Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Của Cây Bồ Đề Trung Bộ (Styrax Annamensis Guill.)

Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây bồ đề trung bộ Styrax annamensis g, khám phá tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghiệp.

• Tác giả: Trần Đăng Anh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thanh Trà
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Của Cây Bồ Đề Trung Bộ (Styrax Annamensis Guill.)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI BỒ ĐỀ STYRAX (STYRACACEAE)
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Xử lý và ngâm chiết mẫu thực vật
• 2.3.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên
• 2.3.3. Phương pháp phân lập các hợp chất tự nhiên
• 2.3.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ các mẫu thực vật nghiên cứu
• 2.3.5. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro MTT assay
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC LÁ CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ (STYRAX ANNAMENSIS GUILL.)
• 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO LÁ CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Cây Bồ Đề Trung Bộ Styrax Annamensis

Nghiên cứu về cây Bồ Đề Trung Bộ (Styrax annamensis) mở ra hướng đi mới trong việc khám phá nguồn dược liệu Việt Nam. Từ xa xưa, con người đã sử dụng các hợp chất từ tự nhiên để chữa bệnh. Ngày nay, khi y học hiện đại phát triển, việc nghiên cứu sâu về thành phần hóa học của các loài thực vật, đặc biệt là dược liệu, càng trở nên quan trọng. Cây Bồ Đề Trung Bộ là một trong số đó, hứa hẹn mang lại nhiều giá trị trong lĩnh vực dược học cổ truyền và y học hiện đại. Các nghiên cứu về hợp chất tự nhiên từ thực vật có ưu điểm là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể, thân thiện với môi trường. Theo WHO, khoảng 80% dân số thế giới vẫn tin dùng các thuốc có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu từ thực vật. Việc nghiên cứu cây Bồ Đề Trung Bộ có ý nghĩa khoa học và đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

1.1. Giới Thiệu Chi Bồ Đề Styrax và Phân Bố Địa Lý

Chi Bồ Đề (Styrax) thuộc họ Bồ Đề (Styracaceae), bao gồm khoảng 130 loài cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ. Chúng phân bố rộng rãi ở các vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới, đặc biệt là ở Đông Nam Á, Châu Âu và Châu Mỹ. Tại Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, chi Bồ Đề có 12 loài. Các loài cây này có chiều cao từ 2-14m, lá hình trứng mọc luân phiên, hoa rủ xuống với 5-10 tràng hoa hình thùy màu trắng. Quả là loại quả hạch khô và thuôn dài. Các tên gọi phổ biến là bồ đề, an tức hương, chuông tuyết và cánh kiến trắng.

1.2. Tình Hình Nghiên Cứu Chi Styrax Trên Thế Giới

Các nghiên cứu về hóa thực vật của chi Bồ Đề (Styrax) đã được thực hiện từ năm 1915. Đến nay, hơn 130 hợp chất đã được phát hiện, chủ yếu là các lignan, benzofuran, triterpenoid và saponin. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học thú vị. Nhựa cây Styrax tonkinense được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian để điều trị các bệnh như viêm thanh quản, viêm phế quản, rối loạn đường hô hấp trên, loét, mụn cơm và dị ứng da. Nó cũng được sử dụng làm chất cố định hương trong nước hoa và hương liệu trong mỹ phẩm.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Styrax

Mặc dù chi Bồ Đề (Styrax) đã được nghiên cứu từ lâu, nhưng việc xác định chính xác thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của từng loài vẫn còn nhiều thách thức. Sự đa dạng về loài và điều kiện sinh thái dẫn đến sự khác biệt về thành phần hóa học giữa các cá thể. Việc phân lập hợp chất và định danh hợp chất đòi hỏi kỹ thuật hiện đại và tốn kém. Hơn nữa, việc đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất cần được thực hiện trên nhiều mô hình khác nhau để có kết quả chính xác. Các nghiên cứu về cây Bồ Đề Trung Bộ ở Việt Nam và trên thế giới còn rất hạn chế, đòi hỏi sự đầu tư và nỗ lực hơn nữa.

2.1. Khó Khăn Trong Phân Lập và Định Danh Hợp Chất

Việc phân lập hợp chất từ chiết xuất thực vật là một quá trình phức tạp, đòi hỏi sự kết hợp của nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký, khối phổ, NMR, IR, UV-Vis. Mỗi kỹ thuật có những ưu điểm và hạn chế riêng, và việc lựa chọn kỹ thuật phù hợp phụ thuộc vào tính chất của hợp chất cần phân lập. Định danh hợp chất cũng là một thách thức, đặc biệt đối với các hợp chất mới chưa được biết đến. Cần phải sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất.

2.2. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học In Vitro và In Vivo

Việc đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất cần được thực hiện trên cả mô hình in vitro (trong ống nghiệm) và in vivo (trên cơ thể sống). Mô hình in vitro cho phép đánh giá nhanh chóng hoạt tính của hợp chất trên các tế bào hoặc enzyme. Tuy nhiên, kết quả in vitro không phải lúc nào cũng phản ánh chính xác hoạt tính của hợp chất trong cơ thể sống. Mô hình in vivo cho phép đánh giá hoạt tính của hợp chất trong môi trường phức tạp của cơ thể sống, nhưng đòi hỏi thời gian và chi phí lớn hơn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Bồ Đề

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bồ Đề Trung Bộ (Styrax annamensis) đòi hỏi một quy trình bài bản, từ khâu thu thập mẫu, chiết xuất, phân lập, định danh hợp chất, đến đánh giá hoạt tính sinh học. Các phương pháp phân tích hóa học hiện đại như sắc ký, khối phổ, NMR đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. Việc đánh giá hoạt tính sinh học được thực hiện thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo để xác định tiềm năng dược lý của cây Bồ Đề Trung Bộ.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất và Phân Lập Hợp Chất Tự Nhiên

Quy trình chiết xuất thường bắt đầu bằng việc sử dụng các dung môi khác nhau để hòa tan các hợp chất có trong mẫu thực vật. Các dung môi thường được sử dụng bao gồm etanol, metanol, etyl axetat, và n-hexan. Sau khi chiết xuất, các hợp chất được phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Mục tiêu là tách các hợp chất thành các phân đoạn riêng biệt dựa trên tính chất vật lý và hóa học của chúng.

3.2. Kỹ Thuật Phân Tích Cấu Trúc Hóa Học Hiện Đại

Các kỹ thuật phân tích cấu trúc hóa học hiện đại như khối phổ (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đóng vai trò then chốt trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập. Khối phổ cung cấp thông tin về khối lượng phân tử của hợp chất, trong khi NMR cung cấp thông tin chi tiết về các nguyên tử và liên kết trong phân tử. Kết hợp thông tin từ cả hai kỹ thuật này cho phép các nhà khoa học xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Lá Cây Bồ Đề Trung Bộ

Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Bồ Đề Trung Bộ (Styrax annamensis) đã phân lập và định danh được một số hợp chất, bao gồm các flavonoid, terpenoid, alkaloid, saponin, polyphenol, và tinh dầu. Các hợp chất này có thể có hoạt tính sinh học khác nhau, như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, và độc tính tế bào. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Bồ Đề Trung Bộ trong dược học cổ truyền và phát triển các sản phẩm dược liệu mới.

4.1. Phân Lập và Định Danh Các Hợp Chất Từ Lá Cây

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và định danh một số hợp chất từ lá cây Bồ Đề Trung Bộ. Các hợp chất này được phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký khác nhau và được định danh bằng các phương pháp phổ như NMR và khối phổ. Các hợp chất được phân lập bao gồm các flavonoid, terpenoid, alkaloid, saponin, polyphenol, và tinh dầu.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào In Vitro

Các hợp chất đã phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư in vitro. Kết quả cho thấy một số hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, cho thấy tiềm năng chống ung thư của cây Bồ Đề Trung Bộ. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu in vivo để xác nhận kết quả này.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Tiềm Năng Phát Triển Dược Liệu

Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bồ Đề Trung Bộ mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong lĩnh vực dược liệu. Các hợp chất có hoạt tính sinh học có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, và thuốc. Việc bảo tồn nguồn gen và phát triển bền vững cây Bồ Đề Trung Bộ cũng cần được quan tâm để đảm bảo nguồn cung dược liệu ổn định trong tương lai.

5.1. Tiềm Năng Phát Triển Sản Phẩm Từ Dược Liệu

Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây Bồ Đề Trung Bộ có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, và thuốc. Ví dụ, các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa có thể được sử dụng trong các sản phẩm chống lão hóa, trong khi các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn có thể được sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc da.

5.2. Bảo Tồn Nguồn Gen và Phát Triển Bền Vững

Việc bảo tồn nguồn gen và phát triển bền vững cây Bồ Đề Trung Bộ là rất quan trọng để đảm bảo nguồn cung dược liệu ổn định trong tương lai. Cần có các biện pháp để bảo vệ cây Bồ Đề Trung Bộ khỏi nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức và mất môi trường sống. Đồng thời, cần có các chương trình phát triển bền vững để đảm bảo rằng việc khai thác cây Bồ Đề Trung Bộ không gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Styrax Annamensis

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bồ Đề Trung Bộ (Styrax annamensis) đã mang lại những kết quả ban đầu đầy hứa hẹn. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn để khám phá hết tiềm năng dược lý của loài cây này. Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định cơ chế tác dụng của các hợp chất, đánh giá độc tính và tác dụng phụ, và tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để chứng minh hiệu quả của cây Bồ Đề Trung Bộ trong điều trị bệnh.

6.1. Xác Định Cơ Chế Tác Dụng Của Các Hợp Chất

Việc xác định cơ chế tác dụng của các hợp chất là rất quan trọng để hiểu rõ cách chúng hoạt động trong cơ thể và để phát triển các loại thuốc hiệu quả hơn. Cần có các nghiên cứu để xác định các mục tiêu phân tử mà các hợp chất tác động lên và các con đường tín hiệu mà chúng điều chỉnh.

6.2. Đánh Giá Độc Tính và Tác Dụng Phụ

Việc đánh giá độc tính và tác dụng phụ của các hợp chất là rất quan trọng để đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Cần có các nghiên cứu để xác định liều lượng an toàn của các hợp chất và các tác dụng phụ có thể xảy ra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nguồn dược liệu tự nhiên đóng vai trò thiết yếu trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số thế giới hiện nay tin tưởng và sử dụng các liệu pháp chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật. Tại Việt Nam, hệ thực vật vô cùng phong phú với gần 13.000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó có hơn 4.000 loài được ứng dụng trong y học cổ truyền. Họ Bồ đề (Styracaceae) trên thế giới có khoảng 160 loài thuộc 11 chi, riêng chi Bồ đề (Styrax) là chi lớn nhất với khoảng 130 loài trên toàn cầu và 12 đến 13 loài phân bố tại Việt Nam.

Mặc dù các loài thuộc chi Styrax từ lâu đã nổi tiếng với việc cung cấp nhựa thơm benzoin cùng hơn 130 hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học phong phú, loài Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.) vẫn chưa từng được nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và tác dụng sinh học ở cả trong nước lẫn quốc tế. Vấn đề nghiên cứu đặt ra là làm sáng tỏ cấu trúc hóa học và đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư của loài thực vật đặc hữu này. Mục tiêu cụ thể của luận văn là thu hái mẫu lá Bồ đề Trung Bộ tại tỉnh Điện Biên vào tháng 6 năm 2018, chiết tách, phân lập các hợp chất sạch và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Ý nghĩa nghiên cứu thể hiện qua việc bổ sung cơ sở dữ liệu khoa học chuẩn xác về hóa thực vật, góp phần định hướng khai thác hiệu quả nguồn dược liệu bản địa của Việt Nam giai đoạn 2021-2030.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng hóa thực vật hiện đại và lý thuyết phân lập hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật. Khung lý thuyết tập trung vào 3 nhóm cấu trúc đặc trưng phổ biến trong chi Styrax gồm benzofuran, lignan và triterpenoid. Đây là những nhóm hợp chất sở hữu nhiều hoạt tính dược lý giá trị như kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa và ức chế tế bào ung thư.

Về mặt đánh giá tác dụng sinh học, đề tài áp dụng nguyên lý thử nghiệm độc tính tế bào MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Cơ chế của phương pháp dựa trên phản ứng khử muối tetrazolium màu vàng thành tinh thể formazan màu tím nhờ enzyme succinate dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống. Cường độ màu tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót, cho phép xác định chính xác giá trị nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào (IC50) sau thời gian can thiệp.

Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 1,3 kg lá cây Bồ đề Trung Bộ khô thu hái tại xã Mường Phăng, tỉnh Điện Biên, được giám định khoa học bởi chuyên gia thực vật học. Phương pháp chọn mẫu là thu thập mẫu đại diện tự nhiên trong sinh cảnh ven rừng, sau đó làm khô ở nhiệt độ 40-45 độ C để bảo toàn các hoạt chất nhạy cảm với nhiệt. Quy trình chiết xuất sử dụng kỹ thuật ngâm chiết kết hợp hỗ trợ sóng siêu âm 3 lần (24 giờ mỗi lần) ở 45 độ C với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được 3 phân đoạn dịch chiết: cặn n-hexan (42 g), cặn ethyl acetat (55 g) và cặn methanol (53 g).

Phân đoạn cặn ethyl acetat (55 g) được lựa chọn để phân tách các hợp chất mục tiêu thông qua sắc ký cột silica gel pha thường (cỡ hạt 40-60 micromet) và sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100 micromet). Phương pháp này được lựa chọn vì khả năng phân tách tối ưu các hợp chất có độ phân cực gần nhau và khối lượng phân tử khác biệt. Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định thông qua hệ phổ hiện đại gồm phổ khối ESI-MS, HR-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) trên thiết bị Bruker Avance 500 MHz. Hoạt tính gây độc tế bào được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi (LU-1), ung thư gan (HepG2) và ung thư vú (MCF-7) ở mật độ 30.000 tế bào mỗi giếng trong thời gian 72 giờ, sử dụng chất tham chiếu là Ellipticine.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 55 g cặn chiết ethyl acetat của lá cây Bồ đề Trung Bộ, nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc thành công 6 hợp chất tự nhiên tinh khiết ở dạng chất rắn màu trắng:

1. Hợp chất 1: Egonol (7,2 mg, công thức phân tử C19H18O5).
2. Hợp chất 2: Acid egonoic (6,0 mg, công thức phân tử C19H16O6).
3. Hợp chất 3: (-)-Machicendiol (6,0 mg, công thức phân tử C19H18O6).
4. Hợp chất 4: Styraxin (6,5 mg, công thức phân tử C20H18O7).
5. Hợp chất 5: Vladinol D (7,5 mg, công thức phân tử C20H22O7).
6. Hợp chất 6: Acid ursolic (11,0 mg, công thức phân tử C30H48O3).

Đáng chú ý, nghiên cứu đã ghi nhận 2 phát hiện khoa học đột phá: hợp chất (-)-Machicendiol (hợp chất 3) và Vladinol D (hợp chất 5) lần đầu tiên được tìm thấy trong toàn bộ chi Styrax trên thế giới. Vladinol D là một tetrahydrofuran lignan vốn chỉ được ghi nhận ở một số loài thực vật thuộc chi Vladimiria hoặc Forsythia, việc phát hiện hợp chất này giúp mở rộng đáng kể bức tranh phân loại hóa học của chi Bồ đề. Các hợp chất phân lập được đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng chú ý trên 4 dòng tế bào ung thư người thử nghiệm.

Thảo luận kết quả

Quá trình phân tích dữ liệu phổ NMR và MS cho phép làm sáng tỏ mối quan hệ mật thiết giữa cấu trúc hóa học và độ chuyển dịch điện tử của các hợp chất. So sánh phổ của hợp chất 1 (Egonol) và hợp chất 2 (Acid egonoic) cho thấy nhóm hydroxy tại C-3'' đã bị oxy hóa hoàn toàn thành nhóm carboxylic với tín hiệu carbon đặc trưng tại 179,3 ppm. Ở hợp chất 3 ((-)-Machicendiol), nhóm methylene tại C-1'' được thay thế bởi nhóm hydroxymethine tại 4,81 ppm, làm tăng khối lượng phân tử thêm 16 Da so với Egonol. Tương tác đa liên kết HMBC và tương tác proton COSY khẳng định vững chắc cấu trúc không gian của khung furofuran lignan ở hợp chất 4 và tetrahydrofuran lignan ở hợp chất 5.

Dữ liệu nghiên cứu được tổng hợp tối ưu qua hệ thống bảng biểu so sánh chi tiết độ dịch chuyển hóa học 1H-NMR, 13C-NMR và hằng số tương tác spin-spin giữa các dẫn xuất benzofuran. Đồng thời, kết quả thử nghiệm sinh học có thể được minh họa trực quan qua biểu đồ cột thể hiện giá trị IC50 của 6 hợp chất và chất chuẩn Ellipticine trên 4 dòng tế bào KB, LU-1, HepG2 và MCF-7. Sự tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chỉ ra rằng các nhóm thế methoxy và dioxymethylene trên khung benzofuran đóng vai trò then chốt trong việc gia tăng khả năng ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp chiến lược nhằm thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng loài Bồ đề Trung Bộ:

1. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phân lập: Doanh nghiệp dược phẩm phối hợp cùng các viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC) nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi 6 hợp chất hoạt tính lên trên 85% và đạt độ tinh khiết tối thiểu 98%, hoàn thiện quy trình chuẩn trong giai đoạn 2026-2027.
2. Mở rộng sàng lọc hoạt tính dược lý: Các phòng thí nghiệm chuyên ngành cần tiếp tục thử nghiệm hoạt tính của các hợp chất benzofuran và lignan trên 10 đến 15 dòng tế bào ung thư khác, đồng thời khảo sát chuyên sâu cơ chế kích hoạt apoptosis và chu kỳ tế bào trong thời gian 12 đến 24 tháng tới.
3. Đánh giá độc tính tiền lâm sàng: Cơ quan nghiên cứu y dược triển khai đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thí nghiệm, xác định khoảng liều an toàn LD50 trước năm 2028 nhằm tạo tiền đề cho các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo.
4. Quy hoạch và bảo tồn nguồn gen dược liệu: Sở Khoa học và Công nghệ cùng Chi cục Kiểm lâm tại các địa phương (Điện Biên, Huế, Quảng Trị) xây dựng phương án bảo tồn và nhân giống cây Bồ đề Trung Bộ trên quy mô tối thiểu 5 hecta, đảm bảo nguồn cung cấp dược liệu ổn định đạt tiêu chuẩn GACP-WHO đến năm 2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là nguồn tư liệu học thuật giá trị cao, phù hợp cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Giảng viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược: Cung cấp một case study mẫu mực về quy trình phân lập sắc ký hiện đại và phương pháp giải mã cấu trúc phân tử phức tạp bằng tổ hợp 6 phương pháp phổ 1D/2D-NMR và HR-MS.
2. Các nhà nghiên cứu tại viện y dược học và trung tâm nghiên cứu thuốc: Khai thác kho dữ liệu về độc tính tế bào của 6 hợp chất sạch trên 4 dòng tế bào ung thư để phát triển các dẫn xuất tổng hợp hoặc bán tổng hợp mới có hoạt tính cao hơn.
3. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Tiếp cận các hợp chất tự nhiên có tiềm năng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào để nghiên cứu công thức sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh từ nguồn thảo dược Việt Nam.
4. Chuyên gia quản lý tài nguyên rừng và bảo tồn đa dạng sinh học: Tham khảo đặc điểm sinh học và vùng phân bố của cây Bồ đề Trung Bộ tại 5 tỉnh thành để xây dựng chiến lược bảo tồn nguồn gen thực vật bản địa quý hiếm.

Câu hỏi thường gặp

Cây Bồ đề Trung Bộ phân bố ở đâu tại Việt Nam?

Cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.) phân bố tự nhiên ven rừng tại một số địa phương như Điện Biên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Nội, Thừa Thiên Huế và Quảng Trị. Mẫu nghiên cứu của đề tài được thu thập chính xác tại Mường Phăng, Điện Biên vào năm 2018.

Nghiên cứu đã phân lập được bao nhiêu hợp chất tinh khiết từ lá cây?

Từ 55 g cặn chiết ethyl acetat, nghiên cứu đã tinh chế và xác định cấu trúc của 6 hợp chất sạch gồm: Egonol (7,2 mg), Acid egonoic (6,0 mg), (-)-Machicendiol (6,0 mg), Styraxin (6,5 mg), Vladinol D (7,5 mg) và Acid ursolic (11,0 mg).

Hai hợp chất nào lần đầu tiên được phát hiện trong chi Bồ đề?

Hợp chất (-)-Machicendiol thuộc nhóm benzofuran và Vladinol D thuộc nhóm tetrahydrofuran lignan là 2 chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Styrax trên toàn thế giới, mang lại đóng góp mới cho ngành hóa thực vật quốc tế.

Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất được đánh giá trên những dòng tế bào nào?

Nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào in vitro qua phép thử MTT trên 4 dòng tế bào ung thư người gồm: KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) và MCF-7 (ung thư vú) ở mật độ 30.000 tế bào mỗi giếng trong 72 giờ.

Thiết bị quang phổ nào đóng vai trò chủ đạo trong việc xác định cấu trúc?

Hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz (ghi nhận phổ 1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) kết hợp cùng phổ khối lượng phân giải cao HR-MS đóng vai trò quyết định trong việc nhận dạng chính xác từng liên kết và cấu trúc phân tử.

Kết luận

Luận văn thạc sĩ đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với những đóng góp khoa học nổi bật:

• Xử lý thành công 1,3 kg mẫu lá Bồ đề Trung Bộ và chiết xuất chọn lọc thành 3 phân đoạn cặn dung môi.
• Phân lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh của 6 hợp chất tự nhiên tinh khiết thuộc nhóm benzofuran, lignan và triterpenoid.
• Phát hiện 2 hợp chất lần đầu tiên được ghi nhận trong chi Styrax trên thế giới là (-)-Machicendiol và Vladinol D.
• Xác lập bộ dữ liệu phổ chi tiết và chứng minh hoạt tính ức chế tế bào ung thư trên 4 dòng tế bào người chuẩn hóa.
• Định hình lộ trình phát triển nguồn dược liệu quý cho ngành hóa dược Việt Nam trong giai đoạn 3-5 năm tới.

Công trình khẳng định tiềm năng to lớn của hệ thực vật Việt Nam trong việc cung cấp các hoạt chất dẫn đường cho công nghệ phát triển thuốc mới. Quý độc giả và các đơn vị nghiên cứu quan tâm có thể tham khảo toàn văn luận văn để ứng dụng chi tiết các quy trình phân lập và phổ nghiệm trong các công trình khoa học tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ CHI BỒ ĐỀ STYRAX (STYRACACEAE) Họ Bồ đề Styracaceae bao gồm 11 chi với khoảng 160 loài bao gồm các cây thân bụi hoặc thân gỗ nhỏ phân bố rộng rãi ở khắp các vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới. Theo thống kê, chi Bồ đề Styrax là chi lớn nhất trong họ Bồ đề, bao gồm khoảng 130 loài, chiếm tới 80% tổng số loài của họ Styracaceae. Chi Bồ đề phân bố phổ biến ở các vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới ở Đông Nam Á, Châu Âu và Châu Mỹ [5,6].

Chi Bồ đề hay còn gọi chi an tức (danh pháp khoa học: Styrax) là một chi thực vật có khoảng 100 loài mọc thành bụi rậm hoặc cây nhỏ trong họ Bồ đề (Styracaceae), chủ yếu có nguồn gốc ở các vùng khí hậu ấm tới các vùng nhiệt đới của Bắc bán cầu, chủ yếu ở khu vực đông và đông nam châu Á, nhưng cũng vượt qua đường xích đạo ở Nam Mỹ. Các loài cây này cao từ 2-14 m và có các lá hình trứng mọc luân phiên, sớm rụng hoặc xanh lưu niên dài từ 1-18 cm và rộng từ 2-10 cm. Hoa của chúng rủ xuống, có 5-10 tràng hoa hình thùy màu trắng, tạo thành từ 3-30 hoa trong các chùy hoa dài 5-25 cm thưa hay rậm. Quả là loại quả hạch khô và thuôn dài, trơn không có gân hay các cánh hẹp (hiện diện ở các chi có quan hệ họ hàng là Halesia và Pterostyrax).

Các tên gọi phổ biến là bồ đề, an tức hương, chuông tuyết và cánh kiến trắng. Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Bồ đề Styrax ở Việt Nam có 12 loài [7]. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Bồ đề Styrax Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài chi Bồ đề Styrax được thực hiện từ khá sớm vào khoảng năm 1915 khi Osaka lần đầu tiên phân lập được egonol (3) từ chi này. Cho tới nay, đã có tới hơn 130 hợp chất được phát hiện từ các loài thuộc chi Bồ đề chứa đựng nhiều hoạt tính sinh học thú vị, chủ yếu là các lignan, benzofuran, triterpenoid và các saponin.

tonkinense, Bồ đề nhựa (hay Bồ đề vỏ đỏ) S. Chất nhựa này được sử dụng rộng rãi làm thuốc dân gian điều trị các chứng bệnh khác nhau như viêm thanh quản, viêm phế quản, rối loạn đường hô hấp trên, loét, mụn cơm và dị ứng da. Nó cũng được sử dụng làm chất cố định hương trong nước hoa và được dùng làm hương liệu trong mỹ phẩm…[9,10]. Các hợp chất lignan, dẫn xuất norlignan (benzofuran) là các lớp chất chiếm ưu thế ở chi Bồ đề Styrax.

Ví dụ như từ loài Styrax officinalis phân lập được bốn benzofuran glycoside [11], sáu benzofuran từ hạt loài Styrax obassia và Styrax officinalis [12,13], 2-Aryl benzofuran từ hạt loài Styrax macranthus [14]. Mười benzofuran từ thân loài Styrax perkinsiae [15]. Từ loài Styrax ferrugineus , đã phân lập được sáu norlignans benzofuran [16] và mười lignans đã được tinh chế từ vỏ thân loài Styrax perkinsiae [17].…Vì vậy, các benzofuran và lignan được coi là những hợp chất tiêu biểu của chi Bồ đề Styrax. Hoạt tính gây độc tế bào Các báo cáo cho thấy, chi Styrax nổi bật với hoạt tính chống ung thư, chủ yếu có được là do lớp chất benzofuran, tritrerpenoid và lignan.

Từ hạt của loài Styrax perkinsiae, nhóm tác giả Li (2005) đã phân lập được 4 hợp chất benzofuran mới: benzofuran 5-(3''-hydroxypropyl)-7-hydroxy- 2-(3',4'-methylenedioxyphenyl) benzofuran (1) và trans -5-(3'''-hydroxypropyl)- 7-methoxy-2[2',3'-dihydro-3'-hydroxymethyl-7'-methoxy-2'-(3''-methoxy-4''- hydroxyphenyl)-benzofuran-5'-yl] benzofuran (2), (E)-5-(2-formylvinyl)-7- methoxy-2-(3,4-methylenedioxyphenyl) benzofuran, 5-(3-butanoyloxypropyl)- 7-methoxy-2-(3,4-methylenedioxyphenyl) benzofuran cùng với 9 hợp chất benzofuran và triterpen đã biết: egonol (3), demethoxyegonol, egonol acetate, demethoxyegonol acetate, egonol glucoside, egonol gentiobioside, egonol gentiotrioside , β-sitosterol và β-daucosterol. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư cho thấy, hai hợp chất benzofuran mới (1) và (2) có hoạt tính ức chế 2 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 với IC50 từ 3. 13 Hai hợp chất benzofuran lignan egonol (3) và homoegonol (4) được tìm thấy ở nhiều loài Styrax. Egonol (3) và homoegonol (4) được phân lập từ thân loài Styrax camporum Pohl.

bởi nhóm tác giả Teles (2005). Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp MTT khẳng định egonol (3) có hoạt tính gây độc mạnh dòng ung thư thần kinh (C6), ung thư biểu mô thanh quản Hep-2, với giá trị IC50 lần lượt là 3. Trong khi homoegonol (4) là 4.3 µg/ml trên dòng C6 và ung thư cổ tử cung (HeLa) [19]. Nghiên cứu tiếp theo của nhóm tác giả Olivera (2015) cho thấy egonol (3) và homoegonol (4) từ dịch chiết EtOH của loài Styrax camporum, được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp XTT trên các dòng ung thư da (B16F10), ung thư biểu mô tuyến vú (MCF-7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (HepG2) và u nguyên bào sợi thần kinh (MO59J).

Kết quả cho thấy dịch chiết EtOH và cả hai hợp chất này đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với giá trị IC50 từ 9.2 μg/mL trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Trong đó, hoạt tính mạnh nhất là trên dòng ung thư cổ tử cung (HeLa) và hợp chất egonol thể hiện hoạt tính mạnh hơn homoegonol [20]. Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của vỏ thân loài Styrax japonica cho thấy, cặn chiết metanol (MeOH) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 5 dòng tế bào ung thư: ung thư phổi (A549), buồng trứng (SK-OV-3), ung thư sắc tố da (SK-MEL-2), tử cung (MES-AS) và ung thư đại tràng (HCT-15) [21]. Phân lập và tinh chế các chất sạch từ cặn MeOH thu được một số triterpene như oleanolic aldehyde acetate (5), erythrodiol-3-acetate (6), euphorginol (7) và anhydrosophoradiol-3-acetate (8).

Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào cho thấy, hợp chất (5) và (8) có hoạt tính ức chế mạnh các dòng ung thư ung thư phổi (A549), buồng trứng (SK-OV-3), ung thư sắc tố da (SK-MEL-2), ung thư tử cung (MES-AS) và ung thư đại tràng (HCT-15) với IC50 lần lượt từ 5.1: Một số hợp chất gây độc tế bào phân lập từ các loài chi Styrax Nghiên cứu khả năng ức chế phân chia dòng tế bào ung thư máu HL-60 của các triterpenoid phân lập từ nhựa cây Styrax tonkinensis bằng phương pháp khử Nitroblue Tetrazolium (NBT reduction assay) cho thấy, các triterpen: 3β - hydroxy-12-oxo-13Hα-olean-28,19β-olide (9), 6β-hydroxy-3-oxo-11α,12α - epoxyolean-28,13β -olide (10), axit 3β,6β-dihydroxy-11-oxo-olean-12-en-28-oic (11), 3β,6β-dihydroxy-11α,12α-epoxyolean-28,13β-olide (12), axit 19α- hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic (13), axit 6β-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28- oic (14), axit sumaresinolic (15), axit siaresinolic (16) và axit oleanolic (17) có hoạt tính ức chế phân chia dòng tế bào ung thư máu HL-60 với IC50 từ 8,9-99,4 µM trong đó, axit oleanolic (17) là chất có hoạt tính mạnh nhất với IC50 là 8,9 µM, hợp chất (12) ức chế yếu nhất trong số các triterpen trên [22]. 15 Hoạt tính chống oxy hóa Cặn chiết aceton/H2O 70% từ lá loài S. formosanum được đánh giá khả năng chống oxy hóa trên hệ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và gốc hydroxyl. Kết quả cho thấy cặn chiết này có hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH và hydroxyl với IC50 lần lượt là 31.

Xác định hàm lượng phenol tổng theo phương pháp Folin-Ciocalteu cho thấy cặn này có chứa 2.7 mg axit gallic/g cặn chiết khô [23]. Từ dịch chiết quả loài Styrax ramirezii, một loại trái cây được ưa chuộng làm đồ uống ở Mexico, nhóm tác giả Timmers (2015) đã phân lập được 6 hợp chất norneolignan trong đó có 2 hợp chất chính là egonol (3) và homoegonol (4). Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa trên hệ ROS (reative oxygen species) và NO (nitric oxide) cho thấy, trong số 6 norneolignan này thì egonol có hoạt tính mạnh nhất thông qua khả năng làm giảm sự tạo thành các gốc NO ở 0.108 µM và ức chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2), enzyme xúc tác phản ứng sinh gốc tự do ROS là 0.2: Một số hợp chất bẫy gốc tự do phân lập từ chi Styrax Hợp chất lignan: pinoresinol (18) được nhóm tác giả Kakie (1994) phân lập từ loài Styrax japonica. Hợp chất này đã được nhiều công trình công bố có hoạt tính chống oxy hóa, chống cao huyết áp, được sử dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm [25].

Trong một nghiên cứu khác, nhóm tác giả Min (2004a) đã phân lập được một số hợp chất benzofuran và lignan từ vỏ thân của loài Styrax 16 japonica như styraxlignolide B-F (19-23), taraxerol (24), syringin (25) và pinoresinol glucoside (26). Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro cho thấy hợp chất 20 , 21, 22 và 26 có khả năng bẫy gốc tự do DPPH yếu với IC50 lần lượt là 380, 278, 194 và 260 µM. Các hợp chất 19, 23, 24, 25 không có hoạt tính với IC50 > 500 µM do cấu trúc không có nhóm phenolic [26]. Hoạt tính kháng vi sinh vật Dịch chiết thô từ lá loài S.

ferrugineus có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm trên các chủng Staphylococcus aureus, Candida albicans , và Cladosporium sphaerospermum với giá trị MIC (minimum inhibition concentration) lần lượt là 200 µg/ml, 800 µg/ml và 750 µg/ml. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ lá loài này cho thấy, các lignan như egonol (3), homoegonol (4), egonol-β-glucoside (27), homoegonol-β-glucoside (28) và dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (29) có hoạt tính ức chế sinh trưởng các chủng vi khuẩn và nấm S. albicans với giá trị MIC trong khoảng 10-20 µg/ml. Tuy nhiên, chỉ có hợp chất 3 và 4 có hoạt tính mạnh với MIC từ 5-10 µg/ml trên chủng C.

Ngoài ra, hai hợp chất egonol (3), homoegonol (4) cũng được các nhà khoa học Brazin phân lập từ cặn chiết EtOH (EE) của loài Styrax pohlii. Hai hợp chất này cùng với cặn chiết EtOH (EE) và các phân đoạn n-Hexan (HF), EtOAc (EF), n-BuOH (BF), hydromethanolic (HMF) được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên các chủng: Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa và Klebsiella pneumoniae bằng phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng. Kết quả cho thấy, cặn chiết EE có giá trị MIC là 400µg/ml trên chủng S.

aeruginosa; và 300 µg/ml trên chủng H. Hai phân đoạn HF và EF ức chế chủng S. pneumoniae với MIC là 200 µg/ml nhưng chỉ có phân đoạn EF ức chế chủng H. influenzae với MIC là 200 µg/ml.

Cả 2 hợp chất egonol (3), homoegonol (4) đều có hoạt tính kháng hai chủng S. aeruginosa với giá trị MIC = 400 µg/ml [28]. Hai hợp chất saponin A (30) và saponin B (31) được phân lập từ thân loài Styrax officinalis L. bởi nhóm tác giả Zehavi (1986).

Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của các hợp chất này trên một số chủng nấm gây bệnh cây cho thấy saponin 17 A có hoạt tính kháng nấm mạnh trên các chủng Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger và Rhizopus mucco với IC50 lần lượt là 3.7 và 12 µg/ml, nhưng không kháng chủng Rhizoctonia solani ở nồng độ 80 µg/ml. Hợp chất saponin B có hoạt tính kháng nấm yếu đối với các chủng Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger và Rhizopus mucco ở nồng độ 80 µg/ml [29].