ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NOI BAO CAO TONG KET KET QUA THUC HIEN DE TAI KH&CN CAP ĐẠI HỌC QUOC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa hoc và hoạt tính kháng viêm của hai loài Piper sarmentosum Roxb. và Piper longum L. thuộc chỉ Hồ tiêu Piper Mã số đề tài: QG.05 Chủ nhiệm đề tài: PGS. Lê Thị Huyền Hà Nội, 2024 PHAN I.
THONG TIN CHUNG 1. Tên đề tài: Nghiên cứu thành phan hóa học và hoạt tính kháng viêm của hai loài Piper sarmentosum Roxb. va Piper longum L. thuộc chi Hồ tiêu Piper.
Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài TT |Chức danh, học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài 1 |PGS. Lê Thị Huyền Khoa Hóa học Chủ trì 2 |TS. Nguyễn Thị Sơn Khoa Hóa học Thành viên chính 3_ JTS. Trần Thanh Hà Viện được liệu, Bộ Y tế Thành viên chính 4 [ThS.
Lương Thi Mỹ Hạnh Khoa Hóa học Thành viên 5 |HVCH. Nguyễn Thị Thu Hậu Khoa Hóa học Thành viên 1. Đơn vị chủ trì: 1. Thời gian thực hiện: 1.
Theo hợp đồng: từ tháng 5 năm 2022 đến tháng 5 năm 2024 1. Gia hạn (nếu có): đến tháng. Thực hiện thực tế: từ tháng 5 năm 2022 đến tháng 5 năm 2024 1. Những thay đối so với thuyết minh ban đầu (nếu có): không (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Y kiên của Cơ quan quản lý) 1.
Tống kinh phí được phê duyệt của đề tài: 280 triệu đồng. TONG QUAN KET QUÁ NGHIÊN CUU 1. Dat van dé Viêm là một chuỗi các hiện tượng do nhiều tác nhân như nhiễm trùng, các phản ứng miễn dịch, tôn thương do nhiệt hoặc vật lý gây ra. Các dấu hiệu lâm sàng đặc trưng: sưng, nóng, đỏ, đau.
Phương pháp điều trị hiện nay thường liên quan đến thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs). Các chất kháng viêm hầu hết hoạt động dựa trên cơ chế kìm hãm hoạt động của các enzyme xúc tác cho quá trình tạo các chất gây viêm như cyclooxygenase (COX) làm giảm tổng hợp PGE? và Fi. là chất trung gian hóa học của phản ứng gây viêm, hoặc làm bền màng lisosom (thể tiêu bào) ngăn cản giải phóng các enzyme phân giải nên ức chế quá trình viêm, hoặc ức chế vận chuyên bạch cầu. Tuy nhiên, mỗi NSAID là một chất hóa học khác nhau, và mỗi người lại có đáp ứng khác nhau với thuốc.
Có những người bệnh đáp ứng bat cứ một thuốc NSAID nào, nhưng lại có những người có thé không đáp ứng với một thuốc này nhưng lại đáp ứng với một thuốc khác. Sự khác nhau giữa các thuốc NSAID chủ yếu là tỷ lệ và các biểu hiện của tác dụng không mong muốn. Các tác dụng phụ của NSAID có thể từ nhẹ như kích ứng dạ dày đến nghiêm trọng bao gồm cả viêm loét, chảy máu và thủng dạ dày và ruột. Trái ngược với các thuốc điều trị viêm theo con đường tổng hợp, các dược phâm có nguồn gốc thiên nhiên dùng trong phác đồ điều trị viêm lại không xuất hiện các tác dụng phụ cho người bệnh.
Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Piper được thực hiện trên thế giới, tuy nhiên, số lượng những nghiên cứu về chỉ này ở Việt Nam còn khá hạn chế. Các nghiên cứu trong nước chủ yếu tập trung vào nghiên cứu thành phan tinh dầu của 3 loài thuộc chi Piper gồm: P. Tiêu lót, là lốt không chỉ là những gia vị đáng chú ý trong 4m thực văn hóa Việt ma còn được biết đến như một vị thuốc có giá trị trong kho tàng y dược học cổ truyền Việt Nam. Từ xa xưa, tiêu lốt được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dung ôn trung, tán hàn, hạ khí, chỉ thống nhờ tính cay, vị nóng.
Do vậy, tiêu lốt có hiệu quả trong các bài thuốc cô truyền dé điều trị các bệnh về đường hô hấp (như viêm xoang), các bệnh về tiêu hóa (như đau bụng, tiêu chảy, kiết ly, khó tiêu, đầy bụng, trướng bụng). Ngoài ra, khi sử dụng phối hợp tiêu lốt và các cây thuốc khác đã mang đến các bài thuốc quý khác có tác dụng giảm đau răng, đau thắt vùng ngực, kháng khuẩn, bảo vệ gan, ngăn ngừa ung thư gan, điều hòa kinh nguyệt ở phụ nữ. Theo các nghiên cứu khoa học, loài tiêu lốt và lá lốt sở hữu da dạng các thành phan hóa học như tinh dau, alkaloid, flavonoid, lignan [1, 2]. Bên cạnh đó, khi nghiên cứu các dịch chiết methanol và ethanol của loài tiêu lốt, lá lốt đều cho thấy các hoạt tính sinh học đặc trưng như kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, chống tiểu đường [2, 3|.
Sự đa dạng về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài tiêu lốt và lá lốt chính là một điểm đáng chú ý về mặt thực tiễn của nghiên cứu này. Như vậy, Ở Việt Nam mới chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài như P. longum mới có các nghiên cứu về thành phan tinh dau. Cả ba loài trên đều chưa duoc đánh giá và nghiên cứu về hoạt tính sinh học.
Vì vậy, việc điều tra, nghiên cứu và đánh giá về thành phần hóa học cũng như hoạt tính kháng viêm của 2 loài Piper sarmentosum Roxb. va Piper longum L. sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phan phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở Việt Nam 2.
Mục tiêu - Thu nhận được các dịch chiết của hai loài Lá lốt Piper sarmenfosum Roxb. và Tiêu lốt Piper longum L. thuộc chi Hồ tiêu Piper theo độ phân cực tăng dan của các dung môi hữu cơ. - Phân lập được các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong các dịch chiết thu được.
- Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của các dịch chiết và các hợp chat phân lập được. Phương pháp nghiên cứu 3. Phương pháp chiết xuất Phần trên mặt đất loài tiêu lốt và lá lốt sau khi sấy khô, nghiền thành bột mịn, sau đó chiết với methanol bằng thiết bị siêu âm. Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol.
Cặn chiết này được hòa tan vao nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane, CH2Clo, EtOAc thu được cặn các cặn n-hexane, CH2Ch, EtOAc và lớp nước sau khi cất thu hồi dung môi đưới áp suất giảm. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất Sau khi đã điều chế các cặn chiết n-hexane, CH2Ch, EtOAc và cặn nước. Sử dụng kết hợp nhiều phương pháp sắc ký hiện dai: TLC, CC, HPLC điều chế,. dé phân lập các hợp chất có trong các cặn chiết 3.
Phương pháp xác định cấu trúc các chất Xác định cấu trúc chất phân lập thông qua việc phân tích các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H-NMR và '3C-NMR), và 2 chiều HSQC, HMBC, COSY, phổ lưỡng sắc tròn CD, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, và so sánh với dir liệu trong các tai liệu tham khảo. Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 Tế bao RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 10° tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37°C và 5% CO> trong 24h. Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h. Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bang LPS (1ug/mL) trong 24h.
Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dung là N°-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0. Cu thé là, 100 uL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyên sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 HL Griess reagent: 50 HU of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid va 50 uL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước. Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được do bằng máy microplate reader ở bước song 540 nm.
Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank). Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO> và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). Kha năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức : % ức chế =100%- [hàm lượng NOsampie/ham lượng NO¡ps]*100 Phép thử được lặp lại 3 lần dé đảm bảo tính chính xác. Giá trị ICso (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 Tổng kết kết quả nghiên cứu Với mục tiêu cụ thé là nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ hai loài lá lốt và tiêu lốt trồng tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu đã thu được một số kết quả như sau: - Đã xây dựng quy trình điều chế các cặn chiết methanol, n-hexane, CHzCl;, EtOAc có thé áp dụng thực tế tử hai loài tiêu lốt và lá lốt ở Việt Nam.
- Da xây dựng quy trình phân lập 14 hợp chất có thé áp dụng thực tế từ hai loài nghiên cứu. Khối lượng các chất phân lập được từ 5-75 mg. Các hợp chất hóa học phân lập được đạt độ tinh khiết > 90%. Trong 14 hợp chất này, 7 hợp chất phân lập từ loài tiêu lốt bao gồm piperlongoside A (PLI), piperlongoside B (PL2), piperlongoside C (PL3), (-)-isolariciresinol 2-Ó-Ø-D-glucopyranoside (PL4), (+)- isolariciresinol 3a-O-$-D-glucopyranoside (PL5), (-)-isolariciresinol 3a-Ó-Ø-D- glucopyranoside (PL6), (+)-lyoniresinol 3a-O-$-D-glucopyranoside (PL7), trong đó 3 hợp chat PL1, PL2, PL3 là các hợp chat mới.
Bay hợp chat phan lập được từ loài lá lốt bao gồm violanthin (PS1), isoorientin (PS2), isovitexin (PS3), vitexin (PS4), corchoionoside (PS5), syringaresocinol-4-O-$-D-glucopyranoside (PS6), syringaresocinol (PS7). - Đã đánh giá hoạt tinh kháng viêm thông qua sự ức chế sản sinh NO trong dai thực bao RAW 264.7 của 14 hợp chất phân lập được. Kết qua cho thay: đối với loài tiêu lốt bốn hợp chất PL3 - PL7 thể hiện hoạt tính ức chế NO tốt với các giá trị ICso thu được lần lượt là 33.35 uM, tương đương với chất đối chứng dương NS-monomethyl-L-arginine acetate (L-NMMA) với giá trị ICso 32.70, hợp chất PL2 thé hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị ICso 64.18 uM, trong khi hợp chất PL1 chưa thé hiện hoạt tính ức chế trong điều kiện thử nghiệm.