Khóa luận: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Sakhan thu hái tại Lào - ĐH Dược Hà Nội

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sakhan thu hái tại Lào, mang lại hiểu biết mới về ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Shyphayvan Mangnomek
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Mạnh Tuyển
• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học và Một Số Hoạt Tính Sinh Học của Cây Sakhan Tại Lào
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN VỀ CÂY SAKHAN
• 2.1. Tổng quan về thực vật học
• 2.2. Tổng quan về thành phần hóa học
• 2.3. Công dụng và liều dùng trong y học cổ truyền
• 2.4. Các phương pháp chiết xuất phân lập
• 2.4.1. Các phương pháp chiết xuất
• 2.4.2. Các phương pháp phân lập, tinh chế
• 2.4.3. Các phương pháp đánh giá hợp chất phân lập được
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn
• 3.5. Phương pháp phân lập, kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc các hợp chất
• 3.5.1. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
• 3.5.2. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn
• 4.2. Đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase in vitro của các cao phân đoạn
• 4.3. Phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn của cây Sakhan
• 4.3.1. Phân lập các hợp chất
• 4.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 4.3.3. Đánh giá tác dụng ức chế acetylcholinesterase in vitro của các hợp chất phân lập được
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thành phần hóa học cây Sakhan tại Lào

Cây Sakhan, hay còn gọi là Piper wallichii, là một loại cây dược liệu quý hiếm tại Lào. Nghiên cứu về thành phần hóa học cây Sakhan đã chỉ ra rằng cây này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý. Việc tìm hiểu về cây Sakhan không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên.

1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Sakhan

Cây Sakhan là cây thân leo, có chiều cao từ 2-4m. Lá cây có hình trứng thuôn, hoa mọc thành cụm. Cây thường phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc Lào, nơi có khí hậu ẩm ướt.

1.2. Ý nghĩa của cây Sakhan trong y học cổ truyền

Trong y học cổ truyền, cây Sakhan được sử dụng để kích thích tiêu hóa, giảm đau và điều trị một số bệnh như lỵ và ký sinh trùng. Việc nghiên cứu hoạt tính sinh học cây Sakhan giúp khẳng định giá trị của cây trong điều trị bệnh.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu cây Sakhan

Mặc dù cây Sakhan có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu vẫn gặp nhiều thách thức. Thiếu thông tin về các nghiên cứu về cây Sakhan và các hợp chất cụ thể trong cây là một trong những vấn đề lớn. Điều này ảnh hưởng đến khả năng phát triển sản phẩm từ cây dược liệu này.

2.1. Thiếu hụt thông tin về thành phần hóa học

Nhiều hợp chất trong cây Sakhan vẫn chưa được xác định rõ ràng. Việc này gây khó khăn trong việc đánh giá chính xác tác dụng của cây Sakhan trong y học.

2.2. Khó khăn trong việc bảo tồn và phát triển

Cây Sakhan đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức. Việc bảo tồn và phát triển cây cần được chú trọng để duy trì nguồn gen quý giá này.

III. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học cây Sakhan

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Sakhan được thực hiện thông qua nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau. Các phương pháp này giúp phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại sẽ nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

3.1. Các phương pháp chiết xuất phổ biến

Các phương pháp chiết xuất như chiết lạnh, chiết nóng và chiết siêu âm được sử dụng để thu nhận cao chiết từ cây Sakhan. Mỗi phương pháp có ưu điểm riêng, phù hợp với từng loại hợp chất.

3.2. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất

Sau khi chiết xuất, các hợp chất sẽ được phân lập và xác định cấu trúc bằng các phương pháp sắc ký và phổ. Điều này giúp xác định rõ ràng các hợp chất trong cây Sakhan.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của cây Sakhan

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây Sakhan có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase. Những phát hiện này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ cây Sakhan, phục vụ cho việc điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh lý khác.

4.1. Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase

Nghiên cứu cho thấy cao chiết từ cây Sakhan có khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase với giá trị IC50 ấn tượng. Điều này cho thấy tiềm năng của cây trong việc điều trị bệnh Alzheimer.

4.2. Ứng dụng trong y học cổ truyền

Cây Sakhan đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh lý. Việc nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ cây sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và bảo tồn giá trị văn hóa y học cổ truyền.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu cây Sakhan

Nghiên cứu về cây Sakhan đã chỉ ra nhiều tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn về thành phần hóa học cây Sakhan và ứng dụng của nó trong y học hiện đại. Tương lai của cây Sakhan hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho cộng đồng.

5.1. Tầm quan trọng của việc bảo tồn cây Sakhan

Bảo tồn cây Sakhan là cần thiết để duy trì nguồn gen và phát triển các sản phẩm dược liệu. Việc này không chỉ bảo vệ môi trường mà còn góp phần vào sự phát triển kinh tế địa phương.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc xác định các hợp chất cụ thể và đánh giá tác dụng sinh học của chúng. Điều này sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả từ cây Sakhan.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh Alzheimer được xác định là một trong những rối loạn thoái hóa thần kinh phổ biến nhất và là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến hội chứng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi. Căn nguyên bệnh sinh của Alzheimer gắn liền với giả thuyết cholinergic, trong đó sự suy giảm chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin tại các synap thần kinh não bộ chiếm tới gần 90%. Enzym acetylcholinesterase (AChE) đóng vai trò xúc tác phản ứng thủy phân acetylcholin thành cholin và acid acetic, làm chấm dứt dẫn truyền thần kinh. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các hoạt chất có khả năng ức chế enzym AChE nhằm duy trì nồng độ acetylcholin sinh lý là một trong những hướng tiếp cận điều trị quan trọng. Xu hướng nghiên cứu dược liệu hiện nay tập trung vào phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên theo định hướng hoạt tính sinh học (bioassay-guided isolation), giúp tối ưu hóa thời gian, chi phí và nâng cao khả năng tìm kiếm các phân tử có hoạt tính so với phương pháp phân lập ngẫu nhiên truyền thống.

Cây Sakhan, có tên khoa học là Piper wallichii (Miq.) thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), là loài thực vật được sử dụng phổ biến trong y học dân gian tại Lào với các công dụng như kích thích tiêu hóa, giảm đau, hỗ trợ tăng cường trí nhớ, điều trị lỵ và lở loét dạ dày. Mặc dù một số nghiên cứu sơ bộ trước đây đã ghi nhận cao chiết từ thân Piper wallichii có tác dụng ức chế AChE in vitro và in vivo, song các hợp chất hóa học cụ thể đóng góp vào hoạt tính này vẫn chưa được phân lập và xác định đầy đủ.

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ thực hiện hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Chiết xuất, phân lập 1–2 hợp chất từ thân cây Sakhan (Piper wallichii) theo định hướng tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro.
2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các hợp chất phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bộ phận thân của cây Sakhan (Piper wallichii (Miq.), họ Piperaceae), thu hái vào tháng 12 năm 2023 tại tỉnh Luangprabang, Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào. Mẫu thực vật đã được Trung tâm Tài nguyên dược liệu – Viện Dược liệu giám định tên khoa học và lưu giữ tiêu bản dưới mã số DV-070524.
• Phạm vi thực hiện: Quá trình chiết xuất, tách phân đoạn và phân lập hợp chất hóa học được tiến hành tại Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội. Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro được thực hiện tại Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng hóa thực vật học của chi Piper L. và cơ chế sinh hóa của phản ứng ức chế enzym acetylcholinesterase:

• Khung phân loại và cơ sở hóa học: Cây Sakhan thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Piperales, họ Piperaceae, chi Piper L., loài Piper wallichii (Miq.). Tổng quan tài liệu ghi nhận trong loài này có hơn 60 hợp chất đã được xác định, bao gồm các nhóm alcaloid (khung piperidin, piperolactam, aporphin, isoquinolin, chuỗi hở), lignan (khung tetrahydrofuran, furofuran, aryltetralin, neolignan), lignamid, flavonoid, phenolic và triterpenoid.
• Phương pháp chiết xuất và phân đoạn: Dược liệu thân khô được chiết xuất bằng phương pháp ngâm chiết kết hợp (ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng 24 giờ, ngâm ấm ở 45°C trong 24 giờ và hỗ trợ bởi sóng siêu âm 30 phút × 3 lần) sử dụng dung môi ethanol 96%. Cao toàn phần sau khi cô thu hồi dung môi được phân tán trong nước và tiến hành chiết lỏng – lỏng phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat (EtOAc) và n-butanol (n-BuOH), thu về 4 cao phân đoạn tương ứng cùng dịch nước còn lại.
• Phương pháp hóa thực vật và phân lập: Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng phản ứng tạo màu và kết tủa đặc trưng với các thuốc thử hóa học (Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Cyanidin, FeCl3, phản ứng mở/đóng vòng lacton, gelatin, Liebermann – Burchardt, Lugol). Quá trình phân lập hoạt chất sử dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) pha thuận với chất hấp phụ là Silica gel 60 (cỡ hạt 60–200 µm) và sắc ký cột pha đảo RP-18 (Reversed Phase C-18). Quá trình rửa giải và gom phân đoạn được theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254.
• Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc: Độ tinh khiết của các phân tử tinh khiết được kiểm tra trên TLC với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau và kiểm tra định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Shimadzu LC-2030C, cột Gemini NX-C18 kích thước 250 mm × 4,6 mm, đầu dò UV tại bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 1 mL/phút). Cấu trúc hóa học được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC đo tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và đối chiếu với dữ liệu phổ trong các tài liệu tham khảo đã công bố.
• Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro: Đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE theo nguyên tắc đo quang của phương pháp Ellman (1961) cải tiến trên phiến 96 giếng. Phản ứng sử dụng cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) nồng độ 2,5 mM, enzym AChE (EC 3.1.1.7) nồng độ 0,25 IU/mL và thuốc thử tạo màu acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) nồng độ 2,5 mM trong đệm phosphat pH = 8,0. Độ hấp thụ quang học được đo tại bước sóng 405 nm trên máy đọc ELISA (Molecular Devices, Mỹ). Galantamin được sử dụng làm chất đối chứng dương. Khả năng ức chế enzym được biểu thị qua giá trị IC50, xử lý thống kê bằng phần mềm SigmaPlot 10 và Excel thông qua kiểm định Student's t-test (p < 0,05).

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan về cây Sakhan

Chương tổng quan hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, sinh thái, phân bố, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài Piper wallichii (Miq.):

• Thực vật học và phân bố: Cây Sakhan là dạng cây thân leo lâu năm, gốc mọc bò, thân cành mang hoa thẳng đứng cao từ 2–4 m. Lá mọc so le, phiến lá hình trứng thuôn dài, gốc hình tim lệch, đầu nhọn. Cụm hoa đơn tính; cụm quả hạch hình cầu khi chín có màu đỏ, đường kính 0,3–0,6 cm. Cây phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á (Lào, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ, Myanmar). Tại Lào, cây mọc nhiều ở các tỉnh phía Bắc như Luangprabang, Xiengkhouang, Xayaboury, ưa ẩm và chịu bóng ven suối, rừng núi đá vôi.
• Thành phần hóa học: Tổng hợp chi tiết các nhóm hoạt chất chính bao gồm 18 alcaloid (tiêu biểu như piperin, piperlonguminin, pellitorin, guineensin, piperolactam A–D, cepharadion A), 28 dẫn xuất lignan (galbelgin, neoolivil, prestegan B, syringaresinol, pinoresinol, medioresinol, isolariciresinol, lyonisid, nudiposid, kadsurenon), các lignamid hiếm gặp (dicarboxamid, hancamid A, hancamid B), flavonoid ((-)-epicatechin, (-)-taxifolin), triterpenoid và các hợp chất phenolic (piperwalliosid A–D).
• Tác dụng sinh học và công dụng y học cổ truyền: Ngoài kinh nghiệm dùng làm thuốc kích thích tiêu hóa, giảm đau và tăng trí nhớ tại Lào và Trung Quốc, Piper wallichii còn là một trong 5 vị thuốc của bài thuốc cổ truyền "Benjakul" nổi tiếng của Thái Lan. Các công trình công bố ghi nhận cao chiết của cây có hoạt tính ức chế AChE in vitro (cao MeOH có IC50 = 28,57 µg/mL; cao EtOH 96% có IC50 = 12,27 µg/mL), cải thiện tốc độ bơm và làm chậm thoái hóa thần kinh trên mô hình giun Caenorhabditis elegans in vivo, kháng viêm, giảm đau trên mô hình chuột cống trắng, gây độc tế bào ung thư HK-2 và ức chế các chủng vi khuẩn Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus.
• Tổng quan phương pháp chiết xuất, phân lập: Phân tích quy trình của 7 công trình nghiên cứu tiêu biểu từ năm 1989 đến 2021 về việc xử lý dung môi chiết (MeOH, EtOH 70–96%), phương pháp phân đoạn lỏng – lỏng và kỹ thuật phân lập sử dụng sắc ký cột, HPLC điều chế.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết về hóa chất, trang thiết bị thí nghiệm và quy trình triển khai thực nghiệm:

• Nguyên liệu và thiết bị: 4 kg bột thân khô dược liệu Piper wallichii; hệ thống máy cô quay chân không Büchi (5 L và 20 L), tủ sấy Memmert, máy đọc ELISA Molecular Devices, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân của VAST, máy HPLC Shimadzu LC-2030C.
• Quy trình chiết xuất và phân đoạn: Mô tả các bước ngâm chiết 4 kg bột thân với ethanol 96% (tỷ lệ 4 kg dược liệu : 8 L dung môi × 3 lần), gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần. Tiếp tục hòa tan cao trong nước và chiết phân bố lỏng – lỏng với n-hexan, ethyl acetat, n-butanol (mỗi dung môi chiết 3 lần với thể tích 500 mL/lần).
• Quy trình phân lập và làm sạch chất: Thiết lập sơ đồ phân lập định hướng sinh học từ cao ethyl acetat bằng sắc ký cột Silica gel pha thuận (hệ dung môi rửa giải gradient dichloromethan : methanol từ tỷ lệ 99:1 đến 5:1 v/v), tiếp tục tinh chế phân đoạn trung gian bằng cột Silica gel (hệ ester dầu hỏa : aceton 10:1 và 5:1 v/v) và cột pha đảo RP-18 (hệ methanol : nước 2:1 v/v).
• Đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc: Quy chuẩn điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng (3 hệ dung môi), sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (pha động gradient, detector 210 nm) và phân tích các thông số dịch chuyển hóa học (δ), độ chẻ pic (s, d, dd, m), hằng số tương tác (J) trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC.
• Quy trình thử nghiệm ức chế enzym AChE in vitro: Mô tả nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng trong phiến 96 giếng (140 µL đệm phosphat pH 8, 20 µL mẫu thử ở 4 nồng độ pha loãng từ 0,8 đến 100 µg/mL, 20 µL enzym AChE 0,25 IU/mL, ủ 15 phút ở 25°C; thêm 10 µL DTNB 2,5 mM và 10 µL ACTI 2,5 mM, ủ tiếp 10 phút trước khi đo quang ở 405 nm).

Kết quả và bàn luận

Trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chiết tách, định tính, phân lập và đánh giá tác dụng sinh học:

1. Hiệu suất chiết xuất và kết quả định tính hóa thực vật:

   • Từ 4 kg bột thân khô đã chiết xuất được 195,7 g cao ethanol toàn phần.
   • Quá trình phân đoạn lỏng – lỏng thu được: 21,5 g cao n-hexan (HP); 28,3 g cao ethyl acetat (EP); 38,5 g cao n-butanol (BP) và 48,2 g cao nước (NP).
   • Phản ứng định tính cho thấy: Cao HP dương tính với steroid, triterpenoid, carotenoid; cao EP chứa nhiều nhóm chất nhất gồm alcaloid, flavonoid, coumarin, triterpenoid, tanin; cao BP chỉ dương tính với flavonoid; cao NP không cho phản ứng rõ rệt với các thuốc thử thử nghiệm.

2. Sàng lọc hoạt tính ức chế AChE của các cao phân đoạn:

   • Thử nghiệm in vitro tại các dải nồng độ 0,8; 4; 20 và 100 µg/mL cho thấy duy nhất cao phân đoạn ethyl acetat (EP) thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE rõ rệt với giá trị IC50 = 39,31 ± 3,12 µg/mL (ở nồng độ 100 µg/mL, tỷ lệ ức chế đạt 66,27 ± 1,96%).
   • Các cao phân đoạn HP, BP, NP đều không thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể ở nồng độ khảo sát (IC50 > 100 µg/mL). Chất đối chứng dương Galantamin đạt IC50 = 1,84 ± 0,15 µg/mL. Do đó, cao EP được chọn để thực hiện phân lập tiếp theo.

3. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat:

   • Tách 25 g cao EP qua cột sắc ký Silica gel pha thuận (4 × 60 cm) thu được 7 phân đoạn chính (PE1 đến PE7).
   • Phân đoạn PE4 (0,24 g) được tinh chế tiếp qua cột Silica gel (2 × 60 cm) thu được 6 phân đoạn phụ (PE4-1 đến PE4-6).
   • Phân đoạn PE4-3 (200 mg) qua cột pha đảo RP-18 (1 × 45 cm), rửa giải bằng methanol : nước (2:1 v/v), thu được 26 phân đoạn nhỏ. Gộp các ống 5–10 thu được 20,24 mg hợp chất PB1; gộp các ống 15–22 thu được 12,38 mg hợp chất PB2.

4. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học:

   • Hợp chất PB1: Tồn tại ở dạng chất vô định hình màu trắng. Trên TLC hiển thị 1 vết duy nhất (Rf = 0,30 trong n-hexan : EtOAc 2:8; Rf = 0,81 trong toluen : EtOAc 2:1; Rf = 0,97 trong EtOAc 100%). Sắc ký đồ HPLC ghi nhận một pic chính tại thời gian lưu 19,81 phút với độ tinh khiết đạt 98,47%. Dữ liệu phổ 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) kết hợp tương tác HMBC, HSQC xác định PB1 có 26 carbon, đặc trưng cho khung aryltetralin lignan mang 1 gốc đường β-D-glucopyranosyl tại C-4 và 2 nhóm methoxy tại C-5 (δC 56,8; δH 3,85) và C-3' (δC 56,4; δH 3,81). Hợp chất được xác định là (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid.
   • Hợp chất PB2: Tồn tại ở dạng bột vô định hình màu trắng hơi vàng. Trên TLC cho 1 vết đơn nhất (Rf = 0,30 trong n-hexan : EtOAc 2:8; Rf = 0,74 trong toluen : EtOAc 2:1; Rf = 0,98 trong EtOAc 100%). Sắc ký đồ HPLC xác định độ tinh khiết đạt 97,74% tại thời gian lưu 20,31 phút. Phân tích phổ NMR xác nhận cấu trúc khung tetrahydro-1H,3H-furo[3,4-c]furan với 26 carbon, mang một nhóm OH tại C-4, một gốc đường β-D-glucopyranosyl tại C-4' (proton anome δH 4,90, J = 7,5 Hz) và hai nhóm methoxy tại C-3 và C-3'. Cấu trúc được xác định là pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid.

5. Đánh giá hoạt tính ức chế AChE của các hợp chất tinh khiết và bàn luận quan hệ cấu trúc - tác dụng (SAR):

   • Cả hai hợp chất đều thể hiện hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro: PB1 có giá trị IC50 = 51,08 ± 0,63 µg/mL (tỷ lệ ức chế 78,25% ở 100 µg/mL); PB2 có giá trị IC50 = 55,75 ± 0,56 µg/mL (tỷ lệ ức chế 82,23% ở 100 µg/mL).
   • Về mối liên quan cấu trúc và tác dụng (SAR): Tác giả giải thích hoạt tính ức chế của PB1 có được nhờ sự hiện diện của nhân thơm phenyl, nhóm hydroxy tự do tại C-4' và các nhóm methoxy tại C-5, C-3' giúp tăng cường khả năng tương tác với enzym. Đối với PB2, nhóm hydroxy tại C-4 thúc đẩy liên kết hydro với trung tâm hoạt động của AChE, kết hợp với phân tử đường glucose gắn tại vị trí C-4' giúp gia tăng ái lực ức chế enzym.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu thực nghiệm đặt ra với các số liệu định lượng được tổng hợp chi tiết:

Mẫu thử nghiệm / Hợp chất	Khối lượng thu nhận	Độ tinh khiết HPLC (%)	Tỷ lệ ức chế AChE tại 100 µg/mL (%)	Giá trị IC50 ức chế AChE (µg/mL)
Cao toàn phần (EtOH 96%)	195,7 g	-	-	-
Cao phân đoạn n-hexan (HP)	21,5 g	-	47,51 ± 1,16	> 100
Cao phân đoạn ethyl acetat (EP)	28,3 g	-	66,27 ± 1,96	39,31 ± 3,12
Cao phân đoạn n-butanol (BP)	38,5 g	-	38,67 ± 1,44	> 100
Cao phân đoạn nước (NP)	48,2 g	-	27,43 ± 0,13	> 100
PB1: (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid	20,24 mg	98,47	78,25 ± 0,11	51,08 ± 0,63
PB2: pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid	12,38 mg	97,74	82,23 ± 0,20	55,75 ± 0,56
Galantamin (Đối chứng dương)	-	-	88,25 ± 2,20	1,84 ± 0,15

Các đóng góp khoa học chính của khóa luận:

• Lần đầu tiên phân lập và xác định thành công cấu trúc của 2 hợp chất lignan glycosid là (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid và pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid từ loài Piper wallichii (Miq.).
• Chứng minh bằng thực nghiệm rằng phân đoạn ethyl acetat của thân cây Sakhan có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro vượt trội so với các phân đoạn khác.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về hoạt tính ức chế AChE in vitro của hai phân tử lignan glycosid tinh khiết từ cây Sakhan, góp phần bổ sung bằng chứng khoa học cho việc sử dụng dược liệu này trong y học cổ truyền để hỗ trợ trí nhớ và định hướng nghiên cứu hoạt chất phòng ngừa, điều trị bệnh Alzheimer.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự xác định một số hạn chế gắn liền với phạm vi thực nghiệm:

• Nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mô đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro, chưa tiến hành các thử nghiệm dược lý in vivo trên các mô hình động vật thực nghiệm.
• Quá trình phân lập mới chỉ thực hiện trên một phân đoạn nhỏ (PE4-3) tách ra từ cao ethyl acetat, chưa khai thác hết các phân đoạn phân cực khác còn lại của cây Sakhan.

Các hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

• Tiếp tục mở rộng phân lập và tinh chế các hợp chất từ các phân đoạn khác của cao ethyl acetat bằng các phương pháp sắc ký hiện đại như HPLC điều chế.
• Tiến hành thử nghiệm đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo của hai hợp chất (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid và pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid trên các mô hình động vật thực nghiệm như mô hình mê lộ nước Morris hoặc mô hình mê lộ chữ Y.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu học thuật có giá trị tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và các nghiên cứu sinh thuộc chuyên ngành Dược học, Dược liệu – Dược học cổ truyền, Hóa thực vật và Hóa học các hợp chất thiên nhiên:

• Tham khảo về phương pháp luận: Cung cấp quy trình chiết xuất và phân lập hoạt chất thực vật theo định hướng tác dụng sinh học (bioassay-guided isolation), từ bước chiết thô, sàng lọc hoạt tính các phân đoạn lỏng – lỏng đến phân lập hợp chất tinh khiết.
• Tham khảo về kỹ thuật phân tích cấu trúc: Là tài liệu chi tiết về việc ứng dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1H, 13C, HMBC, HSQC) kết hợp HPLC để xác định cấu trúc các hợp chất lignan glycosid.
• Tham khảo về thử nghiệm sinh học vi lượng: Cung cấp quy trình chuẩn hóa thử nghiệm ức chế enzym acetylcholinesterase trên phiến 96 giếng theo phương pháp Ellman.

Câu hỏi thường gặp

1. Dược liệu Sakhan trong nghiên cứu được thu hái tại địa điểm nào và có tên khoa học chính xác là gì?
Dược liệu Sakhan được thu hái vào tháng 12 năm 2023 tại tỉnh Luangprabang, CHDCND Lào. Mẫu đã được Trung tâm Tài nguyên dược liệu – Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Piper wallichii (Miq.), thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), lưu giữ tiêu bản mã số DV-070524.

2. Cao phân đoạn nào từ thân cây Sakhan thể hiện hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất trong thử nghiệm sàng lọc?
Trong số 4 cao phân đoạn (n-hexan, ethyl acetat, n-butanol và nước), duy nhất cao phân đoạn ethyl acetat thể hiện tác dụng ức chế AChE in vitro rõ rệt với giá trị IC50 là 39,31 ± 3,12 µg/mL. Các cao phân đoạn còn lại đều có IC50 > 100 µg/mL.

3. Hai hợp chất tinh khiết phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat là gì và đạt độ tinh khiết bao nhiêu?
Hai hợp chất phân lập được gồm: Hợp chất 1 (PB1) là (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid có khối lượng 20,24 mg, độ tinh khiết HPLC đạt 98,47%; Hợp chất 2 (PB2) là pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid có khối lượng 12,38 mg, độ tinh khiết HPLC đạt 97,74%.

4. Hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro của hai hợp chất PB1 và PB2 được xác định như thế nào?
Hợp chất PB1 có giá trị IC50 = 51,08 ± 0,63 µg/mL (đạt tỷ lệ ức chế 78,25% ở nồng độ 100 µg/mL); hợp chất PB2 có giá trị IC50 = 55,75 ± 0,56 µg/mL (đạt tỷ lệ ức chế 82,23% ở nồng độ 100 µg/mL). Chất đối chứng dương Galantamin có giá trị IC50 = 1,84 ± 0,15 µg/mL.

5. Cơ chế liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) của PB1 và PB2 đối với enzym AChE được giải thích ra sao?
Hoạt tính ức chế của PB1 được lý giải do sự có mặt của nhân thơm, nhóm hydroxy tự do ở C-4' và các nhóm methoxy ở vị trí C-5 và C-3'. Đối với PB2, hoạt tính được tăng cường nhờ nhóm hydroxyl tại vị trí C-4 liên kết hydro với trung tâm hoạt động của enzym cùng sự có mặt của gốc đường glucose tại vị trí C-4'.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Shyphayvan Mangnomek đã chiết xuất và phân lập thành công hai hợp chất lignan glycosid tinh khiết là (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranosid và pinoresinol-4'-O-β-D-glucopyranosid từ phân đoạn ethyl acetat của thân cây Sakhan (Piper wallichii (Miq.) thu hái tại Lào. Nghiên cứu xác định cả hai hợp chất đều có hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro với giá trị IC50 lần lượt là 51,08 µg/mL và 55,75 µg/mL. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm về thành phần hóa thực vật và tiềm năng dược lý hỗ trợ chức năng nhận thức, mở ra định hướng nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính cải thiện trí nhớ in vivo của cây Sakhan.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer là rối loạn thoái hóa thần kinh thường gặp nhất và là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí [10]. Theo giả thuyết cholinergic, việc phát sinh bệnh Alzheimer có liên quan đến sự thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin trong não gần tới 90% [26]. Acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh với vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thần kinh và nồng độ acetylcholin được duy trì ổn định bởi enzym acetylcholinesterase (AChE). AChE là một enzym có chức năng làm ngưng lại hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin tại các synap thần kinh cholinergic thông qua việc thủy phân acetylcholin tạo thành cholin và acid acetic.

Như vậy, nguyên nhân chính của bệnh Alzheimer là do thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin trong não [4]. Do đó, việc tìm ra các thuốc ức chế AChE đang là vấn đề cấp thiết, thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. Trong những năm gần đây, các hợp chất có nguồn gốc từ các cây dược liệu có khả năng ức chế AChE đã được quan tâm nghiên cứu [14]. Sa Khan có tên khoa học là Piper wallichii (Miq., đã được người dân Lào sử dụng như một dược liệu với một số công dụng như kích thích tiêu hóa, giảm đau, tăng trí nhớ, trị một số chứng bệnh như lỵ, lở loét dạ dày, giun, ký sinh trùng và [39],Trong Y học cổ truyền Trung Hoa, Piper wallichii có tác dụng ôn trung tán hàn, hạ khí, chỉ thống [10].

Gần đây, kết quả nghiên cứu sàng lọc của dược liệu cho thấy cao chiết của Piper wallichii có tác dụng ức chế AChE in vitro, in vivo rất tốt [36], [38]. Tuy nhiên, các hợp chất cụ thể trong Piper wallichii mang tác dụng sinh học vẫn chưa được xác định, vì vậy cần có những nghiên cứu kết hợp sàng lọc tác dụng ức chế AChE. Phương pháp phân lập các hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học đang là xu hướng chung của hóa thực vật trong giai đoạn hiện nay, phương pháp này giúp việc tìm kiếm và phát hiện các chất có tác dụng sinh học, tiết kiệm được đáng kể chi phí và thời gian thực hiện với xác suất thành công cao hơn so với phương pháp phân lập ngẫu nhiên được áp dụng phổ biến vài thập kỷ trước [30]. Xuất phát từ những lý do trên, khóa luận tốt nghiệp với tiêu đề “ Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây Sakhan thu hái tại Lào ” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1.

Chiết xuất, phân lập 1-2 hợp chất từ thân cây Sakhan theo định hướng tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro. Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các hợp chất phân lập được. Tổng quan về cây Sakhan 1. Tổng quan về thực vật học 1.

Vị trí phân loại Tên khoa học: Piper wallichii (Miq. Theo hệ thống phân loại, Sakhan có khóa phân loại như sau [13], [7], [35] : Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ Hồ tiêu (Piperales) Họ Hồ tiêu (Piperaceae) Chi Piper L. Loài Piper wallichii (Miq. Mô tả đặc điểm hình thái Sakhan là cây thân leo lâu năm, phần gốc mọc bò.

Thân cành mang hoa, thẳng đứng to và nhẵn, có thể cao từ 2 - 4 m. Lá Sakhan mọc so le, cuống lá dài từ 3 - 7cm. Phiến lá có hình dạng và kích thước khác nhau, đa số hình trứng thuôn, dài. Gốc hình tim hơi lệch, đầu lá nhọn, mặt trên và mặt dưới nhẵn.

Hoa đơn tính, mọc thành từng cụm. Cụm hoa đực dài khoảng 5-8 cm, cuống dài 0,5 - 0,8 cm, lá bắc tròn, có 4 nhị.