ký quốc tế ra sao? Nghiên cứu phát hiện hai phân nhóm slpAST mới chưa từng được công bố trên thế giới, được ký hiệu là fr-23 và fr-24. Trình tự gen slpA của hai chủng đại diện đã được đăng ký thành công trên ngân hàng dữ liệu GenBank với mã số truy cập quốc tế lần lượt là LC176667 và LC189481.

4. Nhóm thuốc kháng sinh nào có nguy cơ cao nhất liên quan đến tiêu chảy do C. difficile theo tổng quan của luận án? Theo các tài liệu được luận án tổng thuật, các nhóm kháng sinh có nguy cơ cao nhất gồm clindamycin, các cephalosporin (đặc biệt là cephalosporin thế hệ 3) và các penicillin phổ rộng (đặc biệt là phối hợp amoxicillin – acid clavulanic). Triệu chứng tiêu chảy thường xuất hiện từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 9 sau khi ngừng thuốc, nhưng cũng có thể xuất hiện muộn ở tuần thứ 8.

5. Cơ chế phân tử nào giải thích tác động phá hủy tế bào của độc tố TcdA và TcdB? Độc tố liên kết với thụ thể bề mặt tế bào biểu mô ruột thông qua domain RBD và được đưa vào trong tế bào qua quá trình nhập bào. Môi trường axit trong endosome kích hoạt domain TMD tạo kênh giải phóng độc tố; phân tử InsP6 trong tế bào kích hoạt domain CPD cắt giải phóng domain glucosyltransferase (GT) vào bào tương. Domain GT xúc tác gắn gốc glucose vào vị trí Thr-37 của các protein Rho, Rac và Cdc42, làm bất hoạt các phân tử này, dẫn đến phá hủy khung xương tế bào, làm mất liên kết liên bào và gây chết tế bào biểu mô ruột.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đặng Thị Thùy Dương đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu nghiên cứu thông qua việc xác định tỉ lệ nhiễm C. difficile mang gen độc tố đạt 24,9% ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện lớn ở Hà Nội. Công trình đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học phân tử của 65 chủng vi khuẩn, chứng minh sự lưu hành của 8 ribotype (với trf và 017 chiếm ưu thế) và 10 phân nhóm slpAST (với fr-01 và kr-03 chiếm ưu thế), đồng thời phát hiện hai phân nhóm gen mới fr-23 (LC176667) và fr-24 (LC189481). Các kết quả thực nghiệm về hiệu năng môi trường CCMA và phương pháp nested PCR cung cấp cơ sở khoa học quan trọng phục vụ chẩn đoán lâm sàng, kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện và định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn kỵ khí gây bệnh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU. TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH. Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh. VI KHUẨN Clostridium difficile.

Đặc điểm sinh học. Tính chất sinh hóa. Sức đề kháng. Độc tố của C.

Độc tố TcdA và TcdB. Độc tố kép CDT. Cơ chế gây bệnh. difficile gây ra.

Các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng do C. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC. Trên thế giới. Tình hình nhiễm trùng do C.

Dịch tễ học phân tử của các chủng C. difficile gây bệnh. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG DO Clostridium difficile. Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập C.

difficile sinh độc tố. Nuôi cấy phân lập C. difficile từ bệnh phẩm. Xác định chủng vi khuẩn C.

difficile sinh độc tố. Ƣu, nhƣợc điểm. Phƣơng pháp khuếch đại gen phát hiện gen độc tố trực tiếp từ mẫu phân. Các phƣơng pháp khuếch đại gen.

Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp khuếch đại gen. Các phƣơng pháp khác. Trung hòa độc tố tế bào (CCCNA – cell culture cytotoxicity neutralization assay). Phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ enzym (EIAs hoặc ELISA).

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI PHÂN TỬ CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ. Phƣơng pháp PCR ribotyping. Phƣơng pháp giải trình tự gen slpA. Các phƣơng pháp khác.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. CỠ MẪU, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU.

CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU. Mẫu bệnh phẩm. Thông tin bệnh nhân. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

Chủng vi khuẩn. Môi trƣờng nuôi cấy. Thiết bị, dụng cụ. NỘI DUNG VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU.

Đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trƣờng CCMA. Nuôi cấy phân lập C. difficile mang gen độc tố. Nuôi cấy phân lập C.

difficile từ mẫu phân. Xác định chủng vi khuẩn C. difficile và phân loại độc tố. Phƣơng pháp nested PCR.

Phƣơng pháp PCR ribotyping. Phƣơng pháp giải trình tự gen slpA. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. TỈ LỆ NHIỄM C. difficile MANG GEN ĐỘC TỐ Ở BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH. Kết quả đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trƣờng CCMA.

Tính năng suất. Tính chọn lọc. Giới hạn phát hiện của môi trƣờng CCMA. So sánh phƣơng pháp nested PCR với phƣơng pháp nuôi cấy C.

difficile mang gen độc tố. Tỉ lệ nhiễm C. difficile mang gen độc tố ở những bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile mang gen độc tố (C. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo kiểu độc tố. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo đặc điểm nhân khẩu học. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ.

Đặc điểm dịch tễ học phân tử C. difficile MGĐT theo phƣơng pháp phân loại PCR ribotyping. Kết quả phân loại. Sự phân bố của các ribotype.

Sự phân bố các ribotype C. difficile lƣu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội so với một số nƣớc trên thế giới. Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng C. difficile MGĐT theo phƣơng pháp giải trình tự gen slpA.

Kết quả phân loại. Mối quan hệ di truyền gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu và các chủng trên thế giới. 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

122 PHỤ LỤC 4 z DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit DeoxyRibonucleic ARN Axit Ribonucleic bp Base pair BHI Brain heart Infusion (Canh thang não tim) CCMA Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – Agar CCFA Cyclocerine – Cefoxitin – Fructose – Agar CCMB Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – Broth CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ) CFU Colony form unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CI Confidence Interval (khoảng tin cậy) C. difficile mang gen độc tố Elisa Enzym linked – immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym) GAM-HT GAM – Horse Taurocholate kb Kilobase kDa Kilodalton MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MLVA Multilocus Variable-number tandem-repeat Analysis (Phân tích trình tự lặp lại ngẫu nhiên) MLST Multilocus sequence typing (Phân tích trình tự đa locus) MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aureus 5 z OR Odd Ratio (tỉ suất chênh) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Điện di xung trƣờng) pg Picrogam REA Endonuclease Restriction Analysis (Phân tích đoạn nhờ enzym giới hạn) SHEA/IDSA Society for Healthcare Epidemiology of America and the Infectious Diseases Society of America (Hiệp hội nghiên cứu dịch tễ học của Mỹ/ các bệnh truyền nhiễm của Mỹ) slpAST slpA Sequence Typing (Phƣơng pháp phân loại giải trình tự gen slpA) UK United Kingdom (Vƣơng quốc liên hợp Anh và Bắc Ireland) US United States (Hợp chủng quốc Hoa Kỳ) 6 z DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các dạng hình thái của C. Đặc điểm khuẩn lạc C.

Tổ chức gen trong locus gây bệnh của C. Cấu trúc của TcdA và TcdB, vị trí và chức năng hoạt động của mỗi domain. Cơ chế hoạt động của các độc tố TcdA và TcdB. Các thể nhiễm trùng do C.

Tỉ lệ các ribotype ở Anh từ năm 2007 đến 2013. Hệ thống hộp ủ GasPak. Cấu trúc gen slpA của C. Quy trình thu thập mẫu và thông tin…………………………………….

Nội dung và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả PCR đa mồi trên các chủng C. difficile sinh độc tố và không sinh độc tố. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng nested PCR.

Khả năng mọc của C. difficile trên môi trƣờng CCMA và GAM –HT……66 Hình 3. Khả năng ức chế các vi khuẩn khác của môi trƣờng CCMA. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một số nƣớc. Tỉ lệ dòng vi khuẩn C. difficile A-B+ tại bốn bệnh viện ở Hà Nội và một số nƣớc. Kết quả điện di sản phẩm PCR ribotyping.

Tỉ lệ các ribotype trong quần thể nghiên cứu. Sự lƣu hành của các ribotype tại 4 bệnh viện Hà Nội. Sự lƣu hành của các ribotype C. Sự phân bố các phân nhóm slpAST ở 4 bệnh viện.

Mối quan hệ di truyền gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu và các chủng trên thế giới .115 7 z DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Đặc điểm lâm sàng phân biệt tiêu chảy sau dùng kháng sinh do. Các ribotype phổ biến ở một số nƣớc trên thế giới. Các phƣơng pháp phân loại phân tử C.

Danh sách chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các cặp mồi trong phản ứng PCR đa mồi. Trình tự các cặp mồi cho phản ứng nested PCR. Cặp mồi dùng cho phƣơng pháp PCR ribotyping.

Trình tự các cặp mồi sử dụng cho PCR giải trình tự. Thành phần môi trƣờng CCMA. Thành phần phản ứng PCR đa mồi. Kết quả phân loại độc tố bằng PCR đa mồi.

Thành phần phản ứng nested PCR. Thành phần phản ứng PCR ribotyping. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ribotyping. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen slpA.

Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen. Tỉ lệ phát hiện C. difficile ở nồng độ 103 bào tử/1g phân. Tỉ lệ phát hiện C.

difficile ở nồng độ 102 bào tử/ 1g phân. Tỉ lệ phát hiện C. difficile ở nồng độ 10-50 bào tử/1g phân. Kết quả xét nghiệm mẫu phân bằng 2 phƣơng pháp.

Các trƣờng hợp đồng nhiễm. Kết quả xét nghiệm kết hợp song song hai phƣơng pháp. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo năm.

Tỉ lệ nhiễm C. difficile theo kiểu độc tố. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo các đặc điểm về nhân khẩu học.

Mối liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu học và nhiễm. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo giới tính qua các năm. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo giới tính ở mỗi bệnh viện. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện. Kết quả phân loại 65 chủng theo phƣơng pháp PCR ribotyping.

Phân bố của hai ribotype trf và 017 theo một số đặc điểm. difficile lƣu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một số nƣớc trên thế giới. Kết quả phân loại 65 chủng C. difficile theo phƣơng pháp slpAST.

So sánh trình tự gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu với các chủng trên thế giới. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tiêu chảy sau dùng kháng sinh đƣợc định nghĩa là tình trạng tiêu chảy xảy ra có liên quan đến việc sử dụng kháng sinh gây phá vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩn đƣờng ruột hoặc làm phát triển quá mức các vi khuẩn có hại sinh độc tố [22]. Trong số các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, Clostridium difficile (C. difficile) là nguyên nhân nhiễm trùng quan trọng nhất, chiếm từ 10-25% các ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh, 90-100% các ca viêm đại tràng giả mạc sau dùng kháng sinh [23, 127].

diffìcile là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, có khả năng sinh bào tử. Vi khuẩn này đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng phổ biến ở các nƣớc châu Âu và châu Mỹ trong gần hai thập kỉ qua. difficile là nguyên nhân hàng đầu gây ra các ca tử vong do viêm dạ dày ruột [41, 61, 105]. Các nghiên cứu dịch tễ học phân tử trên thế giới đã chỉ ra rằng có mối liên quan giữa mức độ nặng của bệnh với kiểu gen của vi khuẩn, điển hình nhƣ típ C.

difficile BI/NAP1/027 đƣợc xác định là căn nguyên gây ra nhiều vụ dịch lớn ở Châu Âu và Bắc Mỹ vào đầu thế kỉ XXI. Do vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ học phân tử của C. difficile gây bệnh là cần thiết cho điều tra vụ dịch tiêu chảy trong bệnh viện và phát hiện một típ chủng vi khuẩn có khả năng gây ra các vụ dịch mới.