Tổng quan nghiên cứu

Cây ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai tại Việt Nam, với diện tích trồng khoảng 1,1 triệu ha năm 2017, đóng góp lớn vào ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi khi chiếm tới 80% tổng sản lượng tiêu thụ. Tuy nhiên, năng suất ngô trung bình năm 2016/2017 chỉ đạt 4,60 tấn/ha, thấp hơn nhiều so với tiềm năng và các nước phát triển như Mỹ (11,08 tấn/ha). Nguyên nhân chính ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất là hạn hán, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu làm gia tăng tần suất và mức độ nghiêm trọng của các đợt hạn hán. Hạn hán tác động tiêu cực đến toàn bộ chu trình sinh trưởng của cây ngô, làm giảm khả năng thụ phấn, số lượng hạt trên bắp và cuối cùng là năng suất.

Mục tiêu nghiên cứu là tạo ra cây ngô chuyển gen mang gen ZmDREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn, nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn cho cây ngô thuần Việt Nam. Nghiên cứu tập trung phân lập gen ZmDREB2.7 từ giống ngô Tẻ vàng 1 – giống ngô địa phương có khả năng chịu hạn tốt, phân tích đặc điểm trình tự gen và protein, thiết kế vector biểu hiện gen dưới promoter cảm ứng hạn rd29A, chuyển gen vào cây ngô và đánh giá khả năng biểu hiện cũng như tính chịu hạn của cây chuyển gen. Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2016-2018.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển giống ngô biến đổi gen chịu hạn, góp phần nâng cao năng suất ngô nội địa, giảm nhập khẩu và tăng thu nhập cho người nông dân trong bối cảnh biến đổi khí hậu ngày càng phức tạp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về cơ chế sinh học và phân tử của tính chịu hạn ở thực vật, tập trung vào vai trò của nhân tố phiên mã DREB (Dehydration Responsive Element Binding) trong điều hòa biểu hiện gen đáp ứng hạn. Họ nhân tố phiên mã DREB thuộc họ AP2/ERF2, có khả năng bám vào trình tự DRE trên promoter các gen chịu hạn, điều chỉnh sự biểu hiện của các gen bảo vệ và điều hòa sinh lý cây khi thiếu nước.

Hai lý thuyết chính được áp dụng gồm:

  1. Cơ chế đáp ứng sinh lý và phân tử của cây khi gặp hạn: Cây thực hiện các thay đổi về hình thái, sinh lý như đóng khí khổng, tích lũy chất điều hòa thẩm thấu, tổng hợp protein bảo vệ và điều hòa biểu hiện gen thông qua các nhân tố phiên mã.

  2. Vai trò của nhân tố phiên mã DREB trong điều hòa gen chịu hạn: Gen ZmDREB2.7 được xác định là nhân tố phiên mã có khả năng kích hoạt mạnh các gen đáp ứng hạn, biểu hiện tăng khi cây chịu hạn và không ảnh hưởng tiêu cực đến kiểu hình cây.

Các khái niệm chính bao gồm: gen ZmDREB2.7, promoter cảm ứng hạn rd29A, vector biểu hiện pCAMBIA1300, chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, real-time PCR định lượng biểu hiện gen.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là mẫu DNA và RNA từ giống ngô Tẻ vàng 1 và dòng ngô thuần K7 được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Ngô. Cỡ mẫu gồm nhiều cây ngô ở các thế hệ T0, T1, T2 để đánh giá sự chuyển gen và biểu hiện gen.

Phương pháp nghiên cứu bao gồm:

  • Phân lập gen ZmDREB2.7: Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô, khuếch đại gen bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, nhân dòng vào vector pJET1.2, xác nhận trình tự bằng giải trình tự Sanger.

  • Thiết kế vector biểu hiện: Chèn gen ZmDREB2.7 vào vector trung gian pRTL2 dưới promoter rd29A, sau đó chuyển sang vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv.

  • Chuyển gen vào cây ngô: Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector biểu hiện để chuyển gen vào phôi non ngô dòng K7 theo quy trình đồng nuôi cấy, chọn lọc mô sẹo trên môi trường có hygromycin, tái sinh cây chuyển gen.

  • Định lượng số bản sao gen và biểu hiện gen: Sử dụng real-time PCR định lượng tuyệt đối để ước lượng số bản sao gen ZmDREB2.7 trong cây chuyển gen thế hệ T1, real-time PCR định lượng tương đối để đánh giá mức độ biểu hiện gen trong cây chuyển gen thế hệ T2 so với cây không chuyển gen, dưới điều kiện bình thường và xử lý hạn nhân tạo bằng dung dịch PEG 6000 20%.

  • Phân tích dữ liệu: Sử dụng phần mềm LightCycler® 96 để phân tích dữ liệu PCR, phương pháp chi bình phương (χ2) để đánh giá phân ly gen, so sánh mức độ biểu hiện gen giữa các mẫu.

Timeline nghiên cứu kéo dài khoảng 2 năm, từ phân lập gen, thiết kế vector, chuyển gen, đến đánh giá biểu hiện và tính chịu hạn của cây chuyển gen.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập thành công gen ZmDREB2.7tv từ giống ngô Tẻ vàng 1: Gen có chiều dài 1.327 bp, bao gồm vùng mã hóa 1.077 bp, vùng 5’UTR 207 bp và 3’UTR 53 bp. Trình tự gen tương đồng 98,02% với gen tham chiếu ngô B73, có 11 vị trí thay thế nucleotide và 4 vị trí thêm/mất nucleotide, trong đó 5 vị trí thay thế nucleotide làm thay đổi amino acid ở vùng đầu C của protein. Protein ZmDREB2.7tv có 358 amino acid, khối lượng phân tử 38,1 kDa, điểm đẳng điện 6,42, giữ nguyên domain bám DNA đặc trưng của họ AP2/ERF2.

  2. Thiết kế và xác nhận vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv thành công: Vector được xây dựng qua trung gian vector pRTL2 với promoter cảm ứng hạn rd29A, kiểm tra bằng enzyme giới hạn SacI, HindIII, BamHI và PCR xác nhận cấu trúc biểu hiện gen đúng chiều. Các plasmid tái tổ hợp có kích thước phù hợp, đảm bảo tính toàn vẹn của cấu trúc biểu hiện.

  3. Tạo cây ngô chuyển gen mang gen ZmDREB2.7tv: Phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào phôi non ngô dòng K7 đạt hiệu quả, cây chuyển gen thế hệ T0 được xác nhận có gen chuyển bằng PCR. Tỷ lệ phân ly gen ZmDREB2.7tv trong thế hệ T1 phù hợp với mô hình di truyền Mendel (χ2 < 3,841, α=0,05).

  4. Ước lượng số bản sao gen và biểu hiện gen trong cây chuyển gen: Real-time PCR định lượng tuyệt đối cho thấy số bản sao gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T1 dao động từ 1 đến 3 bản sao. Đánh giá biểu hiện gen bằng real-time PCR định lượng tương đối cho thấy cây chuyển gen thế hệ T2 có mức độ biểu hiện gen ZmDREB2.7tv tăng đáng kể khi xử lý hạn nhân tạo bằng PEG 6000 20% trong 6 giờ, cao hơn 3-5 lần so với cây không chuyển gen.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ giống ngô Tẻ vàng 1 với các biến đổi nucleotide và amino acid có thể góp phần vào khả năng chịu hạn đặc trưng của giống này. Việc giữ nguyên domain bám DNA cho thấy protein vẫn duy trì chức năng nhân tố phiên mã đặc hiệu.

Thiết kế vector biểu hiện với promoter cảm ứng hạn rd29A giúp gen ZmDREB2.7tv chỉ được biểu hiện khi cây gặp điều kiện hạn, tránh ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng bình thường, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về biểu hiện gen chịu hạn.

Hiệu quả chuyển gen và phân ly gen theo tỷ lệ Mendel chứng tỏ quy trình chuyển gen và chọn lọc cây chuyển gen được thực hiện thành công, tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Mức độ biểu hiện gen tăng rõ rệt dưới điều kiện hạn nhân tạo chứng minh gen ZmDREB2.7tv có vai trò quan trọng trong cơ chế đáp ứng hạn của cây ngô, phù hợp với các nghiên cứu trên Arabidopsis và các loài thực vật khác. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ cột so sánh mức độ biểu hiện gen giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen dưới điều kiện bình thường và hạn.

So với các nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới, nghiên cứu này góp phần bổ sung nguồn gen chịu hạn bản địa và quy trình chuyển gen phù hợp với dòng ngô thuần Việt Nam, mở ra hướng phát triển giống ngô biến đổi gen chịu hạn hiệu quả.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Mở rộng nghiên cứu đánh giá tính chịu hạn của cây chuyển gen trên đồng ruộng: Thực hiện các thử nghiệm đồng ruộng tại các vùng hạn hán phổ biến trong vòng 2-3 năm tới để đánh giá hiệu quả thực tế của cây chuyển gen, do Viện Nghiên cứu Ngô phối hợp với các trung tâm nông nghiệp địa phương thực hiện.

  2. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen và nhân giống cây chuyển gen: Nâng cao hiệu suất chuyển gen và nhân giống cây chuyển gen thế hệ tiếp theo nhằm tăng số lượng cây chuyển gen chất lượng, giảm chi phí và thời gian sản xuất, thực hiện trong 1-2 năm tiếp theo bởi nhóm nghiên cứu sinh học thực nghiệm.

  3. Nghiên cứu kết hợp gen ZmDREB2.7 với các gen chịu hạn khác: Tạo các dòng ngô chuyển gen đa gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn và các tính trạng nông học khác, tiến hành trong 3-5 năm với sự phối hợp của các phòng thí nghiệm công nghệ gen.

  4. Đẩy mạnh ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tạo giống ngô chịu hạn tại Việt Nam: Tăng cường đào tạo, chuyển giao công nghệ và hợp tác quốc tế để phát triển các giống ngô biến đổi gen phù hợp với điều kiện khí hậu và đất đai Việt Nam, thực hiện liên tục trong giai đoạn 2024-2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu chi tiết về phân lập gen, thiết kế vector và chuyển gen, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực nghiệm trong lĩnh vực tạo giống biến đổi gen.

  2. Chuyên gia và cán bộ kỹ thuật trong ngành nông nghiệp và giống cây trồng: Tham khảo để áp dụng công nghệ chuyển gen trong cải tạo giống ngô chịu hạn, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững.

  3. Doanh nghiệp sản xuất giống và công nghệ sinh học: Tài liệu hữu ích cho việc phát triển sản phẩm giống ngô biến đổi gen chịu hạn, nâng cao năng suất và giá trị kinh tế.

  4. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển giống cây trồng biến đổi gen, thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

  1. Gen ZmDREB2.7 có vai trò gì trong cây ngô?
    Gen ZmDREB2.7 mã hóa nhân tố phiên mã thuộc họ DREB, điều hòa biểu hiện các gen đáp ứng hạn, giúp cây ngô tăng khả năng chịu hạn mà không ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng bình thường.

  2. Tại sao chọn promoter rd29A để điều hòa gen chuyển?
    Promoter rd29A là promoter cảm ứng mạnh với điều kiện hạn, giúp gen ZmDREB2.7 chỉ được biểu hiện khi cây gặp hạn, tiết kiệm năng lượng và tránh tác động xấu đến cây trong điều kiện bình thường.

  3. Phương pháp chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu là gì?
    Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector biểu hiện để chuyển gen vào phôi non ngô dòng K7, phương pháp này cho hiệu quả cao và ít gây tổn thương mô cây.

  4. Làm thế nào để đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển?
    Sử dụng real-time PCR định lượng tương đối với gen actin làm đối chứng nội sinh, so sánh mức độ biểu hiện gen ZmDREB2.7 trong cây chuyển gen và cây không chuyển gen dưới điều kiện bình thường và hạn nhân tạo.

  5. Cây ngô chuyển gen có ảnh hưởng đến năng suất không?
    Nghiên cứu cho thấy cây chuyển gen biểu hiện gen ZmDREB2.7 tăng khả năng chịu hạn, dự kiến giúp duy trì hoặc nâng cao năng suất trong điều kiện hạn, tuy nhiên cần thử nghiệm đồng ruộng để xác nhận hiệu quả thực tế.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công gen ZmDREB2.7tv từ giống ngô Tẻ vàng 1 với trình tự và đặc điểm protein phù hợp chức năng nhân tố phiên mã chịu hạn.
  • Thiết kế và xây dựng vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv thành công, đảm bảo biểu hiện gen dưới điều kiện hạn.
  • Tạo được cây ngô chuyển gen mang gen ZmDREB2.7tv, phân ly gen theo tỷ lệ Mendel, số bản sao gen dao động từ 1-3 bản sao.
  • Cây chuyển gen thể hiện mức độ biểu hiện gen ZmDREB2.7tv tăng đáng kể khi xử lý hạn nhân tạo, chứng minh vai trò trong cơ chế chịu hạn.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển giống ngô biến đổi gen chịu hạn phù hợp với điều kiện Việt Nam, góp phần nâng cao năng suất và phát triển nông nghiệp bền vững.

Next steps: Tiến hành thử nghiệm đồng ruộng, tối ưu quy trình chuyển gen và nhân giống, nghiên cứu kết hợp đa gen chịu hạn.

Call-to-action: Khuyến khích các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan quản lý phối hợp phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tạo giống ngô chịu hạn tại Việt Nam.