Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài nấm ở Việt Nam" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hiền dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đặng Ngọc Quang và TS. Lưu Văn Huyền, bảo vệ năm 2017 tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ (mã số 62.14).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bối cảnh sức khỏe cộng đồng toàn cầu đối mặt với sự gia tăng của các căn bệnh nan y như ung thư, HIV-AIDS và các bệnh viêm nhiễm. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm thế giới ghi nhận khoảng 9 đến 10 triệu ca mắc mới bệnh ung thư, với khoảng một nửa số bệnh nhân tử vong. Các phương pháp điều trị hiện hành bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị và thuốc tổng hợp thường đi kèm nhiều tác dụng phụ và làm suy kiệt thể trạng người bệnh. Do đó, xu hướng nghiên cứu và khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ thực vật, vi nấm và sinh vật biển nhằm tìm kiếm dược chất mới đang nhận được sự quan tâm lớn.

Giới nấm trên thế giới ước tính có khoảng 1,5 triệu loài, song nhân loại mới phát hiện và mô tả được khoảng 5% (tương đương 75.000 đến 100.000 loài). Tại Việt Nam, số lượng loài nấm ước tính khoảng 22.000 loài, riêng chi nấm linh chi có khoảng 60 loài. Mặc dù nguồn tài nguyên nấm dược liệu tại Việt Nam rất phong phú, các nghiên cứu trong nước trước đây chủ yếu tập trung vào khía cạnh phân loại học và đa dạng sinh học, còn các công trình nghiên cứu sâu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học còn rất hạn chế. Đặc biệt, nhiều loài nấm đặc hữu hoặc mới được phát hiện chưa từng được khảo sát về mặt hóa học và dược lý.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Luận án xác định 5 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:

  1. Thu thập và xác định tên khoa học của 5 loài nấm nghiên cứu.
  2. Ngâm, chiết và thu các dịch chiết tổng từ các loài Tomophagus cattienensis, Ganoderma mirabile, Ganoderma neo-japonicum, Kretzschmaria sandvicensis và Daldinia eschscholzii.
  3. Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ cao chiết của 5 loài nấm trên.
  4. Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ.
  5. Thử hoạt tính sinh học (độc tế bào ung thư và kháng sinh) của một số hợp chất phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: 5 loài nấm thuộc 2 họ nấm lớn ở Việt Nam:
    • Họ Nấm gỗ / Linh chi (Ganodermataceae): Nấm linh chi vàng (Tomophagus cattienensis), Nấm linh chi (Ganoderma mirabile), Nấm linh chi tím (Ganoderma neo-japonicum).
    • Họ Nấm than (Xylariaceae): Nấm Kretzschmaria sandvicensis, Nấm Daldinia eschscholzii.
  • Phạm vi không gian: Các mẫu nấm được thu hái tại các địa bàn phân bố tự nhiên ở Việt Nam gồm Vườn quốc gia Cát Tiên (tỉnh Lâm Đồng), tỉnh Lào Cai, tỉnh Điện Biên và tỉnh Phú Thọ.
  • Phạm vi chuyên môn: Chiết tách, phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký, xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ hiện đại, thử nghiệm hoạt tính độc tế bào ung thư biểu mô KB và hoạt tính kháng sinh.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại trong luận án

Tác giả đã hệ thống hóa các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hai họ nấm Xylariaceae và Ganodermataceae:

  1. Nghiên cứu về họ nấm Xylariaceae:

    • W.B. Turner (1971, 1983) đã tổng kết sự phát triển số lượng các hợp chất có hoạt tính từ nấm (từ gần 1.000 chất năm 1971 lên gấp đôi vào năm 1983 và hiện nay vượt quá 6.000 chất).
    • Dẫn xuất cytochalasin: 18-deoxycytochalasin H từ Xylaria sp.; các hợp chất cytochalasin (2, 3) công bố năm 1994; cytochalasin khung 10-phenyl-[11]-cytochalasin (4-7) từ Daldinia sp. tại Nhật Bản; phenochalasin B (8) từ Daldinia concentrica tại Đức có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh; fragiformin A-B (9, 10) và cytochalasin H (11) từ Hypoxylon fragiforme tại Đức; dẫn xuất xylarisin (12) từ Xylaria sp. tại Thái Lan có hoạt tính kháng khuẩn.
    • Dẫn xuất azaphilone: Steglich và cộng sự (1974) phân lập các dẫn xuất mitorubrin (13-16) từ nấm Hypoxylon, trong đó mitorubrinol (13) có hoạt tính diệt giun ($LD_{50} = 50\ \mu\text{g/ml}$); rubiginosin A và B (17, 18) từ H. rubiginosin tại Đức; sassafrin A-D (19-22) từ cặn chiết metanol của Creosphaeria sassafras tại Pháp (sassafrin C có $LD_{50}$ diệt giun là $25\ \mu\text{g/ml}$).
    • Dẫn xuất naphthalen và các hợp chất khác: 4,5,4',5'-tetrahydroxy-1,1'-binaphthyl (BNT) (23) từ H. fuscum; triterpen khung squalen gồm concentricol, concentricol B-D (26-29) từ Daldinia concentrica; hai sesquiterpenoid xylarenal A (30) và xylarenal B (31) từ Xylaria persicaria do Cameron J. Smith và cộng sự phân lập; mellisol (32) và dẫn xuất (33, 34) từ Xylaria mellisii tại Vườn quốc gia Kaeng Krachan (Thái Lan); axit integric (35-38) từ Xylaria sp. có khả năng ức chế enzym của virus HIV với $IC_{50} = 3\text{--}10\ \mu\text{M}$.

  2. Nghiên cứu về họ nấm Linh chi (Ganodermataceae):

    • Các nhóm chất hữu cơ chính gồm polysaccharide ($\beta\text{-D-glucan}$ 1-3 và 1-6) có tác dụng kích thích miễn dịch; nhóm triterpenoid dạng lanostan (hơn 100 loại axit ganoderic như GA-A, B, C, D, E, F, G, T, axit lucidunic, ganodermadiol) với hoạt tính gây độc tế bào khối u và ức chế sinh tổng hợp cholesterol.
    • Các nghiên cứu quốc tế: Nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc (2002) phân lập 3 lanostan triterpen andehit (52-54) gây độc tế bào ung thư phổi LLC, ung thư vú T-47D, Sarcoma 180 và Meth-A; nghiên cứu tại Trung Quốc (2014) trên loài Ganoderma tropicum phân lập nortriterpenoid 26-nor-11,23-dioxo-5$\alpha$-lanost-8-en-3$\beta$,7$\beta$,15$\alpha$,25-tetrol (55) và lucidone D (56); nghiên cứu tại Thụy Sĩ (2005) tách 4 hợp chất từ G. lucidum có khả năng ức chế sinh tổng hợp cholesterol.
    • Các nghiên cứu tại Việt Nam: Nghiên cứu tại Thừa Thiên Huế và Đại học Toyama (Nhật Bản) trên loài Hoàng chi (Ganoderma colossum) phân lập 7 dẫn xuất colossolactone (A-G) và các lanostan triterpen lacton mới; nghiên cứu của Trần Đình Thắng trên nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) phân lập nigrofomin A (61) và B (62) gây độc các dòng tế bào ung thư Jurkat, NPC-TW01, NCI H661; nghiên cứu của Đặng Ngọc Quang và cộng sự trên nấm Daldinia concentrica phân lập 6-hydroxymellein (63), daldinialanone (64), ergosterol (65) và trên loài Ganoderma tropicum phân lập hợp chất (66, 67).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các nghiên cứu quốc tế và một số nghiên cứu trong nước đã chỉ ra tiềm năng hóa dược của nấm, 5 loài nấm cụ thể gồm Tomophagus cattienensis, Ganoderma mirabile, Ganoderma neo-japonicum, Kretzschmaria sandvicensis và Daldinia eschscholzii chưa từng được nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học tại Việt Nam. Đặc biệt, loài Tomophagus cattienensis là loài nấm mới được định danh tại Vườn quốc gia Cát Tiên, hoàn toàn chưa có bất kỳ dữ liệu hóa học hay hoạt tính sinh học nào trước thời điểm luận án thực hiện.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu được thiết kế dựa trên quy trình chuẩn của Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Natural Products Chemistry), kết hợp giữa chiết xuất hóa học hữu cơ, các kỹ thuật phân tách sắc ký hiện đại, phân tích cấu trúc phân tử bằng phổ học hạt nhân và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Thu thập và xử lý mẫu: Mẫu nấm tươi sau khi thu hái được phân loại sinh học, rửa sạch, phơi/sấy khô ở nhiệt độ 40–60°C hoặc dùng tươi, sau đó xay nhỏ để chuẩn bị cho quá trình chiết.
  • Chiết xuất và phân lập:
    • Chiết hồi lưu và chiết hỗ trợ siêu âm (thiết bị Ultrasonic Cleaner) bằng các dung môi hữu cơ tinh khiết (metanol, etyl axetat, n-hexan, clorofom, axeton, nước).
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silica gel và silica gel pha đảo RP-18 của hãng Merck; soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm, hiện màu bằng thuốc thử $H_2SO_4$ trong metanol và sấy nhiệt ở 100°C.
    • Sắc ký cột thường (CC) sử dụng pha tĩnh silica gel Merck kích thước hạt 60–100 $\mu\text{m}$, pha đảo RP-18 (60–100 $\mu\text{m}$) và lọc gel trên Sephadex LH-20.
    • Sắc ký lỏng điều chế hiệu năng cao (Prep. HPLC) của hãng Jasco sử dụng cột pha đảo RP-18.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Đo độ quay cực riêng $[\alpha]_D$ trên phân cực kế tự động JASCO DIP-2000 trong dung môi MeOH.
    • Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy Jasco V-560 spectrophotometer.
    • Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy Thermo Nicolet 5700 FT-IR spectrophotometer (phương pháp ép viên KBr).
    • Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên thiết bị Agilent 1200 LC-MS.
    • Phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry) đo trên máy Bruker Apex III FT-ICR-MS tại Viện Hóa sinh thực vật Leibniz (Halle, CHLB Đức).
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo trên máy Bruker Avance 500 MHz, bao gồm phổ 1 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT) và phổ 2 chiều ($^1\text{H-}^1\text{H COSY}$, HSQC, HMBC).
    • Xác định cấu hình tương đối trong không gian dựa trên phổ tương tác không gian ROESY (Rotating frame Overhauser Effect Spectroscopy).
  • Phương pháp thử hoạt tính sinh học:
    • Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Tiến hành trên dòng tế bào ung thư biểu mô người KB (lấy từ ATCC) theo phương pháp MTT của Scudiero và cộng sự (1988). Tế bào được nuôi trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% PBS, ủ ở 37°C, 5% $CO_2$, độ ẩm 98%. Nồng độ mẫu thử nghiệm gồm 128, 32, 8, 2 và $0,5\ \mu\text{g/ml}$. Độ hấp thụ quang được đo tại bước sóng 540 nm trên máy quang phổ đa năng Genios TECAN. Giá trị $IC_{50}$ được tính toán dựa trên tỷ lệ ức chế tăng trưởng tế bào $(\text{OD}{\text{control}} - \text{OD}{\text{sample}}) / \text{OD}_{\text{control}}$.
    • Thử hoạt tính kháng sinh: Đánh giá khả năng kháng khuẩn và kháng nấm đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị.

Nguồn tư liệu và địa điểm thực hiện

  • Mẫu nấm được giám định định danh thực vật bởi PGS. Lê Xuân Thám (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Lâm Đồng) và PGS. Dương Minh Lam (Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội).
  • Thực nghiệm chiết tách thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
  • Phổ NMR, ESI-MS và thử nghiệm sinh học thực hiện tại Viện Hóa học và Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; phổ phân giải cao FT-ICR-MS thực hiện tại Viện Hóa sinh thực vật Leibniz (Halle, CHLB Đức).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 (30 trang) trình bày bức tranh tổng thể về giới nấm, phân loại học, giá trị dược lý và thành phần hóa học của các họ nấm nghiên cứu:

  • Phân loại giới nấm: Khái quát 6 lớp nấm chính dựa trên cấu quan sinh sản gồm Lớp Nấm cổ (Chytridiomycetes), Lớp Nấm trứng (Oomycetes), Lớp Nấm tiếp hợp (Zygomycetes), Lớp Nấm túi (Ascomycetes), Lớp Nấm đảm (Basidiomycetes) và Lớp Nấm bất toàn (Deuteromycetes).
  • Họ nấm Xylariaceae: Trình bày đặc điểm hình thái học (quả thể chất than hoặc chất da, dạng chùy hoặc hình cầu) và 4 nhóm hợp chất thứ cấp đặc trưng (Cytochalasin, Azaphilone, Naphthalen, Triterpenoid/Sesquiterpenoid).
  • Họ nấm Linh chi (Ganodermataceae): Tổng quan 6 chi/nhóm hình thái gồm Ganoderma, Elfvingia, Amauroderma, Tomophagus, Humphreya, và Haddowia. Trình bày phân loại theo 6 màu sắc theo "Bản thảo cương mục" (1595) của Lý Thời Trân.
Tên thường gọi Tên khoa học Màu sắc Công dụng y học cổ truyền ghi nhận
Hoàng chi, Kim chi Ganoderma colossum Vàng Vị ngọt, tính bình, an thần
Thanh chi — Xanh Vị toan bình, sáng mắt, bổ can khí, an thần
Hồng chi, Đơn chi, Xích chi Ganoderma lucidum Đỏ Vị đắng, tính bình, tăng trí tuệ, dưỡng tim
Bạch chi, Ngọc chi — Trắng Vị cay, tính bình, ích phế khí, tăng trí nhớ
Huyền chi, Hắc chi Amauroderma subresinosum Đen Vị mặn, tính ôn, trị chứng bí tiểu, tinh tường đầu óc
Tử chi Ganoderma japonicum (G. sinense / G. neo-japonicum) Tím Vị ngọt, tính ôn, trị đau nhức xương khớp, gân cốt
  • Thành phần hóa khoáng trong nấm Linh chi: Dữ liệu phân tích kích hoạt neutron tại lò phản ứng hạt nhân Đà Lạt cho thấy hàm lượng khoáng đa lượng và vi lượng phong phú giữa 3 chủng nấm Linh chi G. lucidum (Đà Lạt, Trung Quốc, Nấm Lim Bắc Việt Nam).
Nguyên tố Linh chi Đà Lạt (DL) Linh chi Trung Quốc (TQ) Linh chi Lim (Li)
N (%) 1,70 1,80 1,84
P (%) 0,38 0,33 0,27
K (%) 0,72 0,55 0,44
Ca (%) 0,08 0,11 0,10
Mg (%) 0,10 0,07 0,06
S (%) 0,14 0,22 0,22
Cl (%) 0,03 0,06 0,04
Na (%) 0,02 0,01 0,01

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Chương 2 (30 trang) mô tả chi tiết quy trình xử lý thực nghiệm, hóa chất, thiết bị và các bước phân tách hợp chất từ 5 loài nấm:

  • Quy trình chiết xuất và phân lập nấm Linh chi vàng (Tomophagus cattienensis):
    • Mẫu nấm khô (110 g) được xay nhỏ, ngâm chiết etyl axetat và chiết siêu âm nhiều lần (30 phút/lần), lọc và cất đuổi dung môi thu được 4,3 g cặn chiết etyl axetat.
    • Cặn chiết được phân tách qua cột Sephadex LH-20 ($CHCl_3 : CH_3OH = 1:1$) thu 3 phân đoạn: BTH1A, BTH1B, BTH1C.
    • Phân đoạn BTH1B (1700 mg) tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan : axeton (10:1, 8:1, 5:1, 1:1) thu được 8 phân đoạn phụ (BTH1B1 – BTH1B8).
    • Phân đoạn BTH1B3 (23 mg) tinh chế bằng Prep. HPLC pha đảo RP-18 ($CH_3OH : H_2O = 83:17$, tốc độ dòng 1 ml/phút) thu được hợp chất H1 (schisanlactone A, 10 mg, $t_R = 22$ phút) và hợp chất H3 (cattienoid B, 10 mg, $t_R = 16,5$ phút).
    • Phân đoạn BTH1B7 (275 mg) tinh sạch bằng Prep. HPLC pha đảo ($CH_3OH : H_2O = 75:25$, $t_R = 25$ phút) thu được hợp chất H2 (cattienoid A, 5 mg).
    • Phân lập tiếp tục thu được hợp chất H4 (cattienoid C).
  • Quy trình chiết tách tương tự được áp dụng cho 4 loài nấm còn lại (Ganoderma mirabile, Ganoderma neo-japonicum, Kretzschmaria sandvicensis, Daldinia eschscholzii), thu được các cặn chiết phân đoạn và tinh sạch các chất từ H5 đến H20.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 (59 trang) là nội dung trọng tâm của luận án, công bố cấu trúc hóa học chi tiết của 20 hợp chất và kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

  • Phân lập và xác định cấu trúc 20 hợp chất:

    1. Nấm Tomophagus cattienensis: Phân lập được 4 hợp chất gồm schisanlactone A (H1), cattienoid A (H2), cattienoid B (H3), cattienoid C (H4). Trong đó H2, H3, H4 là 3 hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện và công bố trên thế giới. Cấu trúc được xác định dựa trên phổ khối FT-ICR-MS, phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC và cấu hình tương đối qua phổ ROESY.
    2. Nấm Ganoderma mirabile: Phân lập được 4 hợp chất gồm ergosterol (H5), ergosterol peroxide (H6), axit ganoderic Y (H7), và axit palmictic (H8).
    3. Nấm Ganoderma neo-japonicum: Phân lập được 4 hợp chất gồm ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (H9), ganodermadiol (H10), ergosterol (H11), và ergosta-7,22-đien-3$\beta$-ol (H12).
    4. Nấm Kretzschmaria sandvicensis: Phân lập được 3 hợp chất gồm o-methylsilvaticol (H13), orthosporin (H14), và diplosporin (H15).
    5. Nấm Daldinia eschscholzii: Phân lập được 5 hợp chất gồm cytochalasin 1 (H16), cytochalasin 3 (H17), cytochalasin 4 (H18), bis(2-ethylhexyl) terephthalate (H19), và ergosta-7,24($24^1$)-dien-3$\beta$-ol (H20).

  • Kết quả thử hoạt tính sinh học:

Ký hiệu Tên hợp chất Loài nấm nguồn gốc Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB ($IC_{50}\ \mu\text{g/ml}$)
H1 Schisanlactone A Tomophagus cattienensis 30,40
H2 Cattienoid A (chất mới) Tomophagus cattienensis Không thể hiện hoạt tính
H3 Cattienoid B (chất mới) Tomophagus cattienensis 31,04
H4 Cattienoid C (chất mới) Tomophagus cattienensis Không thể hiện hoạt tính
H7 Axit ganoderic Y Ganoderma mirabile 77,65
H9 Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on Ganoderma neo-japonicum 12,68
H11 Ergosterol Ganoderma neo-japonicum 10,72
H12 Ergosta-7,22-đien-3$\beta$-ol Ganoderma neo-japonicum 87,95
H14 Orthosporin Kretzschmaria sandvicensis 78,75
  • Kết quả thử hoạt tính kháng sinh: Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của 7 hợp chất tinh khiết (H1, H2, H3, H4, H16, H17, H18). Kết quả thực nghiệm cho thấy các hợp chất này không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về khoa học và lý luận

  1. Luận án là công trình khoa học đầu tiên nghiên cứu có hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 5 loài nấm tại Việt Nam: Tomophagus cattienensis, Ganoderma mirabile, Ganoderma neo-japonicum, Kretzschmaria sandvicensis và Daldinia eschscholzii.
  2. Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 20 hợp chất tinh khiết thuộc các khung cấu trúc lanostan triterpenoid, steroid, cytochalasin, dẫn xuất isocoumarin và ester hữu cơ.
  3. Phát hiện và công bố 3 hợp chất mới chưa từng được biết đến trong y văn thế giới từ nấm Linh chi vàng (Tomophagus cattienensis), được đặt tên là:
    • Cattienoid A (H2)
    • Cattienoid B (H3)
    • Cattienoid C (H4) Cấu trúc hóa học và cấu hình không gian tương đối của các chất mới này được giải đoán sáng tỏ bằng tổ hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều và phổ khối phân giải cao FT-ICR-MS.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô người (dòng tế bào KB) của các chất phân lập được. Trong đó, chất mới cattienoid B (H3) thể hiện hoạt tính độc tế bào rõ rệt với giá trị $IC_{50} = 31,04\ \mu\text{g/ml}$; hợp chất schisanlactone A (H1) có $IC_{50} = 30,40\ \mu\text{g/ml}$; hai hợp chất steroid là ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (H9) và ergosterol (H11) thể hiện hoạt tính mạnh nhất với $IC_{50}$ lần lượt là $12,68\ \mu\text{g/ml}$ và $10,72\ \mu\text{g/ml}$.
  2. Bổ sung cơ sở dữ liệu hóa học và hoạt tính sinh học có giá trị đối với nguồn tài nguyên nấm dược liệu Việt Nam, đặc biệt là loài nấm đặc hữu mới Tomophagus cattienensis tại Vườn quốc gia Cát Tiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được chỉ mới dừng lại ở mức thử nghiệm in vitro trên một dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng sinh; chưa mở rộng khảo sát trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau.
    • Các hợp chất thử nghiệm hoạt tính kháng sinh (H1, H2, H3, H4, H16, H17, H18) chưa ghi nhận hoạt tính ức chế đối với các chủng vi sinh vật kiểm định trong phạm vi nồng độ thử nghiệm.
    • Do hạn chế về khối lượng mẫu phân lập ở một số phân đoạn, chưa thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với toàn bộ 20 hợp chất tinh sạch.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tiềm năng (đặc biệt là nhóm cattienoid và steroid) trên các dòng tế bào ung thư khác (như ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF7, ung thư phổi SK-LU-1).
    • Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử tác động lên tế bào ung thư của cattienoid B (H3), ergosterol (H11) và ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (H9).
    • Tiếp tục thu thập sinh khối và tối ưu quy trình chiết xuất nhằm khảo sát sâu hơn các cấu tử vết trong loài nấm Tomophagus cattienensis.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết tách, phân đoạn sắc ký (kết hợp Sephadex LH-20, sắc ký cột pha thường, pha đảo và Prep. HPLC) cũng như phương pháp luận giải đoán cấu trúc phân tử phức tạp bằng các kỹ thuật phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC, ROESY và FT-ICR-MS.
  • Đối với các nhà khoa học ngành Dược học và Hóa sinh: Cung cấp dữ liệu về các hợp chất tự nhiên có hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng biểu mô KB, tạo tiền đề cho việc sàng lọc và nghiên cứu phát triển các dẫn chất kháng u.
  • Đối với các nhà nghiên cứu Nấm học và Quản lý Tài nguyên Dược liệu: Cung cấp dẫn liệu hóa thực vật học chuẩn xác khẳng định giá trị sử dụng và bảo tồn của các loài nấm dược liệu bản địa tại Việt Nam, đặc biệt là nguồn gen nấm Tomophagus cattienensis tại Vườn quốc gia Cát Tiên.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba hợp chất mới được phát hiện trong luận án là gì và được phân lập từ loài nấm nào?
Ba hợp chất mới được phát hiện và công bố lần đầu tiên là cattienoid A (H2), cattienoid B (H3) và cattienoid C (H4). Cả ba hợp chất này đều được phân lập từ cặn chiết etyl axetat của nấm Linh chi vàng (Tomophagus cattienensis) thu thập tại Vườn quốc gia Cát Tiên, tỉnh Lâm Đồng.

2. Những hợp chất nào trong luận án thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB mạnh nhất?
Trong số các hợp chất được thử nghiệm, hai hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào KB mạnh nhất là ergosterol (H11) với giá trị $IC_{50} = 10,72\ \mu\text{g/ml}$ và ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on (H9) với giá trị $IC_{50} = 12,68\ \mu\text{g/ml}$. Ngoài ra, hợp chất schisanlactone A (H1) và hợp chất mới cattienoid B (H3) cũng có hoạt tính đáng kể với $IC_{50}$ lần lượt là $30,40\ \mu\text{g/ml}$ và $31,04\ \mu\text{g/ml}$.

3. Luận án sử dụng những phương pháp phổ nào để giải đoán cấu trúc và xác định cấu hình không gian của các chất?
Cấu trúc hóa học phân tử được xác định thông qua sự kết hợp của phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng phân giải cao (FT-ICR-MS), phổ khối ESI-MS và hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC). Cấu hình không gian tương đối của các phân tử được xác định thông qua phổ tương tác không gian ROESY.

4. Quy trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB được thực hiện theo phương pháp nào?
Thử nghiệm được thực hiện trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB (nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% PBS, ủ ở 37°C, 5% $CO_2$) theo phương pháp thử nghiệm MTT của Scudiero và cộng sự (1988). Mẫu thử được pha ở các dải nồng độ từ 0,5 đến $128\ \mu\text{g/ml}$ trên phiến 96 giếng; mật độ quang hấp thụ được đo tại bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ Genios TECAN để tính toán giá trị $IC_{50}$.

5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của các chất phân lập được cho thấy điều gì?
Nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng sinh (kháng khuẩn và kháng nấm) trên 7 hợp chất sạch gồm H1, H2, H3, H4, H16, H17 và H18. Kết quả thực nghiệm ghi nhận toàn bộ 7 hợp chất này không thể hiện hoạt tính kháng sinh đối với các chủng vi sinh vật được thử nghiệm.

Kết luận

Luận án tiến sĩ "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài nấm ở Việt Nam" của tác giả Bùi Thị Thu Hiền đã khảo sát toàn diện thành phần hóa học của 5 loài nấm thuộc hai họ Ganodermataceae và Xylariaceae. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của 20 hợp chất tinh khiết, trong đó phát hiện 3 hợp chất mới là cattienoid A, B và C từ loài nấm Tomophagus cattienensis. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học đã xác định được giá trị ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của 7 hợp chất, nổi bật với hoạt tính mạnh của ergosterol, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on, schisanlactone A và cattienoid B. Đây là công trình thực nghiệm hóa hữu cơ có đóng góp cụ thể vào việc làm sáng tỏ cơ sở hóa học và tiềm năng dược lý của nguồn tài nguyên nấm tại Việt Nam.