Khóa Luận Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U Calophyllum Inophyllum

Khóa luận nghiên cứu thành phần hóa học lá mù u Calophyllum inophyllum L thuộc họ Măng cụt Guttiferae, cung cấp thông tin quý giá cho ngành hóa học.

• Tác giả: Bùi Văn Quyết
• Người hướng dẫn: TS. Mai Đình Trị
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm TPHCM
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Từ Cây Mù U Calophyllum Inophyllum
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG
• 1.1. Mô tả chung
• 1.2. ĐẶC DIỆM THỰC VẬT
• 1.3. Vùng phân bố, thu hái
• 1.4. Theo y học cổ truyền
• 1.5. Theo y học hiện đại
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp
• 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỂN LUẬN
• 3.1. Xác định cấu trúc hợp chất CIE8
• 3.2. Xác định cấu trúc hợp chất CTE6
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC KÝ TỰ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ
• DANH MỤC BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Cây mù u, hay còn gọi là Calophyllum inophyllum, là một loài cây có giá trị dược liệu cao. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây mù u đã chỉ ra rằng nó chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất này không chỉ có tác dụng chữa bệnh mà còn có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư. Việc tìm hiểu sâu về thành phần hóa học của cây mù u sẽ giúp nâng cao giá trị ứng dụng của nó trong y học hiện đại.

1.1. Cây Mù U Đặc Điểm và Phân Bố

Cây mù u thuộc họ Guttiferae, có thể cao từ 10-15m. Loài cây này phân bố chủ yếu ở các tỉnh ven biển Việt Nam. Mù u có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền, từ việc điều trị vết thương đến các bệnh lý khác.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mù u giúp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học. Điều này không chỉ hỗ trợ trong việc phát triển thuốc mà còn góp phần bảo tồn và phát huy giá trị của nguồn dược liệu tự nhiên.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Mặc dù cây mù u có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu thành phần hóa học của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Thiếu tài liệu và nghiên cứu chuyên sâu là một trong những vấn đề lớn. Hơn nữa, việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây mù u cũng đòi hỏi kỹ thuật cao và thời gian dài.

2.1. Thiếu Tài Liệu Nghiên Cứu

Nhiều nghiên cứu về cây mù u vẫn còn hạn chế, đặc biệt là trong nước. Điều này làm giảm khả năng ứng dụng của các hợp chất từ cây mù u trong y học hiện đại.

2.2. Khó Khăn Trong Phân Tách Hợp Chất

Việc phân lập các hợp chất từ cây mù u thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của các hợp chất có trong cây. Kỹ thuật phân tích hiện đại như GC-MS và NMR cần được áp dụng để đạt được kết quả chính xác.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Để nghiên cứu thành phần hóa học của cây mù u, các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng, sắc ký khí và phổ cộng hưởng từ được sử dụng. Những phương pháp này giúp phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất có trong cây mù u một cách hiệu quả.

3.1. Sắc Ký Lỏng HPLC Trong Phân Tích

Sắc ký lỏng là một trong những phương pháp chính được sử dụng để phân tích các hợp chất trong cây mù u. Phương pháp này cho phép tách biệt các hợp chất một cách hiệu quả và nhanh chóng.

3.2. Phổ Cộng Hưởng Từ NMR Để Xác Định Cấu Trúc

Phổ cộng hưởng từ là công cụ quan trọng trong việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. Phương pháp này giúp xác định các nhóm chức và cấu trúc phân tử của các hợp chất trong cây mù u.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây mù u chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như xanthone, coumarine và triterpenoid. Các hợp chất này đã được chứng minh có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư, mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong y học.

4.1. Các Hợp Chất Xanthone Từ Cây Mù U

Nghiên cứu đã phân lập được nhiều hợp chất xanthone từ cây mù u, trong đó có inophyllum B và calophyllolide. Những hợp chất này có hoạt tính sinh học mạnh mẽ, đặc biệt là trong việc kháng viêm và kháng khuẩn.

4.2. Tác Dụng Của Các Hợp Chất Coumarine

Các hợp chất coumarine như inophyllolide và calophyllolide đã được chứng minh có tác dụng kháng viêm và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của cây mù u trong y học.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Cây Mù U Trong Y Học

Cây mù u không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền mà còn có tiềm năng lớn trong y học hiện đại. Các hợp chất từ cây mù u đã được nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lý, từ viêm nhiễm đến ung thư.

5.1. Ứng Dụng Trong Điều Trị Bệnh Viêm

Dầu mù u được sử dụng để điều trị các bệnh viêm nhiễm, giúp làm giảm triệu chứng và hỗ trợ quá trình hồi phục. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả của nó trong việc điều trị viêm da và viêm khớp.

5.2. Tiềm Năng Trong Điều Trị Ung Thư

Các hợp chất từ cây mù u, đặc biệt là xanthone, đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư từ thiên nhiên.

VI. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Cây Mù U

Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây mù u đã chỉ ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để khai thác tối đa giá trị của loài cây này. Tương lai của nghiên cứu cây mù u hứa hẹn sẽ mang lại nhiều phát hiện mới và ứng dụng thực tiễn.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần có nhiều nghiên cứu hơn về các hợp chất trong cây mù u để xác định rõ hơn về hoạt tính sinh học của chúng. Việc phát triển các sản phẩm từ cây mù u cũng cần được chú trọng.

6.2. Khả Năng Ứng Dụng Trong Y Học Hiện Đại

Với những kết quả nghiên cứu hiện tại, cây mù u có thể trở thành nguồn dược liệu quý giá trong y học hiện đại. Việc phát triển các sản phẩm từ cây mù u sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong điều trị bệnh.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hệ thực vật nhiệt đới Việt Nam là nguồn tài nguyên sinh học đa dạng, cung cấp nhiều loài cây thuốc có giá trị dược liệu được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền. Trong đó, cây mù u (Calophyllum inophyllum L.), thuộc họ Măng cụt (Guttiferae), là loài thực vật thân gỗ phân bố phổ biến ở các vùng đất cát ven biển và các tỉnh phía Nam. Theo kinh nghiệm dân gian, các bộ phận của cây mù u (vỏ, thân, lá, hạt, nhựa) được dùng để chữa bỏng, làm lành sẹo, trị ghẻ lở, mụn nhọt, viêm loét nhiễm trùng, thấp khớp và viêm dây thần kinh.

Trên thế giới, các công trình nghiên cứu hiện đại đã chứng minh nhiều nhóm hoạt chất tự nhiên phân lập từ chi Calophyllum sở hữu các hoạt tính sinh học giá trị cao như: ức chế men sao chép ngược của virus HIV-1 (tiêu biểu là hợp chất inophyllum B), kháng viêm (calophyllolide), kháng khuẩn và ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư (calocoumarin-A). Tuy nhiên, tại Việt Nam vào thời điểm thực hiện đề tài, các công bố khoa học chuyên sâu về thành phần hóa thực vật của cây mù u mọc trong nước còn tương đối hạn chế, chưa cung cấp đầy đủ dữ liệu phổ học thực nghiệm để làm sáng tỏ cơ sở hóa học cho các ứng dụng dược lý.

Đề tài khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu thành phần hóa học lá mù u (Calophyllum inophyllum L., họ Măng cụt Guttiferae)" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

1. Thu thập, xử lý nguyên liệu và điều chế các phân đoạn cao chiết từ lá cây mù u thu hái tại tỉnh Trà Vinh.
2. Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký cột pha thường để phân tách và tinh chế các hợp chất hữu cơ sạch từ phân đoạn cao chloroform.
3. Xác định hằng số vật lý, đo đạc và biện luận cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại (ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Thành phần hóa học trong lá cây mù u (Calophyllum inophyllum L., họ Măng cụt Guttiferae).
• Phạm vi không gian: Mẫu lá mù u được thu hái thực địa tại huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh.
• Phạm vi thời gian: Mẫu thực vật thu hái vào tháng 7 năm 2010; khóa luận hoàn thành và bảo vệ vào tháng 5 năm 2012 tại Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thực nghiệm: Tập trung khảo sát, phân lập và định danh cấu trúc các hợp chất thứ cấp sạch từ phân đoạn cao chiết chloroform.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Khung lý thuyết và phân loại hóa thực vật chi Calophyllum

Về mặt hóa thực vật, chi Calophyllum (gồm khoảng 130 loài trên thế giới, 15 loài tại Việt Nam theo hệ thống phân loại của Giáo sư Phạm Hoàng Hộ) nổi tiếng với sự phong phú của các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc polyphenol và triterpenoid phức tạp:

• Triterpenoid: Các dẫn xuất khung friedelane và ursane như friedeline, canophyllol, acid canophyllic, acid ursolic.
• Xanthone: Các dẫn xuất phân loại theo số lượng nhóm thế oxygen từ mono-, di-, tri-, tetra- đến penta-oxygenated xanthones (caloxanthone A–E, jacareubine, brasilixanthone B).
• Coumarine và Neo-flavonoid: Các 4-phenylcoumarine và dẫn xuất pyranocoumarine (inophyllum A–I, calophyllolide, calocoumarine A–C) có hoạt tính kháng virus HIV-1 và ức chế tế bào ung thư.
• Hợp chất dễ bay hơi (Tinh dầu): Hỗn hợp sesquiterpene và hydrocarbon mạch thẳng được phân tích bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
• Biflavonoid và Chromene acid: Các khung dimer flavonoid (pyranoamentoflavone) và chromene acid tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm hóa học truyền thống kết hợp với các kỹ thuật phổ nghiệm cấu trúc hiện đại:

• Phương pháp chiết xuất: Bột lá mù u khô được chiết kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết cồn được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao ethanol tổng. Sau đó, cao cồn được phân bố rắn - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform ($CHCl_3$), ethyl acetate ($EtOAc$) và methanol ($MeOH$).
• Phương pháp sắc ký:
  • Sắc ký cột cổ điển (SKC) sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 40–60 $\mu m$) và silica gel pha đảo $RP\text{-}18$ (cỡ hạt 30–50 $\mu m$).
  • Sắc ký lớp mỏng (SKLM) tráng sẵn trên bản nhôm DC-Alufolien $F_{254}$ (Merck) và $RP18\text{ }F_{254s}$ (Merck) để kiểm tra độ tinh khiết và theo dõi quá trình rửa giải.
  • Tác nhân phát hiện vết chất: Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm (hiệu UVITEC), dung dịch thuốc thử $H_2SO_4$ 50% trong ethanol gia nhiệt và dung dịch $FeCl_3$ trong ethanol.
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
  • Đo nhiệt độ nóng chảy trên thiết bị Electrothermal IA 9000 series (sử dụng ống mao quản không hiệu chỉnh).
  • Khối phổ phun mù điện tử (ESI-MS) xác định khối lượng ion phân tử.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D: $^{1}H\text{-NMR}$ (tần số 500 MHz), $^{13}C\text{-NMR}$ (tần số 125 MHz), DEPT, HSQC và HMBC, đo trên máy quang phổ Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer.

Nguồn nguyên liệu và hóa chất

• Mẫu thực vật: 3 kg lá mù u khô thu hái tại huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh (tháng 7/2010), được rửa sạch, loại bỏ lá sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, sấy ở nhiệt độ thấp và xay mịn.
• Dung môi và hóa chất: Hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol, ethanol, acetone đạt độ tinh khiết dùng cho sắc ký và trích ly.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương tổng quan hệ thống hóa tài liệu về đặc điểm thực vật học, công dụng dược liệu và thành phần hóa thực vật của chi Calophyllum nói chung và loài Calophyllum inophyllum nói riêng:

• Đặc điểm thực vật và sinh thái: Calophyllum inophyllum L. (họ Guttiferae) là cây thân gỗ cao 10–15 m, lá mọc đối phiến dai dày, gân lá song song sít nhau, hoa trắng thơm mọc thành chùm, quả hạch hình cầu chứa nhiều dầu béo. Cây có khả năng thích nghi cao với đất cát ven biển, đất ngập mặn và đồi khô cằn.
• Kinh nghiệm y học cổ truyền và dược lý học hiện đại: Tổng thuật các nghiên cứu từ năm 1918 của các nhà khoa học Pháp về tác dụng làm liền da, điều trị phỏng, viêm dây thần kinh do phong của dầu mù u; các ứng dụng tại Việt Nam (Bệnh viện Chợ Rẫy điều trị viêm xương, vết thương; ứng dụng trị viêm lộ tuyến cổ tử cung).
• Thành phần hóa học chiết xuất:
  • Tinh dầu: Dẫn liệu GC-MS xác định 25 hợp chất, trong đó thành phần chính là 1,2,3,4,4a-hexanhydro-1,6,4-(1-methylethyl)naphthalene (chiếm khoảng 24%), cùng $\alpha$-cubebene, $\beta$-bourbonene, calarene, farnesol.
  • Nhóm Xanthone: Thống kê các hợp chất từ mono- đến penta-oxygenated xanthone phân lập bởi các tác giả quốc tế (M. Iinuma, Kumar, Wu, Cheng) kèm dữ liệu hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm.
  • Nhóm Coumarine và Neo-flavonoid: Tổng hợp bảng số liệu giá trị $IC_{50}$ ức chế men sao chép ngược HIV-1 RT của 16 dẫn xuất inophyllum (A. D. Patil, 1993), cho thấy inophyllum B, inophyllum P có hoạt tính ức chế chọn lọc cao.
  • Nhóm Triterpenoid và Chromene acid: Thống kê các khung triterpene đặc trưng như canophyllol, friedeline, acid canophyllic cùng các hợp chất biflavonoid (pyranoamentoflavone).

             Hexane       Chloroform       Ethyl acetate     Methanol
                           (112 g)
                        7 phân đoạn (CIB1 - CIB7)
       Phân đoạn CIB6                    Phân đoạn CIB7
          (12.31 g)                         (8.98 g)
      Hợp chất CIE8                     Hợp chất CIE6
       (Acid ursolic, 21.4 mg)           (Acid canophyllic, 36.5 mg)

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chiết xuất, tách phân đoạn và tinh chế hai hợp chất sạch từ cao chloroform:

• Điều chế cao thô: 3 kg bột lá mù u được chiết kiệt bằng ngâm dầm với ethanol 96°, cô quay thu hồi dung môi thu được 400 g cao ethanol thô. Tiến hành tẩm cao cồn lên chất mang silica gel, sấy khô ở 40 °C và chiết rắn - lỏng phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được 112 g cao chloroform.
• Phân lập từ phân đoạn B6 (CIB6):
  • Cao chloroform (112 g) được sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate tỷ lệ từ 30:1 đến 100% ethyl acetate, gom các phân đoạn tương đồng trên SKLM thành 7 phân đoạn chính (CIB1 đến CIB7).
  • Phân đoạn B6 (12.31 g) được tiếp tục sắc ký cột với hệ dung môi n-hexane : acetone (tỷ lệ 80:1 đến 100% acetone), thu được 8 phân đoạn phụ (B61–B68).
  • Phân đoạn B62 (412.3 mg) được tách tiếp trên cột silica gel bằng hệ n-hexane : acetone thu được 6 phân đoạn (B621–B626).
  • Phân đoạn B622 (125.87 mg) được sắc ký cột silica gel giải ly bằng hệ $CHCl_3 : MeOH$ (tỷ lệ 100:0 đến 100% MeOH), thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn B6222 cho một vết tròn sạch trên SKLM, thu được 21.4 mg hợp chất CIE8 dạng bột màu trắng.
• Phân lập từ phân đoạn B7 (CIB7):
  • Phân đoạn B7 (8.98 g) được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi $CHCl_3 : MeOH$ (tỷ lệ từ 100:0 đến 100% MeOH), gom thành 5 phân đoạn (B71–B75).
  • Phân đoạn B72 (435.28 mg) được tinh chế tiếp bằng hệ $CHCl_3 : MeOH$ thu được 4 phân đoạn (B721–B724).
  • Phân đoạn B721 (175.82 mg) được sắc ký cột tinh chế bằng hệ $CHCl_3 : MeOH$ thu được 4 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn B7212 kết tinh cho một vết sạch trên SKLM, thu được 36.5 mg hợp chất CIE6 dạng tinh thể hình kim màu trắng.

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương này tập trung diễn giải chi tiết quá trình giải mã cấu trúc hóa học của hai hợp chất CIE8 và CIE6 thông qua đối chiếu dữ liệu phổ học thực nghiệm với các công trình chuẩn:

1. Biện luận cấu trúc hợp chất CIE8 (Acid ursolic)

• Hằng số vật lý và phổ khối: CIE8 là chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 270–272 °C (kết tinh trong $CHCl_3 - MeOH$). SKLM cho một vết duy nhất ($R_f$ trong hệ $CHCl_3 : MeOH = 50:1$), hiện màu tím đậm khi phun $H_2SO_4$ 50% gia nhiệt. Phổ ESI-MS ghi nhận pic ion phân tử tại $m/z\text{ }[M+Na]^+ = 479.4$, tương ứng với công thức phân tử $C_{30}H_{48}O_3$ (độ bất bão hòa bằng 7).
• Phổ $^{1}H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$ (đo trong DMSO-$d_6$):
  • Vùng trường cao xuất hiện 7 nhóm methyl ($CH_3$) gồm các mũi đơn và mũi đôi đặc trưng cho khung triterpen ursane: $\delta_H$ 0.67 (3H, s, H-24), 0.74 (3H, s, H-26), 0.81 (3H, d, $J=6.5\text{ Hz}$, H-29), 0.90 (3H, d, $J=6\text{ Hz}$, H-30), 0.91 (3H, s, H-23), 0.92 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-27).
  • Một tín hiệu proton olefin ở trường yếu tại $\delta_H\text{ }5.14\text{ ppm}\text{ }(1H, t, J=3.5\text{ Hz})$ ứng với proton H-12, liên kết với carbon $sp^2$ loại $(=CH-)$ tại $\delta_C\text{ }124.5\text{ ppm}$ (C-12) và carbon bậc bốn $sp^2$ tại $\delta_C\text{ }138.2\text{ ppm}$ (C-13).
  • Tín hiệu proton gắn carbon mang nhóm hydroxyl: $\delta_H\text{ }3.00\text{ ppm}\text{ }(1H, t, J=5\text{ Hz}, H-3)$ tương ứng với tín hiệu carbon mang oxy tại $\delta_C\text{ }76.8\text{ ppm}$ (C-3).
  • Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ và DEPT xác định đủ 30 carbon gồm: 7 nhóm methyl ($-CH_3$), 9 nhóm methylene ($-CH_2-$), 6 nhóm methine ($>CH-$), 6 carbon bậc bốn ($>C<$) và 2 carbon $sp^2$. Tín hiệu tại $\delta_C\text{ }178.2\text{ ppm}$ chứng minh sự hiện diện của nhóm carboxyl ($-COOH$) ở vị trí C-28.
  • Các tương tác dị nhân HMBC giữa proton methyl H-24 với C-4 ($\delta_C\text{ }38.3$), C-3, C-5, C-23; giữa H-29, H-30 với C-19, C-20 xác nhận khung ursan-12-en.
• Kết luận: So sánh toàn bộ số liệu phổ $^{1}H$, $^{13}C\text{-NMR}$ với tài liệu tham khảo khẳng định hợp chất CIE8 là Acid ursolic (3$\beta$-hydroxyurs-12-en-28-oic acid).

2. Biện luận cấu trúc hợp chất CIE6 (Acid canophyllic)

• Hằng số vật lý và phổ khối: CIE6 có dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 298–299 °C (kết tinh trong $CHCl_3 - MeOH$). Trên SKLM ($CHCl_3 : MeOH = 50:1$), chất cho một vết duy nhất hiện màu vàng nhạt khi phun thuốc thử $H_2SO_4$ 50% gia nhiệt. Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử tại $m/z\text{ }[M-H]^- = 457.4$, tương ứng với công thức phân tử $C_{30}H_{48}O_3$.
• Phổ $^{1}H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$ (đo trong $CDCl_3 + MeOD$):
  • Phổ $^{1}H\text{-NMR}$ ghi nhận 7 nhóm methyl ($CH_3$) đều ở dạng mũi đơn (singlet) nằm ở vùng trường cao: $\delta_H$ 0.81 (3H, s, H-26), 0.85 (3H, s, H-25), 0.93 (3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-24), 1.00 (3H, s, H-27), 1.74 (3H, s, H-29), 1.93 (3H, s, H-30), đặc trưng cho khung triterpenoid friedelane.
  • Tín hiệu proton gắn nhóm hydroxyl xuất hiện dạng mũi đơn rộng tại $\delta_H\text{ }3.72\text{ ppm}\text{ }(1H, \text{brs}, H-3)$, liên kết trực tiếp với carbon hydroxymethine tại $\delta_C\text{ }72.0\text{ ppm}$ trên phổ $^{13}C\text{-NMR}$.
  • Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ và DEPT thể hiện tín hiệu của 30 carbon, trong đó có một tín hiệu ở trường rất yếu tại $\delta_C\text{ }181.6\text{ ppm}$ thuộc về nhóm carbonyl/carboxyl tại vị trí C-28. Không có tín hiệu carbon hay proton olefin $sp^2$, phù hợp với khung no friedelane.
  • Các tương tác HMBC giữa các nhóm methyl với các carbon lân cận (H-30 tương tác với C-20, C-19; H-26 tương tác với C-14, C-18) khẳng định khung cấu trúc.
• Kết luận: Đối chiếu số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối với công trình của S. Kundu (1994) cho phép xác định hợp chất CIE6 là Acid canophyllic ($3\beta$-hydroxyfriedelan-28-oic acid).

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

• Kết luận: Khóa luận đã xử lý thành công 3 kg lá mù u Trà Vinh, điều chế 400 g cao ethanol và 112 g cao chloroform. Từ cao chloroform, thông qua các bước sắc ký cột silica gel pha thường nhiều cấp, đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của hai hợp chất triterpenoid tinh khiết là Acid ursolic (CIE8, 21.4 mg) và Acid canophyllic (CIE6, 36.5 mg).
• Kiến nghị: Tác giả đề xuất tiếp tục mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học trên các phân đoạn cao còn lại (cao n-hexane, ethyl acetate, methanol và các phân đoạn CIB1–CIB5 của cao chloroform), đồng thời tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư, kháng viêm) trên các chất phân lập được.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp đặc tính hóa lý và cấu trúc các hợp chất phân lập

Đại lượng / Thông số	Hợp chất CIE8	Hợp chất CIE6
Tên hóa học xác định	Acid ursolic	Acid canophyllic
Khung cấu trúc	Triterpenoid khung ursan-12-en	Triterpenoid khung friedelane
Công thức phân tử	$C_{30}H_{48}O_3$	$C_{30}H_{48}O_3$
Khối lượng phân tử	456.7 g/mol	456.7 g/mol
Trạng thái cảm quan	Bột màu trắng	Tinh thể hình kim màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy	270–272 °C	298–299 °C
Hiện màu SKLM ($H_2SO_4$ 50%)	Vết màu tím đậm	Vết màu vàng nhạt
Dữ liệu ESI-MS chính	$m/z\text{ }479.4\text{ }[M+Na]^+$	$m/z\text{ }457.4\text{ }[M-H]^-$
Đặc trưng $^{1}H\text{-NMR}$	7 nhóm $CH_3$ (có mũi doublet), $\delta_H\text{ }5.14\text{ }(H-12)$	7 nhóm $CH_3$ (đều là singlet), $\delta_H\text{ }3.72\text{ }(H-3)$
Đặc trưng $^{13}C\text{-NMR}$	$\delta_C\text{ }124.5\text{ }(C-12), 138.2\text{ }(C-13), 178.2\text{ }(C-28)$	$\delta_C\text{ }72.0\text{ }(C-3), 181.6\text{ }(C-28)$
Khối lượng tinh chế thu được	21.4 mg	36.5 mg
Nguồn phân đoạn sắc ký	Phân đoạn B6 (CIB6222)	Phân đoạn B7 (CIB7212)

Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất

• Đóng góp khoa học: Cung cấp quy trình chiết xuất và dẫn liệu phổ nghiệm ($^{1}H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC, ESI-MS) đầy đủ, chính xác của hai hợp chất triterpenoid có hoạt tính sinh học cao (Acid ursolic và Acid canophyllic) phân lập trực tiếp từ nguồn nguyên liệu lá mù u sinh trưởng tại tỉnh Trà Vinh, Việt Nam.
• Giải pháp và kiến nghị: Đề xuất quy trình phân tách sắc ký cột silica gel kết hợp hệ dung môi rửa giải phân cực tăng dần ($CHCl_3 : MeOH$ và n-hexane : acetone) phù hợp để làm giàu và tinh sạch các hợp chất triterpene dạng acid từ thực vật họ Bứa / Măng cụt.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của khóa luận:
  • Nghiên cứu mới chỉ tập trung khảo sát thành phần phân đoạn cao chiết chloroform (cụ thể là hai phân đoạn CIB6 và CIB7), chưa tiến hành nghiên cứu thành phần của các phân đoạn cao chiết khác (n-hexane, ethyl acetate, methanol) cũng như các phân đoạn còn lại của cao chloroform (CIB1 đến CIB5).
  • Nghiên cứu dừng lại ở mức độ phân lập, tinh chế và biện luận cấu trúc hóa học, chưa có điều kiện thử nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học trực tiếp (in vitro) đối với các mẫu hợp chất sạch phân lập được tại Việt Nam.
• Hướng nghiên cứu mở rộng:
  • Tiếp tục chiết tách và phân lập các nhóm hoạt chất thứ cấp khác trong lá mù u như coumarine, xanthone và biflavonoid từ các phân đoạn cao chiết phân cực hơn.
  • Mở rộng khảo sát hóa thực vật trên các bộ phận khác của cây mù u (vỏ thân, rễ, hạt, nhựa thu hái tại Việt Nam).
  • Triển khai thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và ức chế các dòng tế bào ung thư trên các chất tinh khiết đã phân lập.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Công nghệ hóa học.
  • Các nhà nghiên cứu dược liệu quan tâm đến thành phần hóa học và tiềm năng ứng dụng của thực vật chi Calophyllum và họ Măng cụt (Guttiferae / Clusiaceae).
• Nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình chiết phân bố rắn - lỏng từ cao tổng cồn để thu nhận phân đoạn cao trung bình phân cực (chloroform).
  • Phương pháp phân tách sắc ký cột nhiều cấp sử dụng hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate, n-hexane : acetone và chloroform : methanol để thu nhận triterpenoid tinh khiết.
  • Phương pháp đối chiếu và biện luận hệ thống dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (HSQC, HMBC) để phân biệt khung cấu trúc triterpenoid loại ursan-12-en (Acid ursolic) và friedelane (Acid canophyllic).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật lá mù u trong nghiên cứu được thu hái tại địa phương nào và vào thời gian nào?

Mẫu lá mù u (Calophyllum inophyllum L.) phục vụ nghiên cứu được thu hái thực địa tại huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh vào tháng 7 năm 2010, sau đó được sơ chế sạch, phơi khô trong bóng râm và sấy ở nhiệt độ thấp trước khi nghiền nhỏ.

2. Từ 3 kg bột lá mù u khô đã điều chế được khối lượng các cao chiết ban đầu là bao nhiêu?

Quá trình ngâm dầm bột lá khô với ethanol 96° thu được 400 g cao ethanol thô. Sau khi tẩm cao cồn lên silica gel và trích ly phân bố rắn - lỏng với các dung môi tăng dần độ phân cực, tác giả thu được 112 g cao chloroform để phục vụ cho các bước sắc ký tiếp theo.

3. Hợp chất CIE8 được phân lập từ phân đoạn nào và có cấu trúc hóa học là gì?

Hợp chất CIE8 thu nhận được từ phân đoạn B6 (CIB6222) của cao chloroform với khối lượng 21.4 mg. Chất có dạng bột màu trắng, điểm nóng chảy 270–272 °C, khối phổ ESI-MS cho $m/z\text{ }479.4\text{ }[M+Na]^+$. Qua biện luận phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D, CIE8 được xác định là Acid ursolic (khung triterpenoid ursan-12-en).

4. Hợp chất CIE6 phân lập được có đặc điểm phổ nghiệm gì nổi bật và là chất gì?

Hợp chất CIE6 (36.5 mg) phân lập từ phân đoạn B7 (CIB7212) dạng tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng chảy 298–299 °C, công thức $C_{30}H_{48}O_3$ ($m/z\text{ }457.4\text{ }[M-H]^-$). Phổ $^{1}H\text{-NMR}$ ghi nhận 7 nhóm methyl singlet, không có nối đôi olefin và một nhóm $-CH-OH$ tại C-3 ($\delta_H\text{ }3.72\text{ ppm}, \delta_C\text{ }72.0\text{ ppm}$), nhóm carbonyl tại C-28 ($\delta_C\text{ }181.6\text{ ppm}$). CIE6 được xác định là Acid canophyllic (khung triterpenoid friedelane).

5. Khung cấu trúc hóa học của hai hợp chất CIE8 và CIE6 khác nhau căn bản ở điểm nào?

CIE8 (Acid ursolic) mang khung ursan-12-en đặc trưng với một liên kết đôi $C=C$ tại C-12/C-13 ($\delta_H\text{ }5.14\text{ ppm}, \delta_C\text{ }124.5\text{ ppm}$ và $138.2\text{ ppm}$) và chứa cả methyl dạng singlet lẫn doublet (H-29, H-30). Trong khi đó, CIE6 (Acid canophyllic) mang khung friedelane bão hòa không chứa nối đôi, toàn bộ 7 nhóm methyl đều là mũi đơn (singlet) trên phổ cộng hưởng từ proton.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Văn Quyết đã hoàn thành việc khảo sát thực nghiệm thành phần hóa học phân đoạn cao chloroform từ lá cây mù u (Calophyllum inophyllum L., họ Guttiferae) thu hái tại Trà Vinh. Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường nhiều giai đoạn, nghiên cứu đã phân lập thành công hai hợp chất sạch là Acid ursolic (21.4 mg) và Acid canophyllic (36.5 mg). Cấu trúc của hai dẫn xuất triterpenoid này đã được chứng minh sáng tỏ thông qua hệ thống dữ liệu phổ hiện đại gồm ESI-MS, $^{1}H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, HSQC và HMBC, đóng góp dữ liệu thực nghiệm có giá trị cho nghiên cứu hóa thực vật nguồn dược liệu Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU CHUNG "*! Cây mù u thuộc chi Calophylium, bao gồm khoảng 130 loài, là một trong những chỉ lớn nhất của họ Bứa. Phạm Hoàng Hộ, chi Calophyllum ở Việt Nam có tất cả 15 loài, được trồng hay mọc rải rác từ Bắc đến Nam. Các loài thuộc chỉ này thuộc loại đại mộc hay tiểu mộc, lá mọc đối, phiến lá thường láng, dày, gân song song, hoa vàng hay trắng, quả nhân cứng.

Chúng có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền như điều trị thắp khớp, đau nhức xương, lưng và đau mỏi chân tay, viêm gan, vàng da, trị dối loạn kinh nguyệt, đau bụng kinh, trị vết thương chảy máu. Một số dẫn xuất coumarin, xanthon, biflavonoid, và 2,3-dimetilchromanon trong chi Calophyllum qua nghiên cứu của y học hiện đại cho thấy có tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng HIV, chống ung bướu, cằm máu. ĐẶC DIEM THỰC VAT 471 - Tên thông thường: mù u. - Tên gọi khác: Đồng hồ, khung tung, khchyong (Campuchia).

- Tên khoa học: Caiophyllum inophyllum L. (Balsamaria inophyllum Lour. - Thuộc họ măng cụt (Guttiferae). SVTH: Bùi Văn Quyết 2 Khóa luận tết nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS.

Mai Đình Trị 1. Mô tả chung Mù u là một cây cao chừng 10-15 m đáng đẹp, lá mọc đối, mỏng, thon dài, phía cuống hoi thắt lại, đầu lá hơi tù, phiến lá dai 10-15 cm, rộng 5-8 cm, gân rất nhỏ, nhiều, chạy song song và nỗi rð cả hai mặt lá. Hoa khá to, thơm, màu trắng, mọc thành chùm xim ở kẽ lá hay đầu cành. Quả hạch, hình cầu, đường kính chừng 2,3 em khi chin có màu vàng nhạt, vỏ quả giữa mim, vỏ quả trong dày, cứng.

Hat có lá mầm chứa rất nhiều dầu. Mùa hoa: tháng 2-6, từ xa người ta phân biệt được cây mù ù với cây khác nhờ màu trắng đặc biệt của hoa, mùa quả chín: tháng 10-12. Vùng phân bố, thu hái Cây mù u có ưu điểm là dé trồng, dé mọc trên các loại dat, từ vùng đầm lầy, ven biển đến đổi trọc khô clin, cin được chọn lọc làm vật liệu phục hồi các hệ sinh thái phòng hộ vùng cát ven biển. Trên thé giới, cây mù u phan bố ở những vùng đất hoang gần biển trải dài từ châu Phi, An Độ, Sri Lanka, Thái Lan, Campuchia, Lào, Nam Trung Quốc, Hải Nam, Đài Loan, Indonesia, Úc và những Quần Đảo nam Thái Bình Dương.

Ở nước ta, cây mù u thường mọc hoang, tại những vùng đất cát gần bờ biển, và được tring ở nhiều tỉnh từ Kiến An cũ, Quảng Ninh đến Quảng Binh, Phan Thiết vào Vĩnh Long, My Tho, Sài Gòn, Thủ Dầu Một, Bà Rịa. Cây trồng bến năm bắt đầu cho quả. Năm đầu một cây cho khoảng 4 kg hạt, những năm sau từ 30-50 kg hạt. Ở các tỉnh phía Nam vụ thu hoạch tháng 1 1-12, vụ sau vào tháng 4-5 (trước mùa mưa).

Theo y học cỗ truyền Mii u được ứng dụng rất nhiều trong y học dân gian. Tắt cả các bộ phận của cây (vỏ, thân, lá, hat,.) đều được sử dụng. Nhựa mù u dùng bôi làm tan các chỗ sưng tay, chữa học sưng không nuốt được, mụn nhọt, vết loét nhiễm trùng, tai có mủ. Dầu mù u dùng trị ghẻ, nắm tóc và các bệnh về da nói chung, chữa viêm dây thần kinh trong bệnh cùi, các vết thương.

Cũng dùng bôi trị thấp khớp. Mù cây được làm lành sẹo, SVTH: Bùi Văn Quyết 3 Khóa luận tốt nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị nhất là để trị vết bỏng. Vỏ cây dùng trị đau dạ dày và xuất huyết bên trong.

Rễ được dùng để chữa viêm chân răng. Dau mù u pha với iod dùng để điều trị nhọt, mụn, dùng xoa bóp trị được các bệnh phong thấp, dùng chữa bỏng rất có hiệu quả.