Luận án tiến sĩ xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng clostridium difficile mang gen độc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy

Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng clostridium difficile, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Đặng Thị Thùy Dương
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Thị Việt Hà
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile và đặc điểm dịch tễ học phân tử từ bệnh nhân tiêu chảy
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. LỜI CAM ĐOAN
• 1.2. LỜI CẢM ƠN
• 1.3. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1.4. DANH MỤC HÌNH
• 1.5. DANH MỤC BẢNG
• 1.6. MỞ ĐẦU
• 1.6.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.6.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.6.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.6.4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
• 1.6.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 2.1. TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH
• 2.1.1. Định nghĩa Tiêu chảy sau dùng kháng sinh
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile

Nghiên cứu đã xác định tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện lớn ở Hà Nội. Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm đạt 24,9%, một con số đáng chú ý trong bối cảnh lạm dụng kháng sinh hiện nay. Việc xác định tỉ lệ này không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình dịch tễ học mà còn nhấn mạnh vai trò của Clostridium difficile trong các ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Theo nghiên cứu, tỉ lệ nhiễm có sự khác biệt rõ rệt giữa các bệnh viện và các đặc điểm nhân khẩu học của bệnh nhân. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả hơn trong môi trường bệnh viện.

1.1. Đặc điểm dịch tễ học

Đặc điểm dịch tễ học của Clostridium difficile cho thấy sự phân bố của các ribotype khác nhau giữa các bệnh viện. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các ribotype phổ biến như trf, 017, cc835 và og39 có mặt tại bốn bệnh viện ở Hà Nội. Sự phân bố này không chỉ phản ánh tình hình nhiễm trùng mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho các nhà dịch tễ học trong việc theo dõi và kiểm soát dịch bệnh. Việc phân tích các ribotype cũng giúp xác định mối liên hệ giữa các chủng vi khuẩn và các vụ dịch trong tương lai.

II. Đặc điểm dịch tễ học phân tử

Nghiên cứu đã phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang gen độc tố thông qua các phương pháp phân loại phân tử như PCR ribotyping và giải trình tự gen slpA. Kết quả cho thấy sự đa dạng gen giữa các chủng, với sự xuất hiện của hai phân nhóm slpAST mới là fr-23 và fr-24. Những phát hiện này không chỉ làm phong phú thêm kiến thức về Clostridium difficile mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới về nguồn gốc và sự lây lan của các chủng vi khuẩn này trong cộng đồng. Việc xác định các đặc điểm gen này có thể giúp các nhà nghiên cứu và các nhà quản lý y tế có những biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

2.1. Phân loại gen

Phân loại gen của Clostridium difficile cho thấy sự phân bố không đồng đều của các ribotype trong quần thể bệnh nhân. Các ribotype như trf và 017 được xác định là phổ biến nhất, cho thấy sự lây lan của các chủng này trong môi trường bệnh viện. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát hiện và kiểm soát các vụ dịch có thể xảy ra. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc theo dõi các ribotype này có thể giúp phát hiện sớm các chủng vi khuẩn mới nổi, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố là 24,9%, điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải tiến hành xét nghiệm phân tìm Clostridium difficile trong các ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Thông tin này sẽ hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong việc lựa chọn liệu pháp điều trị phù hợp, đồng thời giúp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện hiệu quả hơn. Hơn nữa, việc phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các biện pháp phòng chống dịch bệnh trong tương lai.

3.1. Ứng dụng trong y tế

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc xây dựng các chương trình giám sát và kiểm soát nhiễm khuẩn tại các bệnh viện. Việc xác định tỉ lệ nhiễm và đặc điểm dịch tễ học phân tử của Clostridium difficile sẽ giúp các nhà quản lý y tế có cái nhìn tổng quan về tình hình nhiễm trùng trong cộng đồng. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu gánh nặng cho ngành y tế mà còn nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU. TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH. Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh. VI KHUẨN Clostridium difficile.

Đặc điểm sinh học. Tính chất sinh hóa. Sức đề kháng. Độc tố của C.

Độc tố TcdA và TcdB. Độc tố kép CDT. Cơ chế gây bệnh. difficile gây ra.

Các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng do C. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC. Trên thế giới. Tình hình nhiễm trùng do C.

Dịch tễ học phân tử của các chủng C. difficile gây bệnh. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG DO Clostridium difficile. Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập C.

difficile sinh độc tố. Nuôi cấy phân lập C. difficile từ bệnh phẩm. Xác định chủng vi khuẩn C.

difficile sinh độc tố. Ƣu, nhƣợc điểm. Phƣơng pháp khuếch đại gen phát hiện gen độc tố trực tiếp từ mẫu phân. Các phƣơng pháp khuếch đại gen.

Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp khuếch đại gen. Các phƣơng pháp khác. Trung hòa độc tố tế bào (CCCNA – cell culture cytotoxicity neutralization assay). Phƣơng pháp miễn dịch hấp phụ enzym (EIAs hoặc ELISA).

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI PHÂN TỬ CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ. Phƣơng pháp PCR ribotyping. Phƣơng pháp giải trình tự gen slpA. Các phƣơng pháp khác.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. CỠ MẪU, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU.

CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU. Mẫu bệnh phẩm. Thông tin bệnh nhân. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.

Chủng vi khuẩn. Môi trƣờng nuôi cấy. Thiết bị, dụng cụ. NỘI DUNG VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU.

Đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trƣờng CCMA. Nuôi cấy phân lập C. difficile mang gen độc tố. Nuôi cấy phân lập C.

difficile từ mẫu phân. Xác định chủng vi khuẩn C. difficile và phân loại độc tố. Phƣơng pháp nested PCR.

Phƣơng pháp PCR ribotyping. Phƣơng pháp giải trình tự gen slpA. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. TỈ LỆ NHIỄM C. difficile MANG GEN ĐỘC TỐ Ở BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH. Kết quả đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trƣờng CCMA.

Tính năng suất. Tính chọn lọc. Giới hạn phát hiện của môi trƣờng CCMA. So sánh phƣơng pháp nested PCR với phƣơng pháp nuôi cấy C.

difficile mang gen độc tố. Tỉ lệ nhiễm C. difficile mang gen độc tố ở những bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile mang gen độc tố (C. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo kiểu độc tố. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo đặc điểm nhân khẩu học. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ.

Đặc điểm dịch tễ học phân tử C. difficile MGĐT theo phƣơng pháp phân loại PCR ribotyping. Kết quả phân loại. Sự phân bố của các ribotype.

Sự phân bố các ribotype C. difficile lƣu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội so với một số nƣớc trên thế giới. Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng C. difficile MGĐT theo phƣơng pháp giải trình tự gen slpA.

Kết quả phân loại. Mối quan hệ di truyền gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu và các chủng trên thế giới. 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

122 PHỤ LỤC 4 z DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit DeoxyRibonucleic ARN Axit Ribonucleic bp Base pair BHI Brain heart Infusion (Canh thang não tim) CCMA Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – Agar CCFA Cyclocerine – Cefoxitin – Fructose – Agar CCMB Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – Broth CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ) CFU Colony form unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CI Confidence Interval (khoảng tin cậy) C. difficile mang gen độc tố Elisa Enzym linked – immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym) GAM-HT GAM – Horse Taurocholate kb Kilobase kDa Kilodalton MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MLVA Multilocus Variable-number tandem-repeat Analysis (Phân tích trình tự lặp lại ngẫu nhiên) MLST Multilocus sequence typing (Phân tích trình tự đa locus) MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aureus 5 z OR Odd Ratio (tỉ suất chênh) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Điện di xung trƣờng) pg Picrogam REA Endonuclease Restriction Analysis (Phân tích đoạn nhờ enzym giới hạn) SHEA/IDSA Society for Healthcare Epidemiology of America and the Infectious Diseases Society of America (Hiệp hội nghiên cứu dịch tễ học của Mỹ/ các bệnh truyền nhiễm của Mỹ) slpAST slpA Sequence Typing (Phƣơng pháp phân loại giải trình tự gen slpA) UK United Kingdom (Vƣơng quốc liên hợp Anh và Bắc Ireland) US United States (Hợp chủng quốc Hoa Kỳ) 6 z DANH MỤC HÌNH Hình 1. Các dạng hình thái của C. Đặc điểm khuẩn lạc C.

Tổ chức gen trong locus gây bệnh của C. Cấu trúc của TcdA và TcdB, vị trí và chức năng hoạt động của mỗi domain. Cơ chế hoạt động của các độc tố TcdA và TcdB. Các thể nhiễm trùng do C.

Tỉ lệ các ribotype ở Anh từ năm 2007 đến 2013. Hệ thống hộp ủ GasPak. Cấu trúc gen slpA của C. Quy trình thu thập mẫu và thông tin…………………………………….

Nội dung và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu. Kết quả PCR đa mồi trên các chủng C. difficile sinh độc tố và không sinh độc tố. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng nested PCR.

Khả năng mọc của C. difficile trên môi trƣờng CCMA và GAM –HT……66 Hình 3. Khả năng ức chế các vi khuẩn khác của môi trƣờng CCMA. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một số nƣớc. Tỉ lệ dòng vi khuẩn C. difficile A-B+ tại bốn bệnh viện ở Hà Nội và một số nƣớc. Kết quả điện di sản phẩm PCR ribotyping.

Tỉ lệ các ribotype trong quần thể nghiên cứu. Sự lƣu hành của các ribotype tại 4 bệnh viện Hà Nội. Sự lƣu hành của các ribotype C. Sự phân bố các phân nhóm slpAST ở 4 bệnh viện.

Mối quan hệ di truyền gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu và các chủng trên thế giới .115 7 z DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Đặc điểm lâm sàng phân biệt tiêu chảy sau dùng kháng sinh do. Các ribotype phổ biến ở một số nƣớc trên thế giới. Các phƣơng pháp phân loại phân tử C.

Danh sách chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các cặp mồi trong phản ứng PCR đa mồi. Trình tự các cặp mồi cho phản ứng nested PCR. Cặp mồi dùng cho phƣơng pháp PCR ribotyping.

Trình tự các cặp mồi sử dụng cho PCR giải trình tự. Thành phần môi trƣờng CCMA. Thành phần phản ứng PCR đa mồi. Kết quả phân loại độc tố bằng PCR đa mồi.

Thành phần phản ứng nested PCR. Thành phần phản ứng PCR ribotyping. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ribotyping. Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen slpA.

Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen. Tỉ lệ phát hiện C. difficile ở nồng độ 103 bào tử/1g phân. Tỉ lệ phát hiện C.

difficile ở nồng độ 102 bào tử/ 1g phân. Tỉ lệ phát hiện C. difficile ở nồng độ 10-50 bào tử/1g phân. Kết quả xét nghiệm mẫu phân bằng 2 phƣơng pháp.

Các trƣờng hợp đồng nhiễm. Kết quả xét nghiệm kết hợp song song hai phƣơng pháp. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo năm.

Tỉ lệ nhiễm C. difficile theo kiểu độc tố. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo các đặc điểm về nhân khẩu học.

Mối liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu học và nhiễm. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo giới tính qua các năm. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo giới tính ở mỗi bệnh viện. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh. Tỉ lệ nhiễm C.

difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo. Tỉ lệ nhiễm C. difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện. Kết quả phân loại 65 chủng theo phƣơng pháp PCR ribotyping.

Phân bố của hai ribotype trf và 017 theo một số đặc điểm. difficile lƣu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một số nƣớc trên thế giới. Kết quả phân loại 65 chủng C. difficile theo phƣơng pháp slpAST.

So sánh trình tự gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu với các chủng trên thế giới. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tiêu chảy sau dùng kháng sinh đƣợc định nghĩa là tình trạng tiêu chảy xảy ra có liên quan đến việc sử dụng kháng sinh gây phá vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩn đƣờng ruột hoặc làm phát triển quá mức các vi khuẩn có hại sinh độc tố [22]. Trong số các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, Clostridium difficile (C. difficile) là nguyên nhân nhiễm trùng quan trọng nhất, chiếm từ 10-25% các ca tiêu chảy sau dùng kháng sinh, 90-100% các ca viêm đại tràng giả mạc sau dùng kháng sinh [23, 127].

diffìcile là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, có khả năng sinh bào tử. Vi khuẩn này đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng phổ biến ở các nƣớc châu Âu và châu Mỹ trong gần hai thập kỉ qua. difficile là nguyên nhân hàng đầu gây ra các ca tử vong do viêm dạ dày ruột [41, 61, 105]. Các nghiên cứu dịch tễ học phân tử trên thế giới đã chỉ ra rằng có mối liên quan giữa mức độ nặng của bệnh với kiểu gen của vi khuẩn, điển hình nhƣ típ C.

difficile BI/NAP1/027 đƣợc xác định là căn nguyên gây ra nhiều vụ dịch lớn ở Châu Âu và Bắc Mỹ vào đầu thế kỉ XXI. Do vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ học phân tử của C. difficile gây bệnh là cần thiết cho điều tra vụ dịch tiêu chảy trong bệnh viện và phát hiện một típ chủng vi khuẩn có khả năng gây ra các vụ dịch mới.