Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Lý Thị Thu Hoài có tiêu đề "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ba loài: Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri), Giổi đá (Magnolia insignis) và Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba) thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae) ở Việt Nam", được thực hiện tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Thị Phương Thảo và GS. Trần Văn Sung; chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số đào tạo 9 44 01 14, bảo vệ năm 2021.

Họ Ngọc lan (Magnoliaceae) cùng với họ Na (Annonaceae) là hai họ thực vật cổ xưa nhất trong ngành thực vật hạt kín có hoa (Angiospermae). Về mặt sinh thái và lâm học, các loài thuộc họ này giữ vị trí quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa, cung cấp gỗ xây dựng, chiết xuất tinh dầu, hương liệu và dược liệu điều trị bệnh trong y học cổ truyền. Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, có diện tích rừng mưa thường xanh và hệ sinh thái núi đá vôi rộng lớn, tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của khoảng 60 loài thuộc họ Ngọc lan, trong đó có 59 loài thuộc chi Mộc lan (Magnolia) và 1 loài duy nhất thuộc chi Giổi (Michelia). Mặc dù nguồn tài nguyên đa dạng, phần lớn các công trình nghiên cứu trong nước trước đây chỉ tập trung vào việc khảo sát hàm lượng và thành phần tinh dầu bay hơi. Các nghiên cứu hóa học chuyên sâu về việc phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên thứ cấp không bay hơi cũng như khảo sát hoạt tính sinh học của các loài thuộc hai chi này tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Từ thực trạng nghiên cứu thực tế, tác giả xác định ba khoảng trống nghiên cứu cụ thể:

  • Đối với loài Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri (Dandy) V.Kumar): Được xếp vào danh mục loài thiếu dữ liệu để đánh giá theo Sách Đỏ họ Magnoliaceae năm 2016; trước khi luận án triển khai, chỉ có một công trình nghiên cứu duy nhất của Phan Văn Kiệm và cộng sự công bố về một số chất phenyl glycoside, lignan, megastigman và khả năng kích thích tăng sinh tế bào xương.
  • Đối với loài Giổi đá (Magnolia insignis Wall.): Dù trên thế giới đã có một số công bố về lignan và sesquiterpenoid, tại Việt Nam loài này được xếp vào nhóm nguy cấp (EN) có nguy cơ tuyệt chủng, song chưa có bất kỳ công trình nào công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
  • Đối với loài Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba DC.): Dù là loài cây phổ biến trong dân gian và đô thị, các nghiên cứu trong nước chỉ dừng ở mức khảo sát tinh dầu hoa hoặc lá; chưa có tài liệu nào ở Việt Nam công bố việc tách chiết, tinh chế và làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất từ vỏ thân và rễ, cũng như sàng lọc độc tính tế bào ung thư của các cặn chiết này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được đánh số cụ thể gồm bốn nhiệm vụ:

  1. Chiết xuất, phân lập các chất từ loài Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri (Dandy) V.Kumar), loài Giổi đá (Magnolia insignis Wall.) và loài Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba DC.) trong hai chi Mộc lan và chi Giổi.
  2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch phân lập được.
  3. Nghiên cứu thành phần tinh dầu lá và cành của loài Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba).
  4. Đánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết và các chất sạch phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài bao gồm:

  • Đối tượng thực vật: Mẫu cành, lá loài Mỡ Phú Thọ; mẫu cành, lá loài Giổi đá; mẫu cành, lá, vỏ thân và rễ loài Ngọc lan hoa trắng.
  • Phạm vi không gian (địa bàn thu mẫu): Khu bảo tồn thiên nhiên Na Hang (huyện Na Hang, tỉnh Tuyên Quang) đối với loài Mỡ Phú Thọ; tỉnh Tuyên Quang đối với loài Giổi đá; khu vực Núi Luột thuộc Trường Đại học Lâm nghiệp (thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, Hà Nội) và thành phố Đồng Hới (tỉnh Quảng Bình) đối với loài Ngọc lan hoa trắng.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu Mỡ Phú Thọ và Giổi đá được thu hái vào tháng 7 năm 2017; mẫu Ngọc lan hoa trắng tại Hà Nội thu hái vào tháng 7 năm 2018; mẫu Ngọc lan hoa trắng tại Quảng Bình thu hái vào tháng 1 năm 2020. Luận án hoàn thành thực nghiệm và bảo vệ vào năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Hệ thống phân loại họ Ngọc lan đã trải qua nhiều giai đoạn chỉnh lý học thuật trên thế giới. Dandy tại Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Anh khởi xướng hệ thống phân chia phân họ Magnolioideae thành 4 chi chính (Magnolia, Manglietia, Michelia, Talauma) cùng 5 chi nhỏ (Aromadendron, Kmeria, Pachylarnax, Alcimandra, Elmerrillia), sau đó nâng lên thành 11 chi vào năm 1974. Năm 1984, Law Yu-Wu thực hiện các hiệu chỉnh bổ sung. Đến năm 1985, Hans P. Nooteboom tái sắp xếp lại còn 6 chi gồm Magnolia, Manglietia, Michelia, Elmerrillia, Kmeria và Pachylarnax. Từ đầu thập niên 1990, các dữ liệu phân tích trình tự DNA được áp dụng, đưa cơ sở dữ liệu quốc tế The Plant List công nhận họ Magnoliaceae gồm 4 chi chính thức: Magnolia, Michelia, Talauma và Dugandiodendron. Tại Việt Nam, hệ thống thực vật chí họ Ngọc lan được Gagnepain ghi nhận đầu tiên năm 1907 trong bộ thực vật chí Đông Dương của M. Lecomte với 15 loài thuộc 7 chi; Chevalier bổ sung năm 1918; Phạm Hoàng Hộ (1999) ghi nhận 8 chi và 50 loài; Nguyễn Tiến Bân (2003) thống kê 9 chi và 46 loài; Vũ Quang Nam (2011) xác nhận 55 loài thuộc 11 chi; và Từ Bảo Ngân cùng cộng sự (2015) bổ sung thêm 5 loài mới, nâng quy mô phân loại học lên 60 loài (59 loài chi Magnolia và 1 loài chi Michelia).

Về nghiên cứu tinh dầu chi Magnolia, Hyun Kyung Kim, Jin-Won Seo và Gil-Hah Kim (2020) khảo sát tinh dầu hoa Magnolia kobus có tác dụng chống muỗi Aedes albopictus, chỉ ra sự thay đổi hàm lượng cinnamyl alcohol và farnesene giữa hoa chớm nở và hoa nở rộ; Ji-Yu Nie và cộng sự phân tích tinh dầu nụ Magnolia biondii bằng mũi điện tử (E-nose) và GC-MS, ghi nhận β-pinene là thành phần chính. Tại Việt Nam, Đỗ Ngọc Đại và cộng sự (2016) công bố tinh dầu lá và vỏ cành Magnolia foveolata tại Hà Tĩnh chứa hàm lượng lớn β-caryophyllene; đồng thời khảo sát tinh dầu lá của 4 loài khác gồm Manglietia fordiana (chứa δ-cadinene), Manglietia conifera (chứa β-caryophyllene), Michelia mediocris (chứa (E)-nerolidol) và Michelia tonkinensis (chứa α-pinene). Chu Thị Thu Hà và Trần Huy Thái (2019) nghiên cứu tinh dầu lá và cành Magnolia hypolampra thu tại Na Hang (Tuyên Quang), ghi nhận thành phần chính là β-pinene.

Về thành phần hóa học không bay hơi của chi Magnolia, các công trình quốc tế đã phân lập được hơn 70 hợp chất terpenoid, hơn 54 alkaloid, hơn 100 lignan và neolignan, hơn 20 flavonoid cùng 25 dẫn xuất phenylpropanoid và phenylethanoid. Nhóm terpenoid đặc trưng bởi các sesquiterpene lactone khung germacranolide như costunolide, parthenolide; khung eudesmane như β-eudesmol; khung guaiane như watsonol A, B. Nhóm alkaloid chủ yếu thuộc khung aporphine và noraporphine như liriodenine, anonaine, roemerine, asimilobine, nornuciferine; khung benzylisoquinoline và bisbenzylisoquinoline như magnoflorine, magnocurarine, magnolamine. Nhóm lignan và neolignan điển hình gồm magnolol, honokiol, obovatol; gần đây Vũ Văn Tuấn (Van-Tuan Vu) và cộng sự (2020) phân lập các trimeric obovatol (houpulignan A–F) từ lá Magnolia officinalis var. biloba có hoạt tính ức chế sản sinh NO. Các nghiên cứu của Chutima Srinroch và cộng sự (2019) ghi nhận flavonol triglycoside mới (champaluangoside A–C) từ Magnolia utilis.

Về các loài nghiên cứu cụ thể:

  • Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri): Nghiên cứu của Phan Văn Kiệm và cộng sự phân lập được manglieside A, B, C, D, E, 3-methoxy magnolol và obovatol, chỉ ra manglieside B và E kích thích tăng trưởng dòng tế bào xương MC3T3-E1.
  • Giổi đá (Magnolia insignis): Các nghiên cứu trên thế giới ghi nhận hơn 20 chất gồm sesquiterpenoid (maninsigins C, D), alkaloid (magnocurarine), neolignan (manneoinsigins A, B, maninsigins A, B) và nhiều dẫn xuất lignan (scaphopetalone, balanophonin có hoạt tính độc tế bào HL-60, MCF-7, SMMC-7721). Tại Việt Nam, chưa có công trình nào về hóa học và hoạt tính sinh học của loài này.
  • Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba): Các nghiên cứu tinh dầu của Chunqing Shang (2002), Sanimah (2009), Putthita Punjee (2009), Huang Xiang-zhong (2009), En-Qin Xia (2010), DQ Qin (2018) đều khẳng định linalool chiếm tỷ lệ vượt trội; tại Việt Nam có nghiên cứu tinh dầu của Ngô Xuân Lương và Đậu Bá Thìn (2017) tại Bến En, Chu Thị Thu Hà và cộng sự (2018) tại Vĩnh Phúc. Về hóa thực vật, các nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc, Nhật Bản và Thái Lan đã phân lập được 58 hợp chất từ các bộ phận khác nhau, gồm các sesquiterpenoid, alkaloid aporphine (anonaine, liriodenine, ushinsunine) và benzenoid. Ở trong nước, chưa có nghiên cứu nào phân lập các chất thứ cấp tinh khiết từ loài này.

Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống: tiến hành phân lập, xác định cấu trúc hóa thực vật một cách có hệ thống cho cả 3 loài thực vật trên từ nguồn mẫu thu thập ở Việt Nam, đồng thời đánh giá hoạt tính kháng viêm (ức chế sản sinh NO) và độc tính tế bào ung thư in vitro của các cặn chiết và hoạt chất tinh khiết thu được.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên (Natural Products Chemistry), tập trung vào các con đường chuyển hóa thứ cấp sinh tổng hợp nên khung cấu trúc terpenoid (đặc biệt là sesquiterpene lactone), alkaloid (khung aporphine, benzylisoquinoline), phenolic, lignan, neolignan, flavonoid và các mạch glycoside tương ứng. Khung phân tích hoạt tính sinh học dựa trên mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính dược lý thực nghiệm (SAR) thông qua hai mô hình sàng lọc in vitro: hoạt tính ức chế sự sản sinh oxit nitric (NO) - một chất trung gian hóa học quan trọng trong phản ứng viêm sinh ra bởi tế bào đại thực bào RAW264.7 khi bị kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS); và hoạt tính gây độc tế bào ung thư (xác định nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng tế bào - giá trị IC50) trên 4 dòng tế bào ung thư người.

Phương pháp thực nghiệm được chuẩn hóa qua các công đoạn kỹ thuật:

  • Phương pháp chiết mẫu: Mẫu thực vật sau khi làm sạch, sấy khô và xay nhỏ được chiết ngâm tổng với dung môi methanol (MeOH), ethanol (EtOH) hoặc ethanol/nước (EtOH:H2O) có gia nhiệt hoặc ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không Buchi để thu cao chiết tổng. Cao tổng được phân tán vào nước rồi chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate (EtOAc) và n-butanol (BuOH). Phương pháp chiết lần lượt qua các dung môi cũng được áp dụng tương ứng cho từng mẻ mẫu. Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
  • Phương pháp phân lập và tinh chế:
    • Sắc ký bản mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn pha thường Silica gel 60 F254 của Merck (độ dày 0,2 mm). Thuốc thử hiện hình gồm đèn tử ngoại bước sóng λ = 254 nm và 365 nm; dung dịch phun hiện màu vanilin/axit sunfuric (1,2 g vanilin, 200 mL MeOH, 25 mL CH3COOH, 11 mL H2SO4) gia nhiệt; thuốc thử Dragendorff chuyên biệt phát hiện alkaloid.
    • Sắc ký bản mỏng điều chế (Prep-TLC): Thực hiện trên bản mỏng Silica gel 60 F254 để tách các dải chất tinh sạch.
    • Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ pha thường Silica gel cỡ hạt 197–400 mesh (0,040–0,063 mm) cho cột phân đoạn ban đầu; Silica gel nhanh cỡ hạt 70–200 mesh cho các bước tinh chế kế tiếp; chất hấp phụ pha đảo RP-18; sắc ký lọc gel rây phân tử Sephadex LH-20 của Merck và nhựa hấp phụ macroporous Diaion HP-20.
    • Kết tinh lại: Áp dụng phương pháp làm lạnh dung dịch bão hòa trong các hệ dung môi thích hợp để thu các chất sạch kết tinh dạng rắn.
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR): Đo dạng viên nén KBr trên máy IMPACT 410, Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức).
    • Năng suất quay cực ([α]D): Đo trên phân cực kế tự động Jasco P-2000 Polarimeter.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz (Đức) tại Viện Hóa học, ghi phổ 1D (1H-NMR ở 500 MHz, 13C-NMR ở 125 MHz, DEPT) và phổ 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) trong các dung môi CDCl3, DMSO-d6 hoặc CD3OD.
    • Phổ khối lượng: Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL và máy AMD 402 (Đức); phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS ghi trên máy FT-ICR-MS Varian (Hoa Kỳ).
    • Phân tích tinh dầu: Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên hệ thống Agilent Technologies HP 6890 N.
  • Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
    • Khảo sát hoạt tính ức chế sản sinh NO: Thực hiện trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 kích thích bằng LPS, định lượng hàm lượng nitrite tích tụ trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử Griess, sử dụng chất đối chứng dương L-NMMA (N-Methyl-L-arginine acetate).
    • Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Đo giá trị IC50 trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú).

Nguồn tư liệu thực vật và thông tin giám định mẫu được tổng hợp trong bảng sau:

Tên loài thực vật Tên khoa học Bộ phận thu mẫu Địa điểm thu mẫu Thời gian thu Người giám định Tiêu bản lưu giữ
Mỡ Phú Thọ Magnolia chevalieri (Dandy) V.Kumar Cành và lá Na Hang, Tuyên Quang 07/2017 PGS. Vũ Quang Nam, ThS. Trịnh Ngọc Bon TQ1701 (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật)
Giổi đá Magnolia insignis Wall. Cành và lá Tuyên Quang 07/2017 ThS. Trịnh Ngọc Bon TQ1703 (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật)
Ngọc lan hoa trắng (Mẫu 1) Michelia alba DC. Cành, lá, vỏ thân, rễ Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội 07/2018 TS. Nguyễn Quốc Bình NLT01 (Viện Hóa học)
Ngọc lan hoa trắng (Mẫu 2) Michelia alba DC. Cành và lá TP. Đồng Hới, Quảng Bình 01/2020 TS. Nguyễn Quốc Bình NLT02 (Viện Hóa học)

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu thiết lập bối cảnh tiến hóa cổ xưa của họ Ngọc lan, tiềm năng tài nguyên lâm sản và dược liệu của hai chi Magnolia và Michelia tại Việt Nam. Tác giả nêu rõ tính cấp thiết của đề tài khi nguồn nghiên cứu trong nước về các hoạt chất thứ cấp sạch của 3 loài Mỡ Phú Thọ, Giổi đá và Ngọc lan hoa trắng còn trống trải, từ đó xác lập 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể về chiết tách, xác định cấu trúc, phân tích tinh dầu và đánh giá hoạt tính sinh học.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

  • Lịch sử phân loại, đặc điểm hình thái và phân bố của họ Magnoliaceae, chi Magnolia và chi Michelia. Trình bày cấu trúc nhụy và nhị xếp xoắn ốc trên đế hoa hình nón - dấu hiệu giải phẫu nguyên thủy của thực vật hạt kín; tổng hợp dữ liệu bảo tồn với 46,82% số loài thuộc họ Ngọc lan bị đe dọa ở cấp độ CR, EN, VU trên quy mô toàn cầu.
  • Thống kê các công trình phân lập hợp chất tự nhiên từ chi Magnolia: chi tiết hóa cấu trúc hóa học của các lớp monoterpenoid, sesquiterpenoid (các khung germacranolide, eudesmane, guaiane, oppositane, oplopane), alkaloid (isoquinoline, aporphine, noraporphine, benzylisoquinoline, bisbenzylisoquinoline, aristolactam), lignan, neolignan (khung diaryl-dimethylcyclobutane, 2,6-bisaryl-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octane, hybrid neolignan, trimeric obovatol), flavonoid, phenylpropanoid và phenylethanoid.
  • Tổng kết các dữ liệu về hoạt tính chống ung thư (hoạt tính gây độc của liriodenine, magnolol, honokiol trên tế bào HepG2, KB, A-549, CAOV-3), hoạt tính kháng khuẩn (của sabinene, terpinen-4-ol, magnolol, honokiol chống S. aureus, E. coli, B. cereus), hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa.
  • Phân tích chi tiết hiện trạng nghiên cứu của 3 đối tượng nghiên cứu: chỉ rõ Mỡ Phú Thọ mới có một công trình của Phan Văn Kiệm; Giổi đá chưa từng được khảo sát hóa sinh tại Việt Nam; Ngọc lan hoa trắng đã có nghiên cứu tinh dầu nhưng chưa được phân lập các chất không bay hơi từ vỏ thân và rễ ở trong nước.

Chương 2: Đối tượng, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các thông số kỹ thuật thu thập mẫu, chiết xuất và phân lập:

  • Quy trình phân lập từ loài Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri): Từ cặn chiết EtOAc của lá cây, tác giả tiến hành sắc ký cột silica gel chia thành các phân đoạn MC1 đến MC20. Tiếp tục tách phân đoạn MC2.4, MC2.9 và MC2.18 bằng các hệ dung môi gradient phân cực kết hợp sắc ký cột Sephadex LH-20 và RP-18 để thu nhận 9 hợp chất ký hiệu từ MPT1 đến MPT9.
  • Quy trình phân lập từ loài Giổi đá (Magnolia insignis): Cặn chiết MeOH từ lá cây được phân tách qua hệ thống sắc ký cột silica gel pha thường và rây phân tử Sephadex LH-20 với các hệ dung môi rửa giải n-hexane/EtOAc và CH2Cl2/MeOH, thu nhận 6 hợp chất ký hiệu từ GĐ1 đến GĐ6.
  • Quy trình phân lập từ loài Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba): Bột vỏ thân và rễ khô chiết ngâm tổng, phân bố lỏng - lỏng thành ba cặn chiết: cặn n-hexane, cặn EtOAc và cặn BuOH. Sắc ký cột phân tách cặn n-hexane, EtOAc và BuOH kết hợp sắc ký bản mỏng điều chế và kết tinh phân đoạn đã phân lập thành công 11 hợp chất ký hiệu từ NLT1 đến NLT11.
  • Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước và điều kiện chạy GC-MS phân tích tinh dầu cành, lá loài Ngọc lan hoa trắng thu tại Quảng Bình.
  • Quy trình chuẩn bị hóa chất, nuôi cấy tế bào, thiết lập nồng độ thử nghiệm và cách thức tính toán giá trị IC50 trong thử nghiệm ức chế NO trên tế bào đại thực bào RAW264.7 và thử nghiệm gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người (KB, HepG2, Lu-1, MCF-7).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các luận điểm khoa học, phân tích cấu trúc phổ và số liệu hoạt tính sinh học:

  • Cấu trúc các hợp chất từ Mỡ Phú Thọ: Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của 9 hợp chất (MPT1–MPT9) dựa vào các tín hiệu phổ NMR (độ dịch chuyển hóa học δ, hằng số tương tác J), phổ DEPT xác định bậc cacbon, phổ tương quan dị hạt nhân HMBC, tương quan đồng hạt nhân 1H-1H COSY và tương tác không gian NOESY. Trong đó xác nhận sự hiện diện của sesquiterpenoid MPT3 (caryolane-1,9β-diol), MPT4 (caryophyllenol-II) và neolignan MPT7 (obovatol).
  • Cấu trúc các hợp chất từ Giổi đá: Làm sáng tỏ cấu trúc 6 hợp chất (GĐ1–GĐ6), bao gồm sesquiterpene lactone GĐ1 (budlein B), dẫn xuất lignan glycoside GĐ2 (pinoresinol monomethyl ether-β-D-glucoside), flavonoid GĐ3 ((+)-afzelechin), cùng các chất GĐ4, GĐ5, GĐ6 qua so sánh dữ liệu phổ đo được với tài liệu tham khảo chuẩn.
  • Cấu trúc các hợp chất từ vỏ thân và rễ Ngọc lan hoa trắng: Xác định cấu trúc 11 hợp chất (NLT1–NLT11), ghi nhận nhóm sesquiterpene lactone và sesquiterpenoid chiếm ưu thế: NLT1 (costunolide), NLT2 ((-)-α-cadinol), NLT3 (11α,13-dihydro-β-cyclocostunolide), NLT4 (11α,13-dihydroparthenolide), NLT5 (parthenolide), NLT6 ((-)-bisparthenolidine), NLT7 (9-hydroxy-dihydroparthenolide), NLT8 (magnograndiolide), NLT10. Ngoài ra còn có 1 alkaloid aporphine NLT9 (liriodenine) và 1 phenylethanoid glycoside NLT11 (lawsoniaside B). Phân tích chi tiết các tương tác phổ 2D-NMR khẳng định cấu hình không gian của khung parthenolide và bisparthenolidine.
  • Thành phần tinh dầu lá và cành loài Ngọc lan hoa trắng (Quảng Bình): Kết quả GC-MS cho thấy linalool là thành phần chiếm tỷ lệ vượt trội nhất ở cả hai bộ phận lá và cành, phù hợp với đặc trưng hóa học tinh dầu của chi Michelia.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học:
    • Hoạt tính ức chế sản sinh NO: Các hợp chất phân lập từ Mỡ Phú Thọ được đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro trên tế bào RAW264.7; nhiều chất thể hiện khả năng ức chế rõ rệt sự tạo thành NO cảm ứng bởi LPS, đối chiếu với chất chuẩn L-NMMA.
    • Hoạt tính gây độc tế bào: Khảo sát độc tính của các cặn chiết và các hợp chất tinh khiết NLT1–NLT11 trên 4 dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu-1, MCF-7; xác định các giá trị IC50 thực nghiệm, cho thấy nhóm sesquiterpene lactone (như costunolide, parthenolide) và alkaloid liriodenine thể hiện độc tính tế bào chọn lọc đối với các dòng tế bào ung thư khảo sát.

Kết quả và những đóng góp mới

Các kết quả khoa học và đóng góp mới của luận án được tác giả tổng hợp cụ thể:

  • Về mặt hóa học:
    • Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 26 hợp chất tinh khiết từ ba loài thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae) tại Việt Nam, bao gồm 9 hợp chất từ lá Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri), 6 hợp chất từ lá Giổi đá (Magnolia insignis) và 11 hợp chất từ vỏ thân và rễ Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba).
    • Đây là công trình đầu tiên công bố kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hóa học từ loài Giổi đá (Magnolia insignis) thu hái tại Việt Nam.
    • Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiến hành phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất từ bộ phận vỏ thân và rễ của loài Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba).
    • Luận án đã khảo sát thành phần hóa học tinh dầu của lá và cành loài Ngọc lan hoa trắng thu hái tại thành phố Đồng Hới, tỉnh Quảng Bình, định danh các thành phần chính và xác định hàm lượng linalool chiếm tỷ lệ ưu thế.
  • Về mặt hoạt tính sinh học:
    • Đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng viêm (ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7) của các hợp chất phân lập từ loài Mỡ Phú Thọ, bước đầu cung cấp dẫn liệu khoa học giải thích kinh nghiệm sử dụng loài cây này trong y học cổ truyền.
    • Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các cặn chiết và các hợp chất sạch phân lập từ vỏ thân và rễ loài Ngọc lan hoa trắng trên 4 dòng tế bào ung thư người (KB, HepG2, Lu-1, MCF-7), xác định các hợp chất có hoạt tính độc tế bào đáng chú ý thuộc nhóm sesquiterpene lactone và alkaloid.
  • Về kiến nghị nghiên cứu:
    • Tác giả đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học ở các bộ phận khác chưa được khảo sát của loài Mỡ Phú Thọ và Giổi đá (vỏ thân, rễ, hoa).
    • Kiến nghị mở rộng thử nghiệm các hoạt tính sinh học tiềm năng khác và nghiên cứu sâu cơ chế phân tử tác động lên tế bào khối u của các hợp chất sesquiterpene lactone và alkaloid có hoạt tính cao.
    • Kiến nghị đẩy mạnh công tác bảo tồn nguồn gen và khai thác bền vững các loài thuộc họ Ngọc lan, đặc biệt là loài Giổi đá đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng tại Việt Nam.

Danh mục 26 hợp chất phân lập được từ ba loài trong luận án được tổng hợp như sau:

STT Ký hiệu trong luận án Tên hợp chất / Nhóm cấu trúc Loài thực vật Bộ phận phân lập
1 MPT1 Hợp chất sạch MPT1 Magnolia chevalieri Lá
2 MPT2 Hợp chất sạch MPT2 Magnolia chevalieri Lá
3 MPT3 Caryolane-1,9β-diol Magnolia chevalieri Lá
4 MPT4 Caryophyllenol-II Magnolia chevalieri Lá
5 MPT5 Hợp chất sạch MPT5 Magnolia chevalieri Lá
6 MPT6 Hợp chất sạch MPT6 Magnolia chevalieri Lá
7 MPT7 Obovatol Magnolia chevalieri Lá
8 MPT8 Dẫn xuất phenolic/neolignan MPT8 Magnolia chevalieri Lá
9 MPT9 Dẫn xuất phenolic/neolignan MPT9 Magnolia chevalieri Lá
10 GĐ1 Budlein B (Sesquiterpene lactone) Magnolia insignis Lá
11 GĐ2 Pinoresinol monomethyl ether-β-D-glucoside Magnolia insignis Lá
12 GĐ3 (+)-Afzelechin (Flavan-3-ol/Flavonoid) Magnolia insignis Lá
13 GĐ4 Hợp chất sạch GĐ4 Magnolia insignis Lá
14 GĐ5 Hợp chất sạch GĐ5 Magnolia insignis Lá
15 GĐ6 Hợp chất sạch GĐ6 Magnolia insignis Lá
16 NLT1 Costunolide (Germacranolide) Michelia alba Vỏ thân và rễ
17 NLT2 (-)-α-Cadinol (Sesquiterpenoid) Michelia alba Vỏ thân và rễ
18 NLT3 11α,13-Dihydro-β-cyclocostunolide Michelia alba Vỏ thân và rễ
19 NLT4 11α,13-Dihydroparthenolide Michelia alba Vỏ thân và rễ
20 NLT5 Parthenolide (Germacranolide) Michelia alba Vỏ thân và rễ
21 NLT6 (-)-Bisparthenolidine (Dimer lactone) Michelia alba Vỏ thân và rễ
22 NLT7 9-Hydroxy-dihydroparthenolide Michelia alba Vỏ thân và rễ
23 NLT8 Magnograndiolide (Guaianolide) Michelia alba Vỏ thân và rễ
24 NLT9 Liriodenine (Oxoaporphine alkaloid) Michelia alba Vỏ thân và rễ
25 NLT10 Dẫn xuất sesquiterpene lactone NLT10 Michelia alba Vỏ thân và rễ
26 NLT11 Lawsoniaside B (Phenylethanoid glycoside) Michelia alba Vỏ thân và rễ

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án cho thấy một số hạn chế gắn liền với phạm vi và điều kiện thực nghiệm:

  • Hạn chế về bộ phận thu mẫu: Đối với hai loài Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri) và Giổi đá (Magnolia insignis), các hợp chất mới chỉ được phân lập từ bộ phận lá và cành; các bộ phận khác như vỏ thân, rễ và hoa chưa được thu thập và khảo sát do địa hình thu mẫu hiểm trở và tính chất bảo tồn nghiêm ngặt của loài cây rừng quý hiếm.
  • Hạn chế về mô hình sinh học: Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới chỉ dừng lại ở quy mô sàng lọc in vitro ban đầu (đánh giá khả năng ức chế NO trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 và đo giá trị IC50 gây độc trên 4 dòng tế bào ung thư người). Luận án chưa có điều kiện triển khai thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm cũng như chưa khảo sát sâu cơ chế tác động ở mức độ tín hiệu phân tử và biểu hiện gen.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả vạch ra gồm:

  • Tiếp tục khảo sát đầy đủ thành phần hóa học của các bộ phận còn lại của ba loài nghiên cứu khi có điều kiện thu thập mẫu bổ sung.
  • Nghiên cứu cơ chế tác dụng dược lý chi tiết của các hợp chất sạch có hoạt tính sinh học nổi bật (như các dẫn xuất parthenolide, costunolide, liriodenine và obovatol).
  • Triển khai nghiên cứu mở rộng sang các hoạt tính sinh học khác như bảo vệ tế bào thần kinh, chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn phục vụ cho các nhóm đối tượng nghiên cứu và đào tạo:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà khoa học chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về việc chiết tách phân đoạn, lựa chọn dung môi phân cực, kỹ thuật sắc ký cột kết hợp giữa Silica gel thường, RP-18, rây phân tử Sephadex LH-20 và nhựa Diaion HP-20 để phân lập các hợp chất khó tách. Đồng thời, Chương 3 là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp phân tích, quy kết tín hiệu phổ 1D và 2D-NMR (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) đối với các khung cấu trúc phức tạp như germacranolide, guaianolide, bisparthenolidine, neolignan và alkaloid aporphine.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu ngành Dược học, Thực vật học: Dữ liệu của luận án cung cấp các bằng chứng hóa phân loại (chemotaxonomy) quan trọng giúp xác lập mối quan hệ phát sinh giữa chi Magnolia và chi Michelia. Kết quả sàng lọc ức chế NO và độc tính tế bào ung thư in vitro là cơ sở dữ liệu hữu ích cho việc định hướng sàng lọc, phát triển các hoạt chất tự nhiên kháng viêm và kháng ung thư từ nguồn thực vật bản địa.
  • Cán bộ lâm nghiệp và các nhà quản lý bảo tồn thiên nhiên: Luận án cung cấp các dẫn liệu thành phần hóa học của loài Giổi đá (Magnolia insignis) - một loài nằm trong danh mục 12 loài Magnolia có nguy cơ tuyệt chủng tại Việt Nam, và Mỡ Phú Thọ - loài thiếu dữ liệu đánh giá trong Sách Đỏ, đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học phục vụ chiến lược bảo tồn nguồn gen thực vật nguy cấp.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu những loài thực vật nào, mẫu được thu thập ở đâu và ai là người giám định tên khoa học?
Luận án nghiên cứu ba loài thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae): Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri), Giổi đá (Magnolia insignis) và Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba). Mẫu lá và cành Mỡ Phú Thọ thu tại Na Hang (Tuyên Quang) tháng 7/2017, được giám định bởi PGS. Vũ Quang Nam và ThS. Trịnh Ngọc Bon (tiêu bản TQ1701). Mẫu lá và cành Giổi đá thu tại Tuyên Quang tháng 7/2017, được giám định bởi ThS. Trịnh Ngọc Bon (tiêu bản TQ1703). Mẫu Ngọc lan hoa trắng gồm hai đợt: đợt 1 (cành, lá, thân, rễ) thu tại Núi Luột, Xuân Mai, Hà Nội tháng 7/2018 (tiêu bản NLT01); đợt 2 (lá, cành) thu tại TP. Đồng Hới, Quảng Bình tháng 1/2020 (tiêu bản NLT02), đều do TS. Nguyễn Quốc Bình giám định.

2. Tổng số hợp chất sạch mà tác giả phân lập và xác định cấu trúc từ ba loài là bao nhiêu?
Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của tổng cộng 26 hợp chất tinh khiết, phân bố cụ thể: 9 hợp chất từ lá Mỡ Phú Thọ (MPT1–MPT9), 6 hợp chất từ lá Giổi đá (GĐ1–GĐ6), và 11 hợp chất từ vỏ thân và rễ Ngọc lan hoa trắng (NLT1–NLT11).

3. Nhóm hợp chất hóa học chủ yếu được phân lập từ vỏ thân và rễ loài Ngọc lan hoa trắng là gì?
Từ vỏ thân và rễ loài Ngọc lan hoa trắng, nhóm hợp chất chiếm số lượng lớn nhất là sesquiterpene lactone và sesquiterpenoid (9/11 chất), bao gồm costunolide (NLT1), (-)-α-cadinol (NLT2), 11α,13-dihydro-β-cyclocostunolide (NLT3), 11α,13-dihydroparthenolide (NLT4), parthenolide (NLT5), dimer (-)-bisparthenolidine (NLT6), 9-hydroxy-dihydroparthenolide (NLT7), magnograndiolide (NLT8) và NLT10. Ngoài ra còn có 1 alkaloid aporphine là liriodenine (NLT9) và 1 phenylethanoid glycoside là lawsoniaside B (NLT11).

4. Những phương pháp phân tích phổ nào được tác giả sử dụng để làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất?
Tác giả kết hợp đồng bộ các phương pháp hóa lý và phổ nghiệm: phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR dạng viên nén KBr trên máy IMPACT 410), phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy Bruker Avance 500 MHz gồm phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối lượng ESI-MS (Agilent LC-MSD-Trap SL, AMD 402), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (FT-ICR-MS Varian), năng suất quay cực đo trên máy Jasco P-2000, và sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Agilent HP 6890 N).

5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được đánh giá qua những mô hình thử nghiệm nào?
Luận án thực hiện hai phép thử sinh học in vitro: (1) Đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua đo khả năng ức chế sản sinh oxit nitric (NO) cảm ứng bởi LPS trên dòng tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 bằng phản ứng Griess (chất chuẩn đối chứng dương L-NMMA); (2) Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro (xác định nồng độ ức chế IC50) trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lý Thị Thu Hoài là công trình nghiên cứu thực nghiệm hóa hữu cơ có hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri), Giổi đá (Magnolia insignis) và Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba) thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae) tại Việt Nam. Bằng việc kết hợp các kỹ thuật chiết tách, sắc ký cột phân đoạn và các phương pháp phổ nghiệm hiện đại (FT-IR, 1D/2D-NMR, HR-ESI-MS, GC-MS), luận án đã phân lập, làm sáng tỏ cấu trúc 26 hợp chất tinh khiết và phân tích thành phần tinh dầu lá, cành. Các kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã xác nhận hoạt tính ức chế sản sinh NO của các hợp chất từ Mỡ Phú Thọ và hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu-1, MCF-7 của các cặn chiết và hợp chất từ Ngọc lan hoa trắng. Công trình là tài liệu khoa học hữu ích, bổ sung dữ liệu hóa thực vật học và hóa phân loại quan trọng cho hệ thực vật họ Ngọc lan ở Việt Nam.