Bước Đầu Nghiên Cứu Tạo Interleukin-33 Tái Tổ Hợp Trên Escherichia Coli

• Tác giả: Nguyễn Kim Hưng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Thái
• Trường học: Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Interleukin-33 Tái Tổ Hợp Trên Escherichia Coli
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tổng quan về Interleukin
• 1.2. Tổng quan về Interleukin-33
• 1.2.1. Cấu trúc của Interleukin-33
• 1.2.2. Sinh tổng hợp Interleukin-33
• 1.2.3. Cấu trúc thụ thể ST2 của Interleukin-33
• 1.2.4. Vai trò sinh học của Interleukin-33
• 1.2.5. Các thuốc ức chế Interleukin-33 hiện nay
• 1.3. Sản xuất protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn Escherichia coli
• 1.3.1. Đặc điểm của vi khuẩn Escherichia coli
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Khảo sát điều kiện nuôi cấy
• 3.2. Tinh chế SUMO-IL-33
• 3.3. Khảo sát điều kiện thủy phân SUMO-IL33 để thu IL-33 nguyên thể (native)
• 3.4. Tinh chế IL-33 nguyên thể với cột Ni Sepharose
• 3.5. Định lượng IL-33 bằng bộ KIT ELISA
• 3.6. Mô hình cấu trúc 3D của IL-33 dạng gắn với SUMO xây dựng bằng kỹ thuật homology
• 3.7. Kết quả docking protein-protein khảo sát sự gắn kết của SUMO-IL-33 với thụ thể ST2
• 3.7.1. Nhận xét về kết quả nuôi cấy và tinh chế
• 3.7.2. So sánh với các nghiên cứu khác
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Tạo Interleukin 33 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu về Interleukin-33 (IL-33) đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực y sinh học. IL-33 là một cytokine thuộc họ Interleukin-1, đóng vai trò quan trọng trong các bệnh viêm và tự miễn như hen suyễn, viêm khớp dạng thấp và lupus ban đỏ. Gần đây, nghiên cứu còn chỉ ra sự tăng cao IL-33 ở bệnh nhân COVID-19 trẻ tuổi liên quan đến cơn bão cytokine, mở ra hướng nghiên cứu mới về IL-33 và thụ thể của nó. Việc chủ động tạo ra nguồn IL-33 cho nghiên cứu là vô cùng cần thiết, do IL-33 chưa được sản xuất thương mại và giá thành rất cao. Nghiên cứu này hướng đến việc tạo ra nguồn IL-33 tái tổ hợp với độ tinh khiết cao, phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về vai trò và ứng dụng của cytokine này.

1.1. Giới Thiệu Về Interleukin 33 và Vai Trò Sinh Học

Interleukin-33 là một cytokine quan trọng, tham gia vào nhiều quá trình sinh học, đặc biệt là các phản ứng viêm và miễn dịch. Nó tác động lên nhiều loại tế bào miễn dịch như tế bào mast, tế bào lympho T CD4, bạch cầu ưa base, bạch cầu ưa acid, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, diệt bào tự nhiên và bạch cầu đa nhân trung tính. IL-33 gắn lên thụ thể của nó là ST2, kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào, dẫn đến sản xuất các cytokine và chemokine khác, khuếch đại phản ứng viêm. Nghiên cứu gần đây cho thấy IL-33 liên quan đến các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, hen suyễn và các bệnh tự miễn.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Sinh Học Về IL 33

Việc nghiên cứu sâu về Interleukin-33 có ý nghĩa to lớn trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho nhiều bệnh lý. Hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của IL-33 sẽ giúp xác định các mục tiêu điều trị tiềm năng, từ đó thiết kế các thuốc ức chế hoặc điều hòa hoạt động của cytokine này. Các nghiên cứu về IL-33 cũng góp phần làm sáng tỏ vai trò của nó trong các bệnh tự miễn, nhiễm trùng và ung thư, mở ra những hướng đi mới trong nghiên cứu và điều trị các bệnh này.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất Interleukin 33 Tái Tổ Hợp

Việc sản xuất Interleukin-33 tái tổ hợp gặp nhiều thách thức do protein này có cấu trúc phức tạp và dễ bị thoái hóa. Escherichia coli (E. coli) thường được sử dụng làm vật chủ để sản xuất protein tái tổ hợp, nhưng việc biểu hiện IL-33 trong E. coli có thể dẫn đến sự hình thành các thể vùi (inclusion bodies), gây khó khăn cho quá trình tinh chế. Ngoài ra, IL-33 có thể gây độc cho tế bào E. coli, làm giảm hiệu suất sản xuất. Do đó, cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và biểu hiện để đạt được hiệu suất cao và độ tinh khiết cao của IL-33 tái tổ hợp.

2.1. Khó Khăn Trong Biểu Hiện IL 33 Trên Escherichia coli

Biểu hiện Interleukin-33 trên Escherichia coli thường gặp phải vấn đề về sự hình thành thể vùi, làm giảm độ hòa tan và gây khó khăn cho quá trình tinh chế protein. IL-33 có thể gây độc cho tế bào E. coli, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và hiệu suất sản xuất. Cần tối ưu hóa các yếu tố như nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, và vector biểu hiện để giảm thiểu sự hình thành thể vùi và tăng cường sự ổn định của IL-33.

2.2. Vấn Đề Tinh Chế Protein Tái Tổ Hợp IL 33

Quá trình tinh chế Interleukin-33 tái tổ hợp đòi hỏi các kỹ thuật sắc ký phức tạp để loại bỏ các tạp chất và đạt được độ tinh khiết cao. IL-33 có thể bị mất hoạt tính trong quá trình tinh chế do sự biến đổi cấu trúc hoặc sự hiện diện của các protease. Cần sử dụng các phương pháp tinh chế nhẹ nhàng và bảo vệ protein khỏi sự thoái hóa để đảm bảo hoạt tính sinh học của IL-33.

2.3. Chi Phí Sản Xuất IL 33 Tái Tổ Hợp Cao

Việc sản xuất Interleukin-33 tái tổ hợp với độ tinh khiết cao đòi hỏi các quy trình phức tạp và tốn kém, bao gồm việc nuôi cấy tế bào, tinh chế protein và kiểm tra chất lượng. Giá thành của các hóa chất và vật tư sử dụng trong quá trình sản xuất cũng góp phần làm tăng chi phí. Do đó, cần tìm kiếm các phương pháp sản xuất hiệu quả và tiết kiệm chi phí để giảm giá thành của IL-33 tái tổ hợp.

III. Phương Pháp Tạo IL 33 Tái Tổ Hợp Trên Escherichia Coli

Nghiên cứu này sử dụng Escherichia coli làm vật chủ để sản xuất Interleukin-33 tái tổ hợp. Chủng vi khuẩn E. coli được biến nạp bằng vector biểu hiện pET-SUMO-IL-33. Quá trình biểu hiện được thực hiện trong môi trường ZYP-5052 ở 25°C. IL-33 dạng tan được thu nhận và tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực trên cột Ni-Sepharose. IL-33 dạng nguyên thể được định lượng bằng phương pháp Bradford và bộ kit ELISA. Mô hình 3D của SUMO-IL33 và IL-33 được xây dựng để đánh giá khả năng gắn kết với thụ thể ST2.

3.1. Sử Dụng Vector Biểu Hiện pET SUMO Để Tăng Độ Hòa Tan

Vector biểu hiện pET-SUMO được sử dụng để tăng độ hòa tan của Interleukin-33 trong Escherichia coli. SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) là một protein nhỏ có khả năng tăng cường sự gấp nếp và độ hòa tan của các protein khác. Việc gắn SUMO vào IL-33 giúp protein này hòa tan tốt hơn trong tế bào E. coli, giảm thiểu sự hình thành thể vùi và tăng hiệu suất sản xuất.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Nuôi Cấy Để Tăng Sinh Khối

Các điều kiện nuôi cấy Escherichia coli được tối ưu hóa để đạt được sinh khối cao nhất. Môi trường ZYP-5052 được sử dụng vì nó cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng của vi khuẩn. Nhiệt độ nuôi cấy được duy trì ở 25°C để giảm thiểu sự hình thành thể vùi và tăng cường sự ổn định của Interleukin-33. Thời gian nuôi cấy cũng được điều chỉnh để đạt được sinh khối tối đa.

3.3. Tinh Chế IL 33 Bằng Sắc Ký Ái Lực Ni Sepharose

Sắc ký ái lực Ni-Sepharose được sử dụng để tinh chế Interleukin-33 dạng dung hợp với SUMO. Cột Ni-Sepharose có khả năng gắn kết đặc hiệu với các protein chứa đuôi His (histidine). SUMO được gắn thêm đuôi His để dễ dàng tinh chế bằng phương pháp này. Sau khi tinh chế, SUMO được loại bỏ bằng SUMO protease để thu được IL-33 dạng nguyên thể.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tạo Thành Công IL 33 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu đã tạo thành công Interleukin-33 nguyên thể với hiệu suất 17,4%. Vi khuẩn được nuôi cấy 40 giờ trong môi trường ZYP-5052 ở nhiệt độ 25°C. Loại bỏ đoạn dung hợp SUMO thu IL-33 nguyên thể là 38,56 mg. Mô hình 3D của SUMO-IL33 và IL-33 được xây dựng, cho thấy IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO không thể sử dụng trong các thử nghiệm có mặt thụ thể ST2.

4.1. Hiệu Suất Sản Xuất IL 33 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu đã đạt được hiệu suất sản xuất Interleukin-33 tái tổ hợp là 17,4%, tương đương với 38,56 mg IL-33 nguyên thể sau khi loại bỏ đoạn dung hợp SUMO. Đây là một kết quả khả quan, cho thấy phương pháp sản xuất được sử dụng có hiệu quả và có thể được áp dụng để sản xuất IL-33 ở quy mô lớn hơn.

4.2. Đánh Giá Khả Năng Gắn Kết Với Thụ Thể ST2

Mô hình 3D của SUMO-IL33 và Interleukin-33 được xây dựng để đánh giá khả năng gắn kết với thụ thể ST2. Kết quả cho thấy IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO không thể gắn kết với thụ thể ST2, do đoạn SUMO cản trở sự tương tác giữa IL-33 và thụ thể. Điều này cho thấy cần loại bỏ đoạn SUMO để IL-33 có thể tương tác với thụ thể ST2 và thực hiện chức năng sinh học của nó.

V. Ứng Dụng Của Interleukin 33 Tái Tổ Hợp Trong Nghiên Cứu

Interleukin-33 tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh của các bệnh viêm và tự miễn, phát triển các thuốc ức chế IL-33 và nghiên cứu về tương tác giữa IL-33 và thụ thể ST2. Nguồn IL-33 tái tổ hợp do nghiên cứu này tạo ra sẽ giúp các nhà khoa học Việt Nam chủ động hơn trong việc thực hiện các nghiên cứu về IL-33, góp phần vào sự phát triển của ngành y sinh học trong nước.

5.1. Nghiên Cứu Về Cơ Chế Bệnh Sinh Của Bệnh Viêm

Interleukin-33 đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh viêm, bao gồm hen suyễn, viêm khớp dạng thấp và viêm ruột. IL-33 tái tổ hợp có thể được sử dụng để nghiên cứu vai trò của cytokine này trong các quá trình viêm, từ đó tìm ra các mục tiêu điều trị tiềm năng.

5.2. Phát Triển Thuốc Ức Chế Interleukin 33

Việc phát triển các thuốc ức chế Interleukin-33 là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh viêm và tự miễn. IL-33 tái tổ hợp có thể được sử dụng để sàng lọc và đánh giá hiệu quả của các thuốc ức chế IL-33, từ đó tìm ra các ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển thuốc.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu IL 33

Nghiên cứu đã tạo thành công Interleukin-33 tái tổ hợp trên Escherichia coli, mở ra cơ hội cho các nghiên cứu sâu hơn về vai trò và ứng dụng của cytokine này. Cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình sản xuất để tăng hiệu suất và giảm chi phí. Nghiên cứu cũng cần tập trung vào việc đánh giá hoạt tính sinh học của IL-33 tái tổ hợp và nghiên cứu về tương tác giữa IL-33 và thụ thể ST2.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Sản Xuất IL 33

Để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu ngày càng tăng, cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình sản xuất Interleukin-33 tái tổ hợp. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm môi trường nuôi cấy, điều kiện biểu hiện và quy trình tinh chế. Mục tiêu là đạt được hiệu suất cao hơn, độ tinh khiết cao hơn và chi phí thấp hơn.

6.2. Nghiên Cứu Về Tương Tác IL 33 và Thụ Thể ST2

Tương tác giữa Interleukin-33 và thụ thể ST2 đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh viêm. Cần nghiên cứu sâu hơn về tương tác này để hiểu rõ hơn về vai trò của IL-33 trong các bệnh lý này và tìm ra các mục tiêu điều trị tiềm năng.

Tổng quan nghiên cứu

Interleukin-33 (IL-33) là một cytokine thuộc họ Interleukin-1, đóng vai trò quan trọng trong các bệnh tự miễn và viêm nhiễm, đặc biệt liên quan đến các bệnh như hen suyễn, viêm khớp dạng thấp, và các bệnh lý thần kinh như Alzheimer. Gần đây, IL-33 cũng được phát hiện tăng cao ở bệnh nhân COVID-19 trẻ tuổi, liên quan đến cơn bão cytokine, mở ra hướng nghiên cứu mới về vai trò của IL-33 và thụ thể ST2 trong điều trị các bệnh lý này. Tuy nhiên, IL-33 chưa được sản xuất thương mại rộng rãi và giá thành rất cao, gây khó khăn cho các nghiên cứu trong nước và quốc tế.

Luận văn tập trung vào việc tổng hợp IL-33 người tái tổ hợp trên vi khuẩn Escherichia coli nhằm tạo nguồn IL-33 nguyên thể với độ tinh khiết cao phục vụ nghiên cứu. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2019-2021 tại Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, sử dụng chủng E. coli BL21(DE3) mang vector biểu hiện pET-SUMO-IL-33, nuôi cấy trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C trong 40 giờ. Mục tiêu cụ thể bao gồm khảo sát điều kiện nuôi cấy, tinh chế protein dạng dung hợp SUMO-IL-33, thủy phân để thu IL-33 nguyên thể, định lượng protein và khảo sát tương tác in silico giữa IL-33 và thụ thể ST2.

Nghiên cứu có ý nghĩa lớn trong việc cung cấp nguồn IL-33 tái tổ hợp phục vụ các thử nghiệm sinh học, góp phần thúc đẩy phát triển thuốc ức chế IL-33 tại Việt Nam, đồng thời giảm chi phí và phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu. Kết quả nghiên cứu cũng mở ra cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động và ứng dụng IL-33 trong điều trị các bệnh viêm và tự miễn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng của Interleukin-33: IL-33 là một chuỗi polypeptid gồm 270 acid amin, có cấu trúc β-trefoil đặc trưng của họ IL-1, với vùng C-terminal (acid amin 112-270) chịu trách nhiệm chức năng cytokine thông qua tương tác với thụ thể ST2. IL-33 tồn tại dưới dạng tiền chất và dạng trưởng thành, trong đó dạng trưởng thành có hoạt tính sinh học mạnh hơn gấp 10 lần.

• Biểu hiện protein tái tổ hợp trên Escherichia coli: E. coli BL21(DE3) được sử dụng làm vật chủ biểu hiện protein nhờ ưu điểm tăng sinh nhanh, dễ biến nạp plasmid, và khả năng biểu hiện protein hòa tan cao. Vector pET-SUMO được chọn vì khả năng tăng hòa tan protein, biểu hiện mạnh và dễ dàng loại bỏ đoạn dung hợp SUMO bằng enzym SUMO protease.

• Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực kim loại (IMAC): Sử dụng cột Ni-Sepharose để tinh chế protein chứa đuôi His-tag, dựa trên sự liên kết chọn lọc giữa histidin và ion Ni2+. Phương pháp này cho hiệu suất tinh chế cao và giữ nguyên cấu trúc protein.

• Mô hình hóa cấu trúc 3D và docking protein-protein: Kỹ thuật homology modeling với các công cụ I-TASSER, C-I-TASSER và RoseTTAFold được áp dụng để xây dựng mô hình 3D của IL-33 gắn với SUMO và dạng tự nhiên. Docking protein-protein sử dụng ClusPro để khảo sát khả năng tương tác của IL-33 với thụ thể ST2, đánh giá ảnh hưởng của đoạn dung hợp SUMO đến chức năng liên kết.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Sử dụng chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang plasmid pET-SUMO-IL-33 chứa gen IL-33 người đã được tối ưu hóa codon cho biểu hiện trên E. coli. Môi trường nuôi cấy gồm LB, TB và ZYP-5052 với kháng sinh kanamycin 50 µg/mL.

• Phương pháp phân tích: Protein được biểu hiện trong môi trường ZYP-5052 ở 25 °C trong 40 giờ, sau đó thu nhận và tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose. Protein dạng dung hợp SUMO-IL-33 được thủy phân bằng SUMO protease để thu IL-33 nguyên thể. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford và ELISA sử dụng bộ kit Thermo Fisher. Protein được kiểm định bằng SDS-PAGE. Mô hình cấu trúc 3D được xây dựng và đánh giá bằng các công cụ mô phỏng homology và docking.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khóa học thạc sĩ 2019-2021, với các giai đoạn chính gồm khảo sát điều kiện nuôi cấy, biểu hiện và tinh chế protein, thủy phân và định lượng IL-33, cuối cùng là phân tích in silico tương tác protein.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Sử dụng các bình nuôi cấy 200 mL nhân lên thành 1 L để khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu. Các mẫu protein được thu thập tại các thời điểm khác nhau để đánh giá hiệu suất biểu hiện và tinh chế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện nuôi cấy tối ưu: Ở nhiệt độ 25 °C, môi trường ZYP-5052 cho hiệu suất biểu hiện SUMO-IL-33 dạng hòa tan cao nhất so với LB và TB. Nồng độ IPTG 0,1 mM và 0,5 mM trong môi trường LB cho biểu hiện thấp, với tỷ lệ protein hòa tan chỉ khoảng 20% tổng protein tế bào.

2. Hiệu suất tinh chế và thu IL-33 nguyên thể: Sau 40 giờ nuôi cấy, thu được 38,56 mg IL-33 nguyên thể với hiệu suất 17,4% sau khi loại bỏ đoạn dung hợp SUMO bằng SUMO protease và tinh chế qua cột Ni-Sepharose.

3. Định lượng protein: Kết quả định lượng bằng phương pháp Bradford và ELISA cho thấy nồng độ IL-33 nguyên thể đạt mức đủ cao để phục vụ nghiên cứu sinh học, khẳng định tính khả thi của quy trình biểu hiện và tinh chế.

4. Phân tích in silico: Mô hình 3D của IL-33 gắn với SUMO cho thấy đoạn dung hợp SUMO che lấp vị trí liên kết với thụ thể ST2, làm giảm khả năng tương tác. Docking protein-protein xác nhận IL-33 chứa đoạn SUMO không thể sử dụng trong các thử nghiệm có mặt thụ thể ST2, trong khi IL-33 nguyên thể có khả năng gắn kết hiệu quả với ST2.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất biểu hiện protein cao ở 25 °C trong môi trường ZYP-5052 phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy nhiệt độ thấp giúp tăng hòa tan protein tái tổ hợp và giảm hình thành thể vùi. Việc sử dụng vector pET-SUMO giúp tăng khả năng hòa tan và biểu hiện protein, đồng thời cho phép loại bỏ dễ dàng đoạn dung hợp SUMO để thu IL-33 nguyên thể.

Hiệu suất thu IL-33 nguyên thể 17,4% là mức khả quan, đáp ứng nhu cầu nghiên cứu trong nước, giảm chi phí so với mua IL-33 thương mại. Kết quả định lượng bằng ELISA và Bradford tương thích, đảm bảo độ chính xác và tin cậy.

Phân tích mô hình 3D và docking protein-protein cung cấp bằng chứng cơ sở cho việc không sử dụng IL-33 dạng dung hợp SUMO trong các thử nghiệm tương tác với thụ thể ST2, do đoạn SUMO gây cản trở vị trí liên kết. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của bước thủy phân để thu IL-33 nguyên thể trong nghiên cứu chức năng và phát triển thuốc.

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo quốc tế về biểu hiện protein tái tổ hợp trên E. coli và vai trò của IL-33 trong các bệnh viêm và tự miễn. Việc tạo nguồn IL-33 nguyên thể trong nước sẽ thúc đẩy các nghiên cứu tiếp theo về thuốc ức chế IL-33 và các ứng dụng lâm sàng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và biểu hiện protein: Khuyến nghị duy trì nhiệt độ 25 °C và sử dụng môi trường ZYP-5052 tự cảm ứng để đạt hiệu suất biểu hiện cao, giảm chi phí và thời gian nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy nên duy trì khoảng 40 giờ để tối đa sinh khối và protein hòa tan.

2. Nâng cao hiệu quả thủy phân SUMO-IL-33: Đề xuất khảo sát thêm các điều kiện enzym SUMO protease như nồng độ enzym, thời gian và nhiệt độ phản ứng để tăng hiệu suất thu IL-33 nguyên thể, giảm tạp chất và thời gian xử lý.

3. Phát triển quy trình tinh chế protein quy mô lớn: Khuyến nghị mở rộng quy mô tinh chế bằng sắc ký ái lực Ni-Sepharose và kết hợp với các phương pháp sắc ký bổ sung như sắc ký rây phân tử để nâng cao độ tinh khiết và thu hồi protein.

4. Ứng dụng mô hình in silico trong thiết kế thuốc: Khuyến khích sử dụng mô hình 3D và docking protein-protein để thiết kế các phân tử nhỏ hoặc kháng thể ức chế IL-33 tương tác với thụ thể ST2, hỗ trợ phát triển thuốc điều trị các bệnh viêm và tự miễn.

5. Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm nghiên cứu protein tái tổ hợp, các trung tâm phát triển thuốc và các nhóm nghiên cứu về bệnh viêm, tự miễn nên áp dụng quy trình này để tạo nguồn IL-33 phục vụ nghiên cứu và phát triển thuốc trong vòng 1-2 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Dược học, Sinh học phân tử: Luận văn cung cấp quy trình chi tiết về biểu hiện và tinh chế protein tái tổ hợp, giúp nâng cao kỹ năng thực nghiệm và hiểu biết về công nghệ protein tái tổ hợp.

2. Các phòng thí nghiệm phát triển thuốc sinh học: Nghiên cứu cung cấp nguồn IL-33 nguyên thể với độ tinh khiết cao, hỗ trợ thử nghiệm hoạt tính các chất ức chế IL-33, rút ngắn thời gian và chi phí nghiên cứu.

3. Bệnh viện và trung tâm nghiên cứu lâm sàng: Thông tin về vai trò của IL-33 trong các bệnh viêm và tự miễn giúp định hướng nghiên cứu lâm sàng và phát triển liệu pháp điều trị mới.

4. Các công ty công nghệ sinh học và dược phẩm: Quy trình biểu hiện và tinh chế protein tái tổ hợp có thể ứng dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu và phát triển sản phẩm sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Escherichia coli làm vật chủ biểu hiện IL-33?
   E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ biến nạp plasmid, chi phí nuôi cấy thấp và khả năng biểu hiện protein hòa tan cao, phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp quy mô lớn.

2. Vector pET-SUMO có ưu điểm gì trong biểu hiện protein?
   Vector này giúp tăng khả năng hòa tan protein tái tổ hợp nhờ đoạn dung hợp SUMO, đồng thời cho phép loại bỏ dễ dàng đoạn dung hợp bằng enzym SUMO protease để thu protein nguyên thể.

3. Hiệu suất thu IL-33 nguyên thể đạt được là bao nhiêu?
   Nghiên cứu thu được 38,56 mg IL-33 nguyên thể với hiệu suất 17,4% sau khi thủy phân và tinh chế, đáp ứng nhu cầu nghiên cứu trong nước.

4. Tại sao cần loại bỏ đoạn dung hợp SUMO trước khi sử dụng IL-33?
   Đoạn SUMO che lấp vị trí liên kết của IL-33 với thụ thể ST2, làm giảm hoặc mất khả năng tương tác, do đó chỉ IL-33 nguyên thể mới có hoạt tính sinh học đầy đủ.

5. Phương pháp định lượng IL-33 được sử dụng là gì?
   Sử dụng phương pháp Bradford để định lượng tổng protein và bộ kit ELISA “Sandwich” của Thermo Fisher để định lượng chính xác IL-33 nguyên thể dựa trên phản ứng kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu.

Kết luận

• Đã thành công trong việc biểu hiện và tinh chế IL-33 người tái tổ hợp trên E. coli BL21(DE3) với hiệu suất thu IL-33 nguyên thể đạt 17,4%.
• Môi trường ZYP-5052 và nhiệt độ 25 °C là điều kiện tối ưu cho biểu hiện protein hòa tan.
• Đoạn dung hợp SUMO làm cản trở tương tác của IL-33 với thụ thể ST2, do đó cần thủy phân để thu IL-33 nguyên thể có hoạt tính sinh học.
• Mô hình 3D và docking protein-protein cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển thuốc ức chế IL-33.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển nguồn protein tái tổ hợp trong nước, hỗ trợ nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị các bệnh viêm và tự miễn.

Next steps: Tối ưu hóa quy trình thủy phân và tinh chế, mở rộng quy mô sản xuất, ứng dụng trong thử nghiệm hoạt tính các chất ức chế IL-33.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học nên hợp tác để phát triển và ứng dụng nguồn IL-33 tái tổ hợp này trong nghiên cứu và sản xuất thuốc mới.