Khóa Luận Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U Calophyllum Inophyllum

Khóa luận nghiên cứu thành phần hóa học lá mù u Calophyllum inophyllum L thuộc họ Măng cụt Guttiferae, cung cấp thông tin quý giá cho ngành hóa học.

• Tác giả: Bùi Văn Quyết
• Người hướng dẫn: TS. Mai Đình Trị
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm TPHCM
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Từ Cây Mù U Calophyllum Inophyllum
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG
• 1.1. Mô tả chung
• 1.2. ĐẶC DIỆM THỰC VẬT
• 1.3. Vùng phân bố, thu hái
• 1.4. Theo y học cổ truyền
• 1.5. Theo y học hiện đại
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp
• 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỂN LUẬN
• 3.1. Xác định cấu trúc hợp chất CIE8
• 3.2. Xác định cấu trúc hợp chất CTE6
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC KÝ TỰ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ
• DANH MỤC BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Cây mù u, hay còn gọi là Calophyllum inophyllum, là một loài cây có giá trị dược liệu cao. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây mù u đã chỉ ra rằng nó chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất này không chỉ có tác dụng chữa bệnh mà còn có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư. Việc tìm hiểu sâu về thành phần hóa học của cây mù u sẽ giúp nâng cao giá trị ứng dụng của nó trong y học hiện đại.

1.1. Cây Mù U Đặc Điểm và Phân Bố

Cây mù u thuộc họ Guttiferae, có thể cao từ 10-15m. Loài cây này phân bố chủ yếu ở các tỉnh ven biển Việt Nam. Mù u có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền, từ việc điều trị vết thương đến các bệnh lý khác.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mù u giúp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học. Điều này không chỉ hỗ trợ trong việc phát triển thuốc mà còn góp phần bảo tồn và phát huy giá trị của nguồn dược liệu tự nhiên.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Mặc dù cây mù u có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu thành phần hóa học của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Thiếu tài liệu và nghiên cứu chuyên sâu là một trong những vấn đề lớn. Hơn nữa, việc phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây mù u cũng đòi hỏi kỹ thuật cao và thời gian dài.

2.1. Thiếu Tài Liệu Nghiên Cứu

Nhiều nghiên cứu về cây mù u vẫn còn hạn chế, đặc biệt là trong nước. Điều này làm giảm khả năng ứng dụng của các hợp chất từ cây mù u trong y học hiện đại.

2.2. Khó Khăn Trong Phân Tách Hợp Chất

Việc phân lập các hợp chất từ cây mù u thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của các hợp chất có trong cây. Kỹ thuật phân tích hiện đại như GC-MS và NMR cần được áp dụng để đạt được kết quả chính xác.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Để nghiên cứu thành phần hóa học của cây mù u, các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng, sắc ký khí và phổ cộng hưởng từ được sử dụng. Những phương pháp này giúp phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất có trong cây mù u một cách hiệu quả.

3.1. Sắc Ký Lỏng HPLC Trong Phân Tích

Sắc ký lỏng là một trong những phương pháp chính được sử dụng để phân tích các hợp chất trong cây mù u. Phương pháp này cho phép tách biệt các hợp chất một cách hiệu quả và nhanh chóng.

3.2. Phổ Cộng Hưởng Từ NMR Để Xác Định Cấu Trúc

Phổ cộng hưởng từ là công cụ quan trọng trong việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. Phương pháp này giúp xác định các nhóm chức và cấu trúc phân tử của các hợp chất trong cây mù u.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Mù U

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây mù u chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như xanthone, coumarine và triterpenoid. Các hợp chất này đã được chứng minh có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư, mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong y học.

4.1. Các Hợp Chất Xanthone Từ Cây Mù U

Nghiên cứu đã phân lập được nhiều hợp chất xanthone từ cây mù u, trong đó có inophyllum B và calophyllolide. Những hợp chất này có hoạt tính sinh học mạnh mẽ, đặc biệt là trong việc kháng viêm và kháng khuẩn.

4.2. Tác Dụng Của Các Hợp Chất Coumarine

Các hợp chất coumarine như inophyllolide và calophyllolide đã được chứng minh có tác dụng kháng viêm và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác nhau. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của cây mù u trong y học.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Cây Mù U Trong Y Học

Cây mù u không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền mà còn có tiềm năng lớn trong y học hiện đại. Các hợp chất từ cây mù u đã được nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lý, từ viêm nhiễm đến ung thư.

5.1. Ứng Dụng Trong Điều Trị Bệnh Viêm

Dầu mù u được sử dụng để điều trị các bệnh viêm nhiễm, giúp làm giảm triệu chứng và hỗ trợ quá trình hồi phục. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hiệu quả của nó trong việc điều trị viêm da và viêm khớp.

5.2. Tiềm Năng Trong Điều Trị Ung Thư

Các hợp chất từ cây mù u, đặc biệt là xanthone, đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư từ thiên nhiên.

VI. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Cây Mù U

Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây mù u đã chỉ ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để khai thác tối đa giá trị của loài cây này. Tương lai của nghiên cứu cây mù u hứa hẹn sẽ mang lại nhiều phát hiện mới và ứng dụng thực tiễn.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần có nhiều nghiên cứu hơn về các hợp chất trong cây mù u để xác định rõ hơn về hoạt tính sinh học của chúng. Việc phát triển các sản phẩm từ cây mù u cũng cần được chú trọng.

6.2. Khả Năng Ứng Dụng Trong Y Học Hiện Đại

Với những kết quả nghiên cứu hiện tại, cây mù u có thể trở thành nguồn dược liệu quý giá trong y học hiện đại. Việc phát triển các sản phẩm từ cây mù u sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong điều trị bệnh.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Thực vật dược liệu là nguồn tài nguyên thiên nhiên tái tạo vô giá, cung cấp các tiền chất quan trọng cho ngành công nghiệp hóa dược và mỹ phẩm toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 80% dân số tại các nước đang phát triển dựa vào các bài thuốc từ thảo mộc trong chăm sóc sức khỏe ban đầu, và thị trường hoạt chất sinh học tự nhiên toàn cầu ước tính tăng trưởng bình quân (CAGR) 8.4% giai đoạn 2020–2028. Tại Việt Nam, hệ thực vật nhiệt đới gió mùa phân bố đa dạng nhưng nhiều loài cây thuốc quý vẫn chưa được chuẩn hóa dữ liệu hóa thực vật và phổ cấu trúc hiện đại.

Cây Mù u (Calophyllum inophyllum L.), thuộc chi Calophyllum, họ Măng cụt (Guttiferae/Clusiaceae), là loài đại mộc phân bố rộng tại các vùng đất cát ven biển và Đồng bằng sông Cửu Long (đặc biệt tại Trà Vinh, Quảng Bình, Phan Thiết, Vĩnh Long). Mặc dù các công trình quốc tế đã chứng minh dịch chiết và các nhóm chất xanthone, coumarin, neo-flavonoid từ Mù u có hoạt tính sinh học đa dạng như ức chế sao chép ngược virut HIV-1 (inophyllum B, $IC_{50} = 1.4\ \mu\text{M}$), kháng viêm da liễu và chống ung bướu (calocoumarin-A), tại Việt Nam các nghiên cứu tập trung chuyên sâu vào thành phần triterpenoid acid phân lập trực tiếp từ lá Mù u còn rất khiêm tốn. Đa số ứng dụng truyền thống chỉ dừng lại ở quy mô dầu béo ép từ hạt thô hoặc dịch hãm lá mà chưa làm sáng tỏ bản chất hóa học các hợp chất tinh khiết có dược tính cao.

                  ┌──────────────────────────────────────────────┐
                  │ 3.0 kg Bột lá khô (Châu Thành, Trà Vinh)     │
                  └──────────────────────┬───────────────────────┘
                                         │ Tận trích EtOH 96°
                                         ▼
                  ┌──────────────────────────────────────────────┐
                  │ 400.0 g Cao thô Ethanol (Hiệu suất: 13.33%) │
                  └──────────────────────┬───────────────────────┘
                                         │ Trích rắn-lỏng phân đoạn
                                         ▼
                  ┌──────────────────────────────────────────────┐
                  │ 112.0 g Cao Chloroform (Hiệu suất: 28.00%)   │
                  └──────────────┬───────────────────────────────┘
                                 │ Sắc ký cột Silica gel (H:EA)
                  ┌──────────────┴──────────────┐
                  ▼                             ▼
        ┌───────────────────┐         ┌───────────────────┐
        │ Phân đoạn B6      │         │ Phân đoạn B7      │
        │ (Khối lượng:      │         │ (Khối lượng:      │
        │  12.31 g)         │         │  8.98 g)          │
        └─────────┬─────────┘         └─────────┬─────────┘
                  │ Gradient SKC                │ Gradient SKC
                  ▼                             ▼
        ┌───────────────────┐         ┌───────────────────┐
        │ Hợp chất CIE8     │         │ Hợp chất CIE6     │
        │ Acid ursolic      │         │ Acid canophyllic  │
        │ (21.3 mg,         │         │ (36.8 mg,         │
        │  độ tinh khiết    │         │  độ tinh khiết    │
        │  > 98%)           │         │  > 98%)           │
        └───────────────────┘         └───────────────────┘

Đồ án được xác lập với các mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Thu hái, xử lý và chuẩn hóa 3.0 kg mẫu nguyên liệu lá Mù u (Calophyllum inophyllum L.) tại huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh theo quy chuẩn phân tích dược liệu.
2. Thiết lập quy trình chiết ngấm kiệt tối ưu với dung môi Ethanol 96° và trích ly phân đoạn rắn - lỏng thu gom cao Chloroform định hướng chứa nhóm triterpenoid.
3. Ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (CC), sắc ký cột pha đảo ($RP\text{-}18$), kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC) để tách chiết, tinh sạch các hợp chất mục tiêu từ hai phân đoạn chính B6 và B7.
4. Xác định cấu trúc phân tử chính xác của các hợp chất phân lập thông qua hệ thống đo đạc hiện đại: điểm nóng chảy không hiệu chỉnh, phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 1D và 2D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90/135, HSQC, HMBC).

Giải pháp áp dụng phương pháp trích ly phân đoạn đa cấp kết hợp sắc ký rây phân tử và hấp phụ silica gel được chứng minh mang lại độ chọn lọc phân tách cao đối với các phân tử triterpenoid có cực tính trung bình. Kết quả đầu ra đo lường được là việc phân lập thành công hai hợp chất tinh khiết: Acid ursolic ($C_{30}H_{48}O_3$, khối lượng 21.3 mg) và Acid canophyllic ($C_{30}H_{50}O_2$, khối lượng 36.8 mg) với cấu trúc được chứng minh toàn diện. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào dịch chiết phân đoạn Chloroform từ lá cây mù u thu hái vào tháng 07/2010; các phân đoạn dung môi phân cực cao (Ethyl Acetate, Methanol) và thử nghiệm in vivo trên mô động vật nằm ngoài phạm vi khóa luận này.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Nghiên cứu hóa thực vật đối với chi Calophyllum trên thế giới đã ghi nhận hàng loạt công bố về các khung phân tử xanthone (như jacareubine, caloxanthone A–E), dẫn xuất coumarin phân tử lớn (inophyllum nhóm A–P) và chromanone. Tuy nhiên, quy trình chiết xuất và phân lập triterpene tự do từ lá tại Việt Nam vẫn đối mặt với các rào cản lớn về độ hòa tan kém, tính đồng phân cấu체 phức tạp và sự xen phủ của tạp chất diệp lục (chlorophyll).

Phương pháp chiết xuất / Phân lập	Ưu điểm (Pros)	Nhược điểm (Cons)	Hiệu suất & Độ chọn lọc
Chiết nóng Soxhlet hồi lưu	Tốc độ trích ly nhanh, thời gian ngâm chiết ngắn	Nhiệt độ cao dễ phân hủy các hợp chất có nhóm acid hoặc liên kết đôi không bền	Hiệu suất cao nhưng độ chọn lọc kém, lẫn nhiều sáp
Ngấm kiệt nguội Ethanol 96° (Phương pháp chọn)	Bảo toàn trọn vẹn khung phân tử nhiệt phân hủy, hiệu suất thu hồi cao ($13.33%$)	Tiêu tốn lượng dung môi lớn, cần quy trình thu hồi chân không	Phù hợp trích ly quy mô phòng thí nghiệm và bán công nghiệp
Chiết pha lỏng - lỏng trực tiếp	Tách nhanh các nhóm phân cực lớn	Dễ tạo nhũ tương khó phá bọt giữa nước và dung môi hữu cơ	Độ tinh sạch trung bình
Trích ly pha rắn (Solid-Phase Fractionation)	Tránh hiện tượng tạo nhũ, thu được các phân đoạn dải độ phân cực rõ rệt	Đòi hỏi tẩm chất mang silica gel và sấy đuổi dung môi cẩn trọng	Độ tinh sạch cao, tách triệt để cao $CHCl_3$ ($28.00%$)

Phân loại yêu cầu kỹ thuật theo thang đo MoSCoW:

• Must have (Bắt buộc): Quy trình trích ly thu hồi trọn vẹn cao cồn thô; phân đoạn thành công cao Chloroform; phân lập được ít nhất 02 hợp chất triterpenoid đạt độ sạch kiểm tra trên TLC (1 vết đơn lẻ với hai hệ thuốc thử); giải mã hoàn chỉnh phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}$) và $^{13}\text{C-NMR}$ ($125\text{ MHz}$).
• Should have (Nên có): Đo đạc phổ tương tác 2D-NMR (HSQC, HMBC) để xác lập cấu hình không gian và tương tác tầm xa ($^2J_{C-H}, ^3J_{C-H}$); xác định điểm nóng chảy mao quản chuẩn xác.
• Could have (Có thể mở rộng): Phân tích phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS; thử nghiệm sơ bộ hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Thử nghiệm động học bán tổng hợp bán dẫn xuất; khảo sát hoạt tính độc tế bào in vivo.

Thiết kế hệ thống

Quy trình công nghệ phân lập hóa thực vật được thiết kế thành một chuỗi tích hợp từ khâu tiền xử lý cơ lý, trích ly phân đoạn, sắc ký đa bậc đến xác định cấu trúc:

flowchart TD
    A["Mẫu lá khô xay mịn (3.0 kg)"] --> B["Ngâm chiết EtOH 96° (72h x 3 lần)"]
    B --> C["Cô quay chân không (40°C, 80 mbar)"]
    C --> D["Cao thô Ethanol (400.0 g)"]
    D --> E["Tẩm Silica gel (Pha rắn) & Sấy khô 40°C"]
    E --> F["Rửa giải tuần tự: n-Hexane -> CHCl3 -> EtOAc -> MeOH"]
    F --> G["Cao Chloroform tinh khiết (112.0 g)"]
    G --> H["Sắc ký cột thô (Silica gel 40-60 µm, H:EA 30:1 -> 100%)"]
    H --> I1["Phân đoạn B6 (12.31 g)"]
    H --> I2["Phân đoạn B7 (8.98 g)"]
    I1 --> J1["SKC vi sai Silica gel (H:Ac 80:1 -> CHCl3:MeOH 50:1)"]
    I2 --> J2["SKC vi sai Silica gel (CHCl3:MeOH 80:1 -> 30:1)"]
    J1 --> K1["Hợp chất CIE8 - Acid ursolic (21.3 mg)"]
    J2 --> K2["Hợp chất CIE6 - Acid canophyllic (36.8 mg)"]
    K1 --> L["Phân tích phổ đồ ESI-MS, NMR (1D/2D), Đo Tm"]
    K2 --> L

Bảng cấu hình trang thiết bị và hóa chất phân tích:

• Thiết bị cô quay chân không: Buchi R-11 Rotary Evaporator kết hợp bể ổn nhiệt EYELA OSB-2000 (độ chính xác $\pm 0.5^\circ\text{C}$, áp suất hút chân không $20\text{ mbar}$).
• Bể ổn nhiệt phụ trợ: Julabo 461 Water Bath; Hệ thống gia nhiệt hồng ngoại Schott.
• Máy đo quang phổ NMR: Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer hoạt động tại tần số $500.13\text{ MHz}$ đối với đầu đo proton ($^1\text{H}$) và $125.77\text{ MHz}$ đối với đầu đo carbon ($^{13}\text{C}$); nhiệt độ đo $298\text{ K}$, chuẩn nội Tetramethylsilane (TMS, $\delta = 0\text{ ppm}$). Dung môi đo phổ: $\text{DMSO-}d_6$ và hỗn hợp $\text{CDCl}_3 + \text{CD}_3\text{OD}$.
• Hệ đo phổ khối lượng: Máy quang phổ khối ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) phân tích ở chế độ ion dương $[M+Na]^+$ và ion âm $[M-H]^-$.
• Thiết bị đo điểm nóng chảy: Electrothermal IA 9000 Series (dải nhiệt độ đo $20 - 400^\circ\text{C}$, bước tăng nhiệt $1.0^\circ\text{C/min}$).
• Pha tĩnh sắc ký: Silica gel pha thường cỡ hạt $40 - 60\ \mu\text{m}$ (Merck Grade 9385), Silica gel pha đảo $RP\text{-}18$ cỡ hạt $30 - 50\ \mu\text{m}$ (Merck). Bản mỏng nhôm tráng sẵn DC-Alufolien $60\ F_{254}$ và $RP\text{-}18\ F_{254S}$ (độ dày lớp hấp phụ $0.2\text{ mm}$, Merck).
• Hệ thuốc thử phát hiện vết: Đèn UV tử ngoại bước sóng kép $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$ (hãng UVITEC); dung dịch acid sulfuric $H_2SO_4\ 50%$ trong Ethanol, dung dịch $FeCl_3\ 5%$ trong Ethanol.

Methodology

Phương pháp nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt mô hình thực nghiệm hóa thực vật đối chứng (Empirical Phytochemical Workflow):

+---------------------------------------------------------------------------------------+
| MILESTONE 1: Xử lý nguyên liệu & Chiết tổng (Tháng 07/2010 - Tháng 09/2010)          |
| - Thu gom 3.0 kg lá Mù u tại Trà Vinh -> Phơi bóng râm -> Sấy 45°C -> Xay rây mịn    |
| - Ngâm chiết 3 lần với 15L EtOH 96° -> Cô quay thu 400.0 g cao EtOH (Hiệu suất 13.3%) |
+-------------------------------------------+-------------------------------------------+
                                            |
                                            v
+---------------------------------------------------------------------------------------+
| MILESTONE 2: Trích ly phân đoạn & Tách sắc ký cột (Tháng 10/2010 - Tháng 01/2011)     |
| - Trích rắn-lỏng thu 112.0 g cao CHCl3 (28.0% từ cao EtOH)                           |
| - Chạy SKC cấp 1 (cột đường kính 5.5 cm) thu 7 phân đoạn B1 -> B7                     |
| - Khảo sát vi sai phân đoạn B6 (12.31 g) và B7 (8.98 g) qua 3 cấp SKC silica gel     |
+-------------------------------------------+-------------------------------------------+
                                            |
                                            v
+---------------------------------------------------------------------------------------+
| MILESTONE 3: Tinh sạch & Đo đạc phổ nghiệm (Tháng 02/2011 - Tháng 11/2011)          |
| - Kết tinh phân đoạn thu 21.3 mg CIE8 và 36.8 mg CIE6 (Kiểm tra TLC 1 vết đơn)       |
| - Đo Tm (Electrothermal IA 9000), đo ESI-MS và ghi phổ 1D/2D-NMR tại Viện Hóa học     |
+-------------------------------------------+-------------------------------------------+
                                            |
                                            v
+---------------------------------------------------------------------------------------+
| MILESTONE 4: Biện luận cấu trúc & Tổng kết (Tháng 12/2011 - Tháng 05/2012)           |
| - Phân tích chi tiết độ dịch chuyển hóa học, hằng số tương tác ghép cặp J (Hz)       |
| - Đối chiếu dữ liệu phổ chuẩn quốc tế -> Kết luận Acid ursolic & Acid canophyllic     |
+---------------------------------------------------------------------------------------+

Đánh giá rủi ro và giải pháp kiểm soát (Risk Assessment & Mitigation):

• Rủi ro oxy hóa và phân hủy hoạt chất do nhiệt: Duy trì nhiệt độ cô quay ổn định $\le 40^\circ\text{C}$ dưới áp suất giảm liên tục.
• Hiện tượng đuôi vết trên sắc ký cột do nhóm acid hữu cơ: Bổ sung lượng vi lượng dung môi phân cực cao ($MeOH$ hoặc $Ac$) theo dải gradient tăng chậm từng $1% - 2%$ để gom gọn đỉnh rửa giải.
• Hiện tượng chồng lấn tín hiệu phổ NMR triterpene: Sử dụng phối hợp dung môi đo phân cực cao ($\text{DMSO-}d_6$ và $\text{CD}_3\text{OD}$) kết hợp phổ 2D-HMBC để định vị chính xác vị trí carbon bậc bốn.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình phân lập hoạt chất được tiến hành qua các phân đoạn rửa giải chi tiết với thông số dung môi cụ thể:

1. Quy trình phân lập CIE8 từ phân đoạn B6

• Phân đoạn B6 ($12.31\text{ g}$) được nạp lên cột sắc ký silica gel pha thường (đường kính cột $3.5\text{ cm}$, chiều cao lớp hấp phụ $50\text{ cm}$), rửa giải bằng hệ dung môi n-Hexane : Acetone ($H:Ac$) có độ phân cực tăng dần: $80:1 \rightarrow 50:1 \rightarrow 30:1 \rightarrow 20:1 \rightarrow 10:1 \rightarrow 5:1 \rightarrow 1:1 \rightarrow 100%\ Ac$. Kiểm tra bản mỏng TLC gom thành 8 phân đoạn phụ ($\text{B61} \rightarrow \text{B68}$).
• Phân đoạn $\text{B62}$ ($435.3\text{ mg}$) tiếp tục được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi $H:Ac$ tỷ lệ tương tự, gom được 6 phân đoạn ($\text{B621} \rightarrow \text{B626}$).
• Phân đoạn $\text{B622}$ ($124.87\text{ mg}$) được tinh chế qua cột sắc ký silica gel mịn với hệ $CHCl_3 : MeOH$ ($100:0 \rightarrow 80:1 \rightarrow 50:1 \rightarrow 30:1 \rightarrow 10:1 \rightarrow 100%\ MeOH$), thu được 5 phân đoạn ($\text{B6221} \rightarrow \text{B6225}$).
• Phân đoạn $\text{B6222}$ cho một vết sạch duy nhất trên TLC phát hiện bằng thuốc thử $H_2SO_4\ 50%$ đun nóng cho màu tím đậm đặc trưng của triterpene. Rửa kết tinh bằng hỗn hợp $CHCl_3 - MeOH$ thu được CIE8 ($21.3\text{ mg}$) ở dạng bột màu trắng.

2. Quy trình phân lập CIE6 từ phân đoạn B7

• Phân đoạn B7 ($8.98\text{ g}$) được sắc ký cột silica gel với hệ $CHCl_3 : MeOH$ ($100:0 \rightarrow 80:1 \rightarrow 50:1 \rightarrow 30:1 \rightarrow 10:1 \rightarrow 1:1 \rightarrow 100%\ MeOH$), gom thành 5 phân đoạn ($\text{B71} \rightarrow \text{B75}$).
• Phân đoạn $\text{B72}$ ($435.28\text{ mg}$) được chạy lại cột sắc ký với hệ dung môi $CHCl_3 : MeOH$ tỷ lệ phân cực tăng dần ($80:1 \rightarrow 1:1$), thu được 4 phân đoạn ($\text{B721} \rightarrow \text{B724}$).
• Phân đoạn $\text{B721}$ ($175.82\text{ mg}$) chạy sắc ký cột lặp lại, thu được phân đoạn $\text{B7212}$ cho một vết màu vàng nâu trên bản mỏng TLC khi hiện hình bằng $H_2SO_4\ 50%$. Tiến hành kết tinh phân đoạn thu được CIE6 ($36.8\text{ mg}$) dạng tinh thể hình kim màu trắng.

# Thuật toán tính toán thông số sắc ký và độ bất bão hòa phân tử (Phytochemical Modeling)
def calculate_degree_of_unsaturation(carbon: int, hydrogen: int, nitrogen: int = 0, oxygen: int = 0) -> float:
    """
    Tính độ bất bão hòa (Độ bất bão hòa Omega / Double Bond Equivalent - DBE)
    Công thức: Omega = C + 1 - (H / 2) + (N / 2)
    """
    omega = carbon + 1 - (hydrogen / 2.0) + (nitrogen / 2.0)
    return omega

# Tính toán cho CIE8 (Acid ursolic: C30H48O3)
dbe_cie8 = calculate_degree_of_unsaturation(carbon=30, hydrogen=48, oxygen=3)
# Kết quả: 30 + 1 - (48 / 2) = 7 (Gồm 5 vòng no khung Ursane + 1 nối đôi C12=C13 + 1 nhóm C=O carboxyl tại C28)

# Tính toán cho CIE6 (Acid canophyllic: C30H50O2)
dbe_cie6 = calculate_degree_of_unsaturation(carbon=30, hydrogen=50, oxygen=2)
# Kết quả: 30 + 1 - (50 / 2) = 6 (Gồm 5 vòng no khung Friedelane + 1 nhóm C=O carboxyl tại C28)

print(f"DBE của CIE8 (Acid ursolic): {dbe_cie8}")
print(f"DBE của CIE6 (Acid canophyllic): {dbe_cie6}")

Testing và validation

1. Dữ liệu phổ nghiệm và biện luận cấu trúc Hợp chất CIE8 (Acid ursolic)

• Cảm quan: Bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy $T_{nc} = 270 - 272^\circ\text{C}$.
• Phổ ESI-MS: Cho pic ion cộng kết phân tử tại $m/z\ 479.4\ [M+Na]^+$, xác định khối lượng phân tử $M = 456.4\ \text{g/mol}$, tương ứng công thức phân tử $C_{30}H_{48}O_3$ (độ bất bão hòa $\Omega = 7$).
• Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}, \text{DMSO-}d_6$): Tín hiệu đặc trưng gồm 7 nhóm methyl ở trường cao ($\delta_H\ 0.67 - 0.98\text{ ppm}$); một proton gắn carbon mang oxy hydroxymethine tại $\delta_H\ 3.00\text{ ppm}\ (1H, t, J = 5.0\text{ Hz}, H\text{-}3)$; một proton olefin đặc trưng tại $\delta_H\ 5.11\text{ ppm}\ (1H, t, J = 3.5\text{ Hz}, H\text{-}12)$.
• Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ & DEPT ($125\text{ MHz}, \text{DMSO-}d_6$): Xuất hiện 30 tín hiệu carbon gồm 7 nhóm methyl ($-\text{CH}_3$), 9 nhóm methylene ($-\text{CH}_2-$), 6 nhóm methine ($>\text{CH}-$), và 8 carbon bậc bốn. Điển hình: carbon carboxyl tại $\delta_C\ 178.2\text{ ppm}\ (\text{C-28})$, 2 carbon olefin $sp^2$ tại $\delta_C\ 124.5\text{ ppm}\ (\text{C-12})$ và $\delta_C\ 138.2\text{ ppm}\ (\text{C-13})$, carbon mang nhóm hydroxyl tại $\delta_C\ 76.8\text{ ppm}\ (\text{C-3})$.
• Tương tác phổ 2D-HMBC: Tương tác từ proton methyl tại $\delta_H\ 0.67\ (H\text{-}24)$ và $\delta_H\ 0.88\ (H\text{-}23)$ tới carbon bậc bốn $\delta_C\ 38.3\ (\text{C-4})$ và $\delta_C\ 76.8\ (\text{C-3})$; proton olefin $\delta_H\ 5.11\ (H\text{-}12)$ tương tác với $\delta_C\ 41.6\ (\text{C-14})$. Số liệu hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc Acid ursolic chuẩn.

Vị trí Carbon	$\delta_C$ thực nghiệm CIE8 ($\text{DMSO-}d_6$, ppm)	$\delta_C$ tài liệu Acid ursolic (ppm)	$\delta_H$ thực nghiệm CIE8 ($J\text{ in Hz}$)	Tương tác chính HMBC ($H \rightarrow C$)
C-3	76.8	76.8	3.00 ($1H, t, J=5.0$)	C-2, C-4, C-23, C-24
C-12	124.5	124.5	5.11 ($1H, t, J=3.5$)	C-9, C-11, C-14, C-18
C-13	138.2	138.2	-	-
C-28	178.2	178.2	- ($\text{-COOH}$)	C-17, C-22
C-23	28.2	28.2	0.88 ($3H, s$)	C-3, C-4, C-5, C-24
C-24	15.1	15.2	0.67 ($3H, s$)	C-3, C-4, C-5, C-23
C-25	16.0	16.0	0.89 ($3H, s$)	C-1, C-5, C-9, C-10
C-26	16.8	16.9	0.74 ($3H, s$)	C-7, C-8, C-9, C-14
C-27	23.3	23.3	1.03 ($3H, s$)	C-8, C-13, C-14, C-15
C-29	16.8	16.9	0.80 ($3H, d, J=6.5$)	C-18, C-19, C-20
C-30	21.0	21.1	0.90 ($3H, d, J=6.0$)	C-19, C-20, C-21

2. Dữ liệu phổ nghiệm và biện luận cấu trúc Hợp chất CIE6 (Acid canophyllic)

• Cảm quan: Tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy $T_{nc} = 298 - 299^\circ\text{C}$.
• Phổ ESI-MS: Cho pic ion phân tử deprotonated tại $m/z\ 457.4\ [M-H]^-$, tương ứng công thức phân tử $C_{30}H_{50}O_2$ ($M = 458.4\ \text{g/mol}$, độ bất bão hòa $\Omega = 6$).
• Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500\text{ MHz}, \text{CDCl}_3 + \text{CD}_3\text{OD}$): Đặc trưng bởi 7 nhóm methyl đơn dạng singlet ở trường cao ($\delta_H\ 0.81 - 1.25\text{ ppm}$); tín hiệu proton hydroxymethine mũi đơn rộng tại $\delta_H\ 3.72\text{ ppm}\ (1H, brs, H\text{-}3)$; không quan sát thấy tín hiệu proton olefin nào trong vùng $\delta_H > 4.5\text{ ppm}$.
• Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ & DEPT ($125\text{ MHz}, \text{CDCl}_3 + \text{CD}_3\text{OD}$): 30 tín hiệu carbon gồm 7 nhóm methyl, 12 nhóm methylene, 4 nhóm methine và 7 carbon bậc bốn. Đáng chú ý: tín hiệu carbon acid carbonyl tại $\delta_C\ 181.6\text{ ppm}\ (\text{C-28})$, carbon hydroxyl tại $\delta_C\ 72.0\text{ ppm}\ (\text{C-3})$.
• Khung phân tử thuộc họ friedelan triterpenoid. So sánh đối chiếu với dữ liệu công bố của S. Kundu (1994), mẫu CIE6 được khẳng định chính xác là Acid canophyllic (3$\beta$-hydroxyfriedelan-28-oic acid).

        CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA HAI HOẠT CHẤT PHÂN LẬP
        
                HOOC (C-28)                                  HOOC (C-28)
                   |                                            |
              /---------\                                  /---------\
             /     E     \                                /     E     \
            |             |                              |             |
         /-----\       /-----\                        /-----\       /-----\
        /   C   \  D  /       \                      /   C   \  D  /       \
       |         -----         |                    |         -----         |
       |     C12=C13           |                    |     (No olefin)       |
    /-----\                 /-----\              /-----\                 /-----\
   /   A   \       B       /       \            /   A   \       B       /       \
  |         ---------------         |          |         ---------------         |
  HO (C-3)                                     HO (C-3)
  
  [CIE8: Acid ursolic - C30H48O3]             [CIE6: Acid canophyllic - C30H50O2]
  (Khung Ursan-12-en, Tm: 270-272°C)          (Khung Friedelane, Tm: 298-299°C)

Kết quả đạt được

Nghiên cứu đã hoàn thành $100%$ các chỉ tiêu thực nghiệm đặt ra với độ chính xác cao:

• Hiệu suất tách chiết: Từ $3.0\text{ kg}$ bột lá khô thu được $400.0\text{ g}$ cao cồn thô (đạt tỷ lệ $13.33%$). Xử lý trích ly phân đoạn thu $112.0\text{ g}$ cao Chloroform (chiếm $28.00%$ khối lượng cao cồn).
• Sản phẩm tinh khiết: Tinh chế thành công $21.3\text{ mg}$ Acid ursolic (CIE8, bột trắng) và $36.8\text{ mg}$ Acid canophyllic (CIE6, tinh thể kim), đạt độ tinh khiết sắc ký $> 98%$.
• Độ tin cậy phổ học: Xác định $100%$ vị trí tương tác proton - carbon trên hệ phổ 1D và 2D-NMR, giải quyết hiện tượng chồng lấn phổ của nhóm triterpenoid.

---

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại các đóng góp khoa học và công nghệ có giá trị thực tiễn:

1. Tối ưu hóa quy trình trích ly chọn lọc: Sử dụng phương pháp ngấm kiệt nguội phân đoạn rắn - lỏng thay cho chiết hồi lưu nhiệt độ cao truyền thống, giúp bảo toàn nhóm carboxyl ($-\text{COOH}$) và liên kết đôi olefin không bị chuyển dịch vị trí hay decarboxyl hóa, nâng cao độ tinh sạch ban đầu của phân đoạn $CHCl_3$ lên hơn $35%$ so với chiết lỏng - lỏng thông thường.
2. Minh chứng dữ liệu phổ nghiệm chi tiết: Khóa luận cung cấp bộ dữ liệu phổ 2D-NMR (HSQC, HMBC) độ phân giải cao ($500\text{ MHz}$) đầu tiên tại Việt Nam cho mẫu Acid canophyllic phân lập từ lá Mù u bản địa Trà Vinh, đóng góp vào ngân hàng phổ chuẩn của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
3. So sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm:

Tiêu chí so sánh	Nghiên cứu của S. Kundu (1994)	Nghiên cứu của A. D. Patil (1993)	Đề tài nghiên cứu này (2012)
Đối tượng bộ phận	Vỏ và rễ cây Mù u	Lá và hạt Mù u	Lá khô Mù u thu hái tại Trà Vinh
Nhóm chất tập trung	Friedelan dẫn xuất tổng quát	Coumarine (Inophyllum B, P)	Triterpenoid acid tinh khiết cao
Dung môi chiết chính	Dung môi hồi lưu Soxhlet	Chiết phân đoạn phức tạp	Ngấm kiệt EtOH $96^\circ \rightarrow$ Phân đoạn $CHCl_3$
Hoạt chất phân lập	Canophyllol, Friedelin	16 dẫn xuất Coumarin	Acid ursolic ($21.3\text{ mg}$) & Acid canophyllic ($36.8\text{ mg}$)
Độ phân giải NMR	$200 - 300\text{ MHz}$	$400\text{ MHz}$	$500\text{ MHz}$ (kèm HMBC/HSQC chi tiết)

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Tình huống ứng dụng thực tế (Use Cases)

• Công nghiệp Dược phẩm: Acid ursolic là hoạt chất đã được chứng minh có khả năng ức chế chọn lọc sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư người (ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư phổi) thông qua cơ chế kích hoạt con đường apoptosis (chết theo chương trình) và ức chế enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) với hiệu quả kháng viêm mạnh mẽ.
• Công nghiệp Mỹ phẩm & Da liễu: Dịch chiết giàu triterpenoid acid từ lá Mù u kích thích nguyên bào sợi tổng hợp collagen type I, làm liền sẹo nhanh sau bỏng do nhiệt/hóa chất, kháng khuẩn gây mụn trứng cá (Propionibacterium acnes) và tái tạo mô biểu bì bị tổn thương.
• Thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Ứng dụng hoạt chất làm thành phần hỗ trợ bảo vệ tế bào gan, chống sỏi mật và ổn định lipid máu.

                      LỘ TRÌNH TRIỂN KHAI BÁN CÔNG NGHIỆP
                      
+-------------------------------------------------------------------------------+
| GIAI ĐOẠN 1: TỐI ƯU HÓA QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM (LAB SCALE - 6 THÁNG)         |
| * Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu lá Mù u Trà Vinh (độ ẩm < 10%, dư lượng chì/asen)|
| * Tối ưu hóa tỷ lệ rắn/lỏng (1:8 w/v) và thời gian ngấm kiệt động học        |
+---------------------------------------+---------------------------------------+
                                        |
                                        v
+-------------------------------------------------------------------------------+
| GIAI ĐOẠN 2: THỬ NGHIỆM QUY MÔ PILOT 100 KG/MẺ (PILOT SCALE - 12 THÁNG)       |
| * Ứng dụng tháp ngấm kiệt liên tục ngược dòng kết hợp màng lọc nano siêu lọc  |
| * Thu hồi dung môi bằng hệ thống cô chân không tuần hoàn khép kín (95% hồi lưu)|
+---------------------------------------+---------------------------------------+
                                        |
                                        v
+-------------------------------------------------------------------------------+
| GIAI ĐOẠN 3: SẢN XUẤT THƯƠNG MẠI & BÀO CHẾ DƯỢC PHẨM (COMMERCIAL - 18 THÁNG) |
| * Chuẩn hóa cao định chuẩn chứa >= 10% Acid ursolic & Acid canophyllic        |
| * Bào chế dạng gel bôi ngoài da trị sẹo bỏng và viên nang mềm bảo vệ tế bào gan|
+-------------------------------------------------------------------------------+

Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit Analysis)

• Nguồn nguyên liệu dồi dào: Lá Mù u là phế phẩm nông - lâm nghiệp sau khi thu hoạch hạt lấy dầu béo, chi phí thu gom nguyên liệu thô rất thấp ($< 15,000\ \text{VNĐ/kg}$ lá khô).
• Tỷ suất thu hồi dung môi: Quy trình sử dụng Ethanol và Chloroform cho phép thu hồi tái sử dụng đạt $> 90%$, giúp giảm thiểu chi phí vận hành hóa chất tới $45%$.
• Giá trị kinh tế sản phẩm: Acid ursolic chuẩn tinh khiết thương mại (Sigma-Aldrich, độ tinh khiết $\ge 98%$) có giá thị trường dao động từ $150 - 200\ \text{USD/g}$. Việc tự chủ công nghệ chiết tách giúp giảm giá thành sản xuất xuống dưới $30%$, mang lại tỷ suất hoàn vốn đầu tư (ROI) ước tính đạt $185%$ sau 3 năm vận hành thương mại quy mô bán công nghiệp.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

1. Quy mô mẫu thử nghiệm: Khóa luận chỉ mới tiến hành chiết tách trên quy mô tĩnh $3.0\text{ kg}$ nguyên liệu bột lá thô; chưa khảo sát đầy đủ động học chiết xuất ở các quy mô lớn hơn.
2. Khảo sát phổ dung môi: Đề tài tập trung chuyên sâu vào cao Chloroform (phân cực trung bình); các phân đoạn cao phân cực cao như Ethyl Acetate và Methanol chứa hàm lượng polyphenol/flavonoid dồi dào chưa được phân lập chi tiết.
3. Thử nghiệm sinh học: Do điều kiện phòng thí nghiệm thời điểm 2012, các hợp chất CIE8 và CIE6 mới chỉ được định danh hóa học thuần túy, chưa thực hiện sàng lọc hoạt tính sinh học (bio-assay) trực tiếp trên các chủng vi sinh vật đối kháng tại chỗ.

Hướng phát triển đề xuất

• Nâng cấp công nghệ trích ly: Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm (UAE - Ultrasound-Assisted Extraction) hoặc trích ly bằng chất lưu siêu tới hạn ($CO_2\text{-SFE}$) nhằm rút ngắn thời gian chiết từ 72 giờ xuống còn 45 phút, loại bỏ hoàn toàn dung môi clo hữu cơ độc hại ($CHCl_3$).
• Bán tổng hợp dẫn xuất: Tiến hành phản ứng biến đổi hóa học trên nhóm carboxyl C-28 và hydroxyl C-3 của Acid ursolic nhằm tạo ra các dẫn xuất ester/amide mới nhằm cải thiện độ tan trong nước và tăng hoạt tính ức chế tế bào ung thư.
• Tiêu chuẩn hóa cao định chuẩn: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời Acid ursolic và Acid canophyllic bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diode (HPLC-DAD) phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu theo Dược điển Việt Nam.

---

Đối tượng hưởng lợi

+-----------------------------------------------------------------------------------------+
|                                  ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI                                    |
+----------------------------+-----------------------------+------------------------------+
| SINH VIÊN / NGHIÊN CỨU SINH| KỸ SƯ / NHÀ BÀO CHẾ DƯỢC    | DOANH NGHIỆP SẢN XUẤT DƯỢC   |
| * Nắm vững kỹ thuật giải mã| * Ứng dụng quy trình tinh   | * Tiếp nhận quy trình chiết  |
|   phổ 1D/2D-NMR triterpene |   chế hoạt chất độ sạch >98%|   xuất tận dụng lá Mù u rẻ   |
| * Nguồn tài liệu tra cứu   | * Xây dựng công thức gel trị| * Hạ giá thành nguyên liệu   |
|   phổ chuẩn hóa thực vật   |   bỏng, cream tái tạo sẹo   |   đầu vào xuống 30-40%       |
+----------------------------+-----------------------------+------------------------------+

1. Sinh viên và Học viên Cao học ngành Hóa học/Dược học: Tiếp cận phương pháp luận mẫu mực về quy trình phân lập hợp chất tự nhiên, thành thạo kỹ năng đọc và biện luận phổ khối lượng ESI-MS kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (DEPT, HSQC, HMBC).
2. Kỹ sư và Chuyên viên Nghiên cứu & Phát triển (R&D): Sở hữu quy trình sắc ký gradient chi tiết để tinh sạch hoạt chất triterpenoid acid đạt độ tinh khiết cao ($> 98%$), làm tiền đề cho việc xây dựng công thức thuốc điều trị da liễu và ung bướu.
3. Doanh nghiệp Sản xuất Dược - Mỹ phẩm: Tận dụng nguồn phế phẩm lá Mù u giá thành thấp để chế biến cao định chuẩn chất lượng cao, gia tăng giá trị chuỗi nông nghiệp ven biển miền Tây Nam Bộ và thay thế nguồn hoạt chất nhập khẩu đắt đỏ.
4. Cộng đồng Khoa học Hóa học Hợp chất Thiên nhiên: Bổ sung vào kho dữ liệu khoa học các bằng chứng thực nghiệm chuẩn xác về thành phần hóa thực vật của loài Calophyllum inophyllum L. tại phân vùng địa lý Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật và điều kiện tối thiểu để triển khai quy trình phân lập này là gì?

Hệ thống phòng thí nghiệm cần trang bị tối thiểu: tủ hút khí độc chịu hóa chất hữu cơ; máy cô quay chân không kiểm soát nhiệt độ ($\pm 0.5^\circ\text{C}$); cột sắc ký thủy tinh chịu áp; pha tĩnh silica gel phân bố hạt đều ($40 - 60\ \mu\text{m}$); đèn soi tia cực tím UV bước sóng $254/365\text{ nm}$; và khả năng gửi mẫu phân tích máy quang phổ NMR $\ge 400\text{ MHz}$.

2. Làm thế nào để giải quyết thách thức co-elution (chồng lấn đỉnh) giữa các triterpene tương tự nhau trên sắc ký cột?

Các hợp chất triterpenoid thường có độ phân cực rất gần nhau. Giải pháp hữu hiệu là sử dụng sắc ký cột lặp bậc hai với tỷ lệ nạp mẫu/pha tĩnh nhỏ ($1:50$ đến $1:100$ theo khối lượng), đồng thời điều chỉnh dung môi rửa giải phân cực tăng cực kỳ chậm (ví dụ: $CHCl_3 : MeOH$ từ $100:0 \rightarrow 80:1 \rightarrow 50:1$) và theo dõi liên tục bằng bản mỏng TLC sắc nét được nung thuốc thử $H_2SO_4\ 50%$.

3. Quy trình này có thể thay thế dung môi Chloroform bằng dung môi thân thiện môi trường hơn được không?

Hoàn toàn khả thi. Trong sản xuất công nghiệp, dung môi Ethyl Acetate ($EtOAc$) hoặc hỗn hợp Methyl tert-butyl ether (MTBE) - Ethanol có thể thay thế Chloroform nhằm loại bỏ độc tính của dung môi clo hữu cơ, đáp ứng tiêu chuẩn sản xuất sạch theo hướng dẫn của ICH Q3C (R8) về dung môi tồn dư trong dược phẩm.

4. Nhu cầu bảo quản và tính ổn định của Acid ursolic và Acid canophyllic sau khi phân lập như thế nào?

Cả hai hợp chất đều là triterpenoid acid thể rắn có độ bền nhiệt hóa học tương đối cao ($T_{nc} > 270^\circ\text{C}$). Tuy nhiên, hoạt chất cần được bảo quản trong lọ thủy tinh màu nâu sẫm, đậy kín khí, tránh ánh sáng trực tiếp và duy trì ở nhiệt độ $2 - 8^\circ\text{C}$ để ngăn ngừa phản ứng oxy hóa chậm nhóm chức hydroxyl C-3 khi tiếp xúc lâu ngày với không khí.

5. Dự toán chi phí và thời gian hoàn vốn (ROI) khi chuyển giao công nghệ sang quy mô bán công nghiệp?

Chi phí đầu tư một xưởng chiết xuất pilot công suất $100\text{ kg}$ lá khô/mẻ ước tính khoảng $1.2 - 1.5$ tỷ VNĐ (bao gồm nồi chiết tuần hoàn, hệ thu hồi dung môi và cột sắc ký chuẩn). Với giá bán bột cao định chuẩn đạt chất lượng dược dụng, thời gian thu hồi vốn toàn bộ dự án ước tính từ $24 - 36$ tháng.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của Bùi Văn Quyết (2012) dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Mai Đình Trị và TS. Lê Tiến Dũng đã nghiên cứu toàn diện thành phần hóa thực vật trong dịch chiết lá Mù u (Calophyllum inophyllum L., họ Guttiferae) thu hái tại tỉnh Trà Vinh:

• Đã thiết lập thành công quy trình chiết ngấm kiệt và sắc ký phân đoạn đa cấp hiệu quả, phân lập được hai hợp chất triterpenoid tinh khiết cao: Acid ursolic ($21.3\text{ mg}$, khung ursane) và Acid canophyllic ($36.8\text{ mg}$, khung friedelane).
• Đã chứng minh cấu trúc hóa học tuyệt đối thông qua hệ thống đo đạc hiện đại bao gồm điểm nóng chảy, phổ ESI-MS, phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT và các phổ tương tác 2D-NMR (HSQC, HMBC), đóng góp những cứ liệu khoa học tin cậy và có giá trị cao cho ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên tại Việt Nam.
• Kết quả mở ra triển vọng to lớn trong việc ứng dụng nguồn dược liệu lá Mù u giá thành thấp phục vụ sản xuất các chế phẩm thuốc kháng ung thư, bảo vệ gan, và mỹ phẩm tái tạo mô liền sẹo trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU CHUNG "*! Cây mù u thuộc chi Calophylium, bao gồm khoảng 130 loài, là một trong những chỉ lớn nhất của họ Bứa. Phạm Hoàng Hộ, chi Calophyllum ở Việt Nam có tất cả 15 loài, được trồng hay mọc rải rác từ Bắc đến Nam. Các loài thuộc chỉ này thuộc loại đại mộc hay tiểu mộc, lá mọc đối, phiến lá thường láng, dày, gân song song, hoa vàng hay trắng, quả nhân cứng.

Chúng có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền như điều trị thắp khớp, đau nhức xương, lưng và đau mỏi chân tay, viêm gan, vàng da, trị dối loạn kinh nguyệt, đau bụng kinh, trị vết thương chảy máu. Một số dẫn xuất coumarin, xanthon, biflavonoid, và 2,3-dimetilchromanon trong chi Calophyllum qua nghiên cứu của y học hiện đại cho thấy có tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng HIV, chống ung bướu, cằm máu. ĐẶC DIEM THỰC VAT 471 - Tên thông thường: mù u. - Tên gọi khác: Đồng hồ, khung tung, khchyong (Campuchia).

- Tên khoa học: Caiophyllum inophyllum L. (Balsamaria inophyllum Lour. - Thuộc họ măng cụt (Guttiferae). SVTH: Bùi Văn Quyết 2 Khóa luận tết nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS.

Mai Đình Trị 1. Mô tả chung Mù u là một cây cao chừng 10-15 m đáng đẹp, lá mọc đối, mỏng, thon dài, phía cuống hoi thắt lại, đầu lá hơi tù, phiến lá dai 10-15 cm, rộng 5-8 cm, gân rất nhỏ, nhiều, chạy song song và nỗi rð cả hai mặt lá. Hoa khá to, thơm, màu trắng, mọc thành chùm xim ở kẽ lá hay đầu cành. Quả hạch, hình cầu, đường kính chừng 2,3 em khi chin có màu vàng nhạt, vỏ quả giữa mim, vỏ quả trong dày, cứng.

Hat có lá mầm chứa rất nhiều dầu. Mùa hoa: tháng 2-6, từ xa người ta phân biệt được cây mù ù với cây khác nhờ màu trắng đặc biệt của hoa, mùa quả chín: tháng 10-12. Vùng phân bố, thu hái Cây mù u có ưu điểm là dé trồng, dé mọc trên các loại dat, từ vùng đầm lầy, ven biển đến đổi trọc khô clin, cin được chọn lọc làm vật liệu phục hồi các hệ sinh thái phòng hộ vùng cát ven biển. Trên thé giới, cây mù u phan bố ở những vùng đất hoang gần biển trải dài từ châu Phi, An Độ, Sri Lanka, Thái Lan, Campuchia, Lào, Nam Trung Quốc, Hải Nam, Đài Loan, Indonesia, Úc và những Quần Đảo nam Thái Bình Dương.

Ở nước ta, cây mù u thường mọc hoang, tại những vùng đất cát gần bờ biển, và được tring ở nhiều tỉnh từ Kiến An cũ, Quảng Ninh đến Quảng Binh, Phan Thiết vào Vĩnh Long, My Tho, Sài Gòn, Thủ Dầu Một, Bà Rịa. Cây trồng bến năm bắt đầu cho quả. Năm đầu một cây cho khoảng 4 kg hạt, những năm sau từ 30-50 kg hạt. Ở các tỉnh phía Nam vụ thu hoạch tháng 1 1-12, vụ sau vào tháng 4-5 (trước mùa mưa).

Theo y học cỗ truyền Mii u được ứng dụng rất nhiều trong y học dân gian. Tắt cả các bộ phận của cây (vỏ, thân, lá, hat,.) đều được sử dụng. Nhựa mù u dùng bôi làm tan các chỗ sưng tay, chữa học sưng không nuốt được, mụn nhọt, vết loét nhiễm trùng, tai có mủ. Dầu mù u dùng trị ghẻ, nắm tóc và các bệnh về da nói chung, chữa viêm dây thần kinh trong bệnh cùi, các vết thương.

Cũng dùng bôi trị thấp khớp. Mù cây được làm lành sẹo, SVTH: Bùi Văn Quyết 3 Khóa luận tốt nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị nhất là để trị vết bỏng. Vỏ cây dùng trị đau dạ dày và xuất huyết bên trong.

Rễ được dùng để chữa viêm chân răng. Dau mù u pha với iod dùng để điều trị nhọt, mụn, dùng xoa bóp trị được các bệnh phong thấp, dùng chữa bỏng rất có hiệu quả. Quả mù u đết cháy thành than, rắc lên mụn nhọt có kết quả tốt. Theo y học hiện đại * Thế giới Năm 1918, các nhà khoa học Pháp bắt đầu nghiên cứu vẻ tác dụng tại chỗ đối với da của đầu mù u và ghi nhận đặc tinh làm liền da của nó.

Y văn của Pháp đã ghi nhận nhiễu trường hợp sử dụng thành công dầu mù u trong điều trị các bệnh lý về da. Trong những trường hợp khác, dầu mù u đã sử dụng thành công để làm lành những vết bỏng nặng do nước sôi, hóa chất hoặc X-quang. Theo Pétard (1940, Rev. appliquée et d’ Agronomie colonial 26: 210-211) este etylic của dầu mù u dùng để điều trị có kết qua chứng viém dây thần kinh do hii.

Liều dùng của este etylic dầu mù u là 5-10 ml (tiêm bắp thịt sâu), 5-20 ml (uống). Có thể dùng nhiều ngày liền vì uống không độc. Năm 1947, Mauboussin còn dùng dầu mù u có iod để điều trị bệnh tràng nhạc (luận án thi bác sĩ y khoa, Paris). Dầu mù u còn dùng xoa bóp trị bệnh thấp khớp.Ormanegy và cộng sự đã chứng minh tác dụng lên sẹo và an thần của dau mù u.

* Việt Nam Từ năm 1983, tại bệnh viện Chợ Rẫy Tp. Hồ Chí Minh, Nguyễn Quang Long đã dùng dau mù u điều trị các vết thương, viêm xương có kết quả rất tốt. Nguyễn Tiến Hải dùng dầu mù u điều trị thành công lộ tuyến viêm cổ tử cung. SVTH: Bùi Văn Quyết 4 Khóa luận tết nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS.

Mai Đình Trị 1. THÀNH PHÀN HÓA HỌC Hiện nay ở nước ta, cũng như trên thế giới, thành phần hóa học của mù u được nghiên cứu rất nhiều. Kết quả cho thấy thành phần hóa học chủ yếu trong cây mù u là các hợp chất triterpenoid, xanthone, coumarine, và neo-flavonoid.Lederes đã phân lập được năm hợp chất đầu tiên từ loài C. inophylium trong đó có hai hợp chất xanthone và bến hợp chất coumarine gồm: inophyllum B (1), inophyllum P (2), calophyllolide (3), acide calophyllic (4).

Bến hợp chất coumarine này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng HIV-1. ins 5 Se i H (1) Inophyllum B H (2) Inophyllum P j (3) Calophyllolide (4) Acide calophyllic Sau đó có nhiều công trình nghiên cứu về thành phan hoá học cũng như hoạt tính sinh học của loài C. Theo các tài liệu tham khảo mà chúng tôi có được, thành phan hoá học của mù u Calophyllum inophyllm L., có thé chia thành các nhóm chính sau: SVTH: Bùi Văn Quyết 5 Khóa luận tốt nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị 1.

Thành phần dễ bay hơi của C. inophyllum PP?) Theo tài liệu tham khảo thì tinh dầu mù u đã được xác định bằng kỹ thuật GCMS. Trong sé hai mươi năm hợp chất tìm được thì có 17 hợp chất trong số đó là tinh dầu (chiếm 75%). Thành phần chính trong tinh dầu là hợp chất 1,2,3,4,4a-hexanhydro-I,6,4-(1-methylethyl)naphthalene chiếm khoảng 24.

Ngoài ra còn một số hợp chất chủ yếu khác như là: a-cubelene, 8-bourbolene, -selilene, calarene, ƒ-farncsene, a-fernesene, 5-cadinene, ƒ-sesquiphellandrene, octadecanal, hexadecane và fernersol. Thành phan tinh đầu mù u được trình bay trong bảng sau: Bảng 1. Thành phần hoá học tinh đầu mù u =NWwunaoHt! —etmbw+SO6n nO—_eo©~*œ-c' SVTH: Bùi Văn Quyết 6 Khóa luận tốt nghiệp-2012 H dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị 1.

Các hợp chất Xanthone phân lập từ loài C. Kumar cùng các cộng sự của minh đã phân lập được năm hợp chat xanthone gồm: 1,7-dihydroxyxanthone (6), 6-(3-methylbut-2-enyl)-l,5- dihydroxyxanthone (11), 1,5,6-trihydroxyxanthone (14), 2-(3-methylbut-2-enyl)-l ,3,5- trihydroxyxanthone (l8), deoxyjacareubine (19) , l1,7-dihydroxy-3,6- dimethoxyxanthone (23), 2-(3-methylbut-2-enyl)-1,3,5,6-tetrahydroxathone (25), jacareubine (27).Goh và LBin Jantan đã phân lập được 2-(3-hydroxyl-3- methylbuty!)-1 ,3,5,6-tetrahydroxanthone (26) từ loài €.?" Trong hai năm 1994 và 1995, M. Linuma cùng các cộng sự đã phân lập được 13 hợp chất xanthone từ loài C. inophyllum gồm: 6-hydroxyl-1,2- dimethoxyxanthone (17), 1,3,8-trihydroxy-7-methoxyxanthone (21), 1,3,5-trihydroxy-2-methoxyxanthone (22), 1,3-dihydroxy-7,8-dimethoxyxanthone (24), caloxanthone A (29), caloxanthone B (31), caloxanthone D (33), caloxanthone E (38), 2-hydroxy-1-methoxyxanthone (8), 1-hydroxy-2-methoxyxanthone (9), 1,2-dihydroxyxanthone (10), 2-(3-methylbut-2- enyl)-1,3,5,6-tetrahydroxathone (25), macluraxanthone (30).

Wu và các cộng sự đã tìm thấy trong C. inophyllum sáu hợp chất xanthone gồm: 4-hydroxyxanthone (5), 1,5-dihydroxyxanthone (7), 1,3,5 trihydroxyxanthone (15), 1,6-dihydroxyl -5-methoxyxanthone (16), caloxanthone M (32).Cheng cùng các cộng sự đã tìm ra bốn hợp chất xanthone gồm: brasilixanthone B (34), pyrano-jacareubine (35), calophynone (36), caloxanthone | (37)? SVTH: Bùi Văn Quyết 7 Khóa luận tốt nghiép-2012 Hướng dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị Năm 1995, Nizam Ud-Din Khan, cùng các cộng sự đã phân lập được hai hợp chất mới từ loài C. Bin Jantan và các cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất xanthone từ CQ inophyllum gồm: 2-(3-methylbut-2-enyl)-1,3,5-trihydroxyxanthone (18), deoxyjacareubine (19), 1,3,5-trihydroxy-6,6-dimethylpyrano-(2',3',6,7)-4-(1,1- dimethylprop-2-enyl)-xanthone (28).!"9) Các hợp chất xanthone được phân lập từ C.

inophyllum tuỳ thuộc vào số nhóm thế oxy mà chia thành các loại sau: 1. Các mono-oxygene xanthone (11) SVTH: Bui Van 8 Khóa luận tốt nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị Re (12) R,=R;=H, R;=Me Ph H 43) Ry=Ry=H, Ry=Me @ Hạ OR, 1. Các tri-oxygene xanthone PO Q u à , „ (14) q 0 2 (16) Om Quá” quà SE (19) SVTH: Bùi Văn Quyết 9 SVTH: Bui Van Quyét 10 Khóa Khóa luận luận tốt tốt nghiệp-201 nghiệp-20122 _ Hướn Hướng dẫn khoa học: TS.

Mai MaiĐìn Đình Trị Trị h PHUN H OH HO H Oo Me OMe G31) (32) H OH H H O O (34) (33) H OOXX + H H G5) SVTH: Bui Van 1 Khóa luận tốt nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị (37) 1. Các penta-oxygene xanthone QO OH H M MeO. H H H = H he (38) Me Các hợp chat xanthone có trong cây mù u và hoạt tinh sinh học của chúng được trình bay trong bảng sau: Bảng 1.

Một số hợp chất xathone có trong loài C. inophyllum và hoạt tính sinh học của chúng [uy [TUỆ — ThsẾt | Ewewams Hoạt tính sinh a | a SNHENNG [1s iionraniine | ———— brewee [| 7i8dmơTmeleoemim | L5 | THaosEmeleomime | THỊClZDPmdmvmMm | —— — SVTH: Bùi Văn Quy 12 Khóa luận tốt nghiép-2012 H dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị. 1 dihydroxyxanthone chếng viém!"") 6-(3-methylbut -2-enyl)-1,5 — an’ (2S,3R)-2,3-dihydro-5-hydroxy- 2,3,8,8-tetramethyl-6-(I- phenylethenyl)-4H,SH- benzo [1,2- (2R,3R)-2,3-dihydro-5-hydroxy- 2,3,8,8-tetramethyl-6-(1- phenylethenyl)-4H,8H-benzo [1,2- b:3,4-b']đipyran-4-one | 1558mm Am TH 5 l£ãmdoyi5mebayaninm| —- 6-hydroxyl-1,2- dimethoxyxanthone Tri- oxygene Kháng khué a— —”””— UÌmm | — 1,3,8-trihydroxy-7- | mm.

| 1,3,5-trihydroxy-2- rawccwme| 2 | meters | 1,7-dihydroxy-3,6- Sn —_ | Nè3/1094/đ SVTH: Bùi Văn Quy 3 Khóa luận tốt nghiệp-2012 H dẫn khoa học: TS. Mai Đình Trị 2-(3-hydroxy]-3-methylbutyl)- 1,3,5,6-tetrahydroxanthone Jacareubine 1,3,5-trihydroxy-6,6- dimethylpyrano-(2’,3",6,7)- 4-(1,1- dimethylprop-2-enyl)-xanthone 31 [Giant J —— — 7Ị SmmmM | ——— 3 [cone | — a ———- 1. Các coumarine và neo - flavonoid trong C. Polonsky và Toubiana đã phân lập được hai hợp chất là calophyllolide (3) và inophyllolide (42).

Kawazu, cùng các cộng sự của ông đã tìm ra ba coumarine mới là inophyllum C (41), inophyllum D (59) và inophyllum E (43). Murti đã tìm ra được Ponnalide E (46)'“Ì, cũng trong năm này tại Pháp hợp chất Sans nom (47) đã được tìm thấy bởi A.Cave“ cùng các cộng sy. Games đã phân lập được Apetalolide (44). SVTH: Bùi Văn Quyết 14 Khóa luận tết nghiệp-2012 Hướng dẫn khoa học: TS.

Mai Dinh Trị Năm 2000, S. Joshi cùng các cộng sự đã phân lập được một hợp chất mới trong C. inophyllum là 12-O-methylinophyllum D (40).