Luận văn thạc sĩ sinh học ứng dụng nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập tại thái nguyên

Luận văn thạc sĩ sinh học ứng dụng nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên.

• Tác giả: Trần Chung Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Trương Phúc Hưng
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Khoa học
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)
• 2.1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt
• 2.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới
• 2.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam
• 2.1.2. Đại cương về vi khuẩn Bt
• 2.1.2.1. Sự phân bố của Bt
• 2.1.2.2. Đặc điểm hình thái
• 3. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Hóa chất và thiết bị
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis
• 3.3.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch
• 3.3.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 3.3.4. Phương pháp lên men vi sinh vật
• 4. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis
• 4.1.1. Phân lập các chủng B.
• 4.1.2. Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B. thuringiensis phân lập
• 4.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh
• 4.1.4. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập
• 4.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm
• 4.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2
• 4.2.2. Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm
• 4.2.3. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis để diệt sâu tơ, một loại sâu hại phổ biến trong nông nghiệp. Thái Nguyên được chọn làm địa điểm nghiên cứu do sự đa dạng về hệ sinh thái và sự hiện diện của các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính cao. Mục tiêu chính là tối ưu hóa quy trình lên men và tạo ra chế phẩm sinh học hiệu quả, thân thiện với môi trường, góp phần vào nông nghiệp bền vững.

1.1. Bối cảnh nghiên cứu

Sâu tơ (Plutella xylostella) là một trong những loài sâu hại nghiêm trọng nhất, gây thiệt hại lớn cho cây trồng. Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học không chỉ gây ô nhiễm môi trường mà còn dẫn đến hiện tượng kháng thuốc. Chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis được xem là giải pháp thay thế hiệu quả, an toàn và bền vững.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao, tối ưu hóa điều kiện lên men và tạo ra chế phẩm sinh học hiệu quả. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần vào việc bảo vệ cây trồng và phát triển nông nghiệp bền vững.

II. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn gram dương, có khả năng sản xuất protein tinh thể độc tố (Cry) có tác dụng diệt côn trùng. Bt được sử dụng rộng rãi trong quản lý sâu bệnh nhờ tính đặc hiệu cao và an toàn với môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và sàng lọc các chủng Bt từ đất tại Thái Nguyên để tạo chế phẩm sinh học.

2.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng

Bt được phát hiện từ đầu thế kỷ 20 và đã được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp. Tại Việt Nam, Bt được nghiên cứu từ những năm 1970 và đã có nhiều thành tựu trong việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Tuy nhiên, việc sản xuất quy mô công nghiệp vẫn còn hạn chế.

2.2. Đặc điểm sinh học của Bt

Bt có khả năng sinh bào tử và protein tinh thể độc tố, có tác dụng diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh. Protein Cry của Bt có cơ chế tác động đặc hiệu, gây tổn thương hệ tiêu hóa của côn trùng, dẫn đến tử vong.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập, sàng lọc và tối ưu hóa điều kiện lên men để tạo chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis. Các chủng Bt được phân lập từ đất tại Thái Nguyên và đánh giá hoạt tính diệt sâu tơ. Quy trình lên men được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả cao nhất.

3.1. Phân lập và sàng lọc chủng Bt

Các mẫu đất được thu thập từ nhiều khu vực tại Thái Nguyên và tiến hành phân lập các chủng Bt. Các chủng này được sàng lọc dựa trên khả năng diệt sâu tơ thông qua các thử nghiệm sinh học.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men

Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thời gian lên men được tối ưu hóa để đảm bảo sự phát triển tối đa của Bacillus thuringiensis và sản xuất protein Cry hiệu quả.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã phân lập được các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao từ đất tại Thái Nguyên. Quy trình lên men được tối ưu hóa, tạo ra chế phẩm sinh học hiệu quả. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ cây trồng và phát triển nông nghiệp bền vững.

4.1. Đánh giá hoạt tính diệt sâu tơ

Các chủng Bt được đánh giá dựa trên khả năng diệt sâu tơ trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy một số chủng có hiệu quả diệt sâu tơ vượt trội, đạt tỷ lệ tử vong trên 90% sau 72 giờ.

4.2. Ứng dụng thực tế

Chế phẩm sinh học từ Bt được thử nghiệm trên các cây trồng bị nhiễm sâu tơ. Kết quả cho thấy hiệu quả cao trong việc kiểm soát sâu hại mà không gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe con người.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhu cầu lương thực toàn cầu đang tăng nhanh, trong khi sản lượng nông nghiệp hàng năm bị giảm khoảng 16-18% do sâu hại gây ra. Việc kiểm soát sâu hại là yếu tố then chốt để bảo vệ mùa màng và nâng cao năng suất. Thuốc trừ sâu hóa học tuy phổ biến nhưng gây ra nhiều vấn đề như kháng thuốc, tiêu diệt côn trùng có ích và ô nhiễm môi trường. Do đó, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được xem là giải pháp thay thế hiệu quả, an toàn và thân thiện với môi trường.

Luận văn tập trung nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ các chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên, một tỉnh miền núi trung du có điều kiện địa hình, khí hậu và đất đai đa dạng, thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn Bt. Mục tiêu chính là tuyển chọn các chủng Bt có hoạt tính diệt sâu tơ cao, nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu và tạo chế phẩm sinh học hiệu quả.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu đất tại các vùng Tân Cương, Túc Duyên, Trại Cau của Thái Nguyên, thực hiện phân lập, phân loại và thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt. Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học, góp phần giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

• Lý thuyết về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt): Bt là vi khuẩn gram dương, hiếu khí, có khả năng sinh bào tử và protein tinh thể độc tố (Cry) có tác dụng diệt côn trùng đặc hiệu. Bt tồn tại phổ biến trong đất và môi trường tự nhiên, có nhiều dưới loài với đặc điểm sinh học và độc tố khác nhau.

• Mô hình cơ chế tác động của protein tinh thể Cry: Khi côn trùng ăn phải, protein tinh thể được hòa tan trong ruột, chuyển thành δ-endotoxin, gắn vào thụ thể trên tế bào ruột, tạo lỗ thủng màng tế bào, gây liệt ruột và chết sâu.

• Khái niệm về sâu tơ (Plutella xylostella): Sâu tơ là loài sâu hại nghiêm trọng trên nhiều loại rau, có khả năng kháng thuốc cao, gây thiệt hại năng suất từ 30-40%.

• Phương pháp lên men vi sinh vật: Bao gồm lên men chìm và lên men bề mặt để sản xuất chế phẩm Bt, trong đó lên men chìm được sử dụng phổ biến do hiệu quả cao và khả năng kiểm soát điều kiện nuôi cấy.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Thu thập 30 mẫu đất từ các vùng Tân Cương, Túc Duyên, Trại Cau, Thái Nguyên. Sâu tơ độ tuổi 2 được cung cấp từ Viện Bảo vệ thực vật quốc gia.

• Phương pháp phân lập: Sử dụng phương pháp xử lý nhiệt và pha loãng mẫu đất, cấy trên môi trường MPA để phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Quan sát hình thái bào tử và tinh thể dưới kính hiển vi.

• Phân loại: Áp dụng phương pháp huyết thanh miễn dịch với các typ huyết thanh H3a, 3b, 3c để xác định dưới loài Bt var. kurstaki.

• Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Thử diệt sâu tơ bằng phương pháp nhúng lá bắp cải vào dịch bào tử Bt với mật độ 1x10^8 CFU/ml, theo dõi tỷ lệ sâu chết sau 24, 48, 72 giờ.

• Phương pháp lên men: Chuẩn bị dịch giống, lên men trong bình tam giác với môi trường LB bổ sung các muối khoáng và chất hữu cơ, điều chỉnh pH và nhiệt độ phù hợp. Thời gian lên men 48-72 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập (1 tháng), phân loại và thử hoạt tính (2 tháng), nghiên cứu điều kiện lên men và tạo chế phẩm (2 tháng), đánh giá hoạt tính chế phẩm (1 tháng).

---

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và đa dạng chủng Bt: Từ 30 mẫu đất, phân lập được 152 chủng Bacillus, trong đó 81 chủng Bt sinh tinh thể, chiếm tần suất xuất hiện 0,76 và chỉ số Bt 0,53, cao hơn mức trung bình ở Việt Nam (0,63 và 0,3) và thế giới (0,38-0,85).

2. Đa dạng hình thái tinh thể: Các chủng Bt phân lập sinh ra tinh thể với 4 dạng chính: hình lưỡng tháp (51,58%), hình cầu (21%), hình lập phương (18,51%) và kết hợp các dạng khác (6,16%). Điều này cho thấy phổ diệt côn trùng rộng của các chủng Bt tại Thái Nguyên.

3. Phân loại dưới loài: 39 trên 81 chủng Bt được xác định thuộc dưới loài Bt var. kurstaki qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b, 3c.

4. Hoạt tính diệt sâu tơ: 5 chủng Bt var. kurstaki thử nghiệm cho thấy tỷ lệ sâu chết trên 80% ở nồng độ 10^7 bào tử/ml sau 3 ngày, trong đó chủng TC 2.5 đạt 100% tỷ lệ diệt sâu ngay ở nồng độ 10^5 bào tử/ml.

5. Điều kiện lên men tối ưu: Chủng TC 2.5 sinh trưởng tốt nhất ở pH 6,5-7,5 với mật độ tế bào đạt 4,5x10^8 CFU/ml và nhiệt độ 25-35°C với mật độ tế bào đạt 5,49x10^8 CFU/ml.

6. Chế phẩm Bt-TC2.5: Sau lên men và đông khô, chế phẩm dạng bột giữ được hoạt tính diệt sâu tơ cao, đạt 100% tỷ lệ sâu chết sau 3 ngày thử nghiệm.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và đa dạng chủng Bt tại Thái Nguyên cho thấy môi trường tự nhiên phong phú, phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Bt có hoạt tính sinh học cao. Tỷ lệ xuất hiện và chỉ số Bt cao hơn mức trung bình cho thấy tiềm năng lớn trong việc khai thác nguồn gen Bt bản địa.

Hình thái tinh thể đa dạng phản ánh sự đa dạng về độc tố Cry, giúp mở rộng phổ diệt côn trùng, phù hợp với mục tiêu diệt sâu tơ và các loài sâu hại khác. Việc xác định chủng Bt var. kurstaki chiếm tỷ lệ lớn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về khả năng diệt sâu bộ cánh vảy.

Hoạt tính diệt sâu tơ của chủng TC 2.5 vượt trội so với các chủng khác, phù hợp để phát triển chế phẩm sinh học. Điều kiện lên men tối ưu được xác định rõ ràng giúp nâng cao hiệu quả sản xuất chế phẩm Bt quy mô phòng thí nghiệm và hướng tới công nghiệp.

So sánh với các nghiên cứu trong và ngoài nước, kết quả phù hợp với các báo cáo về nhiệt độ và pH tối ưu cho sinh trưởng Bt, cũng như hiệu quả diệt sâu của protein tinh thể Cry. Việc tạo chế phẩm dạng bột giữ được hoạt tính cao là bước tiến quan trọng trong ứng dụng thực tiễn.

Dữ liệu có thể được trình bày qua bảng thống kê tần suất chủng Bt, biểu đồ phân bố hình thái tinh thể, biểu đồ tỷ lệ sâu chết theo thời gian và điều kiện lên men, giúp minh họa rõ ràng các phát hiện.

---

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tăng cường nghiên cứu và phát triển quy trình lên men công nghiệp: Tối ưu hóa các thông số pH, nhiệt độ, thành phần môi trường để nâng cao năng suất sinh khối và hoạt tính chế phẩm Bt, hướng tới sản xuất quy mô lớn trong vòng 2-3 năm.

2. Phát triển sản phẩm chế phẩm Bt đa dạng: Nghiên cứu phối hợp các chủng Bt có độc tố khác nhau để mở rộng phổ diệt sâu, tăng hiệu quả kiểm soát sâu tơ và các loài sâu hại khác, giảm thiểu nguy cơ kháng thuốc.

3. Ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp bền vững: Khuyến khích nông dân sử dụng chế phẩm Bt thay thế thuốc trừ sâu hóa học, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, triển khai trong 1-2 vụ mùa tiếp theo.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật sản xuất và sử dụng chế phẩm Bt cho cán bộ kỹ thuật và nông dân tại Thái Nguyên và các tỉnh lân cận, nâng cao nhận thức về thuốc trừ sâu sinh học.

5. Theo dõi và đánh giá hiệu quả lâu dài: Thiết lập hệ thống giám sát tác động của chế phẩm Bt trên môi trường và sâu hại, đánh giá hiệu quả kinh tế và sinh thái, điều chỉnh chiến lược sử dụng phù hợp.

---

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học: Nghiên cứu về vi khuẩn Bt, kỹ thuật phân lập, phân loại và ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học.

2. Chuyên gia và kỹ thuật viên trong lĩnh vực bảo vệ thực vật: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển và sử dụng chế phẩm sinh học trong kiểm soát sâu hại, giảm thiểu thuốc hóa học.

3. Doanh nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu sinh học: Tham khảo quy trình lên men, điều kiện sản xuất và đánh giá hiệu quả chế phẩm Bt để phát triển sản phẩm thương mại.

4. Nông dân và tổ chức nông nghiệp: Hiểu rõ về lợi ích và cách sử dụng thuốc trừ sâu sinh học Bt, góp phần nâng cao năng suất và bảo vệ môi trường.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis là gì?
   Bt là vi khuẩn gram dương, có khả năng sinh bào tử và protein tinh thể độc tố, được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học an toàn và thân thiện với môi trường.

2. Tại sao cần sử dụng thuốc trừ sâu sinh học thay vì hóa học?
   Thuốc sinh học có tính đặc hiệu cao, không gây ô nhiễm môi trường, không tích tụ độc tố và giảm nguy cơ kháng thuốc ở sâu hại.

3. Chế phẩm Bt có hiệu quả diệt sâu tơ như thế nào?
   Chủng Bt var. kurstaki TC 2.5 trong nghiên cứu đạt tỷ lệ diệt sâu tơ 100% ở nồng độ 10^5 bào tử/ml sau 3 ngày, cho thấy hiệu quả cao.

4. Điều kiện lên men tối ưu để sản xuất chế phẩm Bt là gì?
   pH từ 6,5 đến 7,5 và nhiệt độ từ 25 đến 35°C là điều kiện tốt nhất để vi khuẩn Bt sinh trưởng và tạo sản phẩm hiệu quả.

5. Làm thế nào để sử dụng chế phẩm Bt trong thực tế?
   Chế phẩm dạng bột hoặc lỏng được pha loãng và phun lên cây trồng, đặc biệt là các loại rau bị sâu tơ phá hoại, giúp kiểm soát sâu hiệu quả mà không gây hại cho môi trường.

---

Kết luận

• Đã phân lập và tuyển chọn thành công 81 chủng Bacillus thuringiensis từ 30 mẫu đất Thái Nguyên, với tần suất xuất hiện 0,76 và chỉ số Bt 0,53, cao hơn mức trung bình trong nước và thế giới.
• Chủng Bt var. kurstaki TC 2.5 được xác định có hoạt tính diệt sâu tơ cao nhất, đạt 100% tỷ lệ diệt sâu ở nồng độ 10^5 bào tử/ml.
• Xác định điều kiện lên men tối ưu cho chủng TC 2.5 là pH 6,5-7,5 và nhiệt độ 25-35°C, giúp nâng cao hiệu quả sản xuất chế phẩm.
• Đã tạo thành công chế phẩm Bt-TC2.5 dạng bột giữ được hoạt tính diệt sâu tơ cao sau 3 ngày thử nghiệm.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu tối ưu quy trình lên men và phát triển sản phẩm chế phẩm Bt quy mô công nghiệp, đồng thời thúc đẩy ứng dụng trong nông nghiệp bền vững.

Khuyến khích các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp phát triển quy trình sản xuất công nghiệp, đồng thời triển khai thử nghiệm thực địa để đánh giá hiệu quả lâu dài của chế phẩm Bt tại các vùng trồng rau và cây công nghiệp.

Hãy bắt đầu ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học Bt để bảo vệ mùa màng và môi trường ngay hôm nay!

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu khá thuận lợi và tốt đẹp [ 3]. Trong những năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn. Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ Sinh Luận văn thạc sỹ Sinh học 6 học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm. Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp.

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cộng sự đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11]. Đại cương về vi khuẩn Bt 1.

Sự phân bố của Bt Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng. Bt được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh Luận văn thạc sỹ Sinh học 7 thái phổ biến của Bt trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13].

Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. Đặc điểm hình thái Bt là thành viên của nhóm 1, chi Bacillus, là khuẩn gram dương, tế bào dạng hình que, kích thước 3-6μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Vi khuẩn hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào.

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn.Bt có khả năng sinh nội bào tử để chống lại những điều kiện bất lợi. Quá trình sống của Bt chia thành 3 giai đoạn: * Thể dinh dưỡng: Hình que, 2 đầu tù, thường đứng riêng hoặc có thể tạo thành chuỗi. Sinh sản bằng cách phân chia theo chiều ngang. * Nang bào tử: Tế bào trưởng thành, dạng hình trứng dài, to hơn thể dinh dưỡng, một đầu hình thành bào tử hình tròn (bầu dục), đầu kia hình thành tinh thể.

* Bào tử và tinh thể: Nang bào tử phát triển, vỡ ra giải phóng bào tử và tinh thể. Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hóa chất, áp suất thẩm thấu cao. Màng ngoài là phần sót lại cuả tế bào mẹ, chiếm khoảng 2-10% khối lượng khô của bào tử. Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi 3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng.

Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém với các cation. Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử.Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7-10 % dipicolinat canxi không chứa axit teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chưa nước là 70 %. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, nang bào tử, bào tử chất và vùng nhân.

Luận văn thạc sỹ Sinh học 8 A B Hình 1. Chủng Bt mang bào tử Hình 1. Hình dạng tế vào và tinh và tinh thể [24]. thể một số dưới loài Bt) [24].

a Lông roi (A) Tế bào vi khẩn Bt b Tế bào chứa bào tử và tinh thể (B) Hình dạng protein tinh thể của c. Protein tinh thể độc B. kustaki (C) Hình dạng protein tinh thể của B.isragensis Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm chiếm khoảng 25% khối lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, ovan, lập phương hoặc hình dạng không xác định… Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát ra ngoài [3],[13].thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus Các loài thuộc chi B. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B.

Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại bào tử tinh thể. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme Luận văn thạc sỹ Sinh học 9 Nhuộm Gram + (a) + + + + Phản ứng catalase + + + + + Khả năng chuyển động +/- (b) +/- - (c) - +/- Phản ứng khử nitrate + +/- + + - (d) Phân hủy tyrosine + + +/- - (d) +/- Kháng lysozyme + + + + - Phản ứng với lòng đỏ + + + + - trứng Lên men glucose kị khí + + + + - Phản ứng V-P + + + + - Sinh Axít từ mannitol - - - - + Làm tan huyết + + + - (d) - Sinh protein tinh thể - + - - - Chú thích: + (a): 90-100% số chủng phản ứng dương tính +/- (b): 50-50% số chủng phản ứng dương tính - (c): 90-100% số chủng phản ứng âm tính - (d): hầu hết các chủng phản ứng âm tính 1. Đặc điểm sinh hóa Bt không lên men trên môi trường arrabinoza, xylose, manitol nhưng tạo axit trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat.

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 – 45ºC. Nhiệt độ tối ưu là 20-30°C. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của là pH = 7. Bt có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [3].

Luận văn thạc sỹ Sinh học 10 1. Phân loại Bt Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:  Khả năng hình thành enzyme leucitinase  Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng  Đặc tính huyết thanh học  Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh được De Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2], [3]. Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường.

Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3], [13]. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn.

Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng. Luận văn thạc sỹ Sinh học 11 Tế bào vi khuẩn với Phân tử kháng thể kháng nguyên bề mặt với 2 vị trí liên kết đặc hiệu. Phản ứng ngưng kết. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H 1.

Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki Bacillus thuringiensis var. kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm 1901, Tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm 1951. Trong các thập kỷ gần đây, Bt var.

kurstaki đã trở thành phương tiện chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada. Đến năm 1986, việc sử dụng Bt var. kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối với sâu hại cây vân sam. Ở các nước khác, Bt var.

kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao. Bacillus thuringiensis var. kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao nhất.

Theo các tài liệu công bố, thì trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết với các typ huyết thanh đã có thì Bacillus thuringiensis var. kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%, sau là B.