Luận văn thạc sĩ về tách dòng và biểu hiện gen kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi ở Việt Nam

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hiền
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Thị Kim Lan
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành ở Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 0.2. Mục tiêu của đề tài
• 0.3. Điểm mới của đề tài
• 0.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC
• 1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
• 1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
• 1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
• 1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
• 1.1.5. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 1.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa
• 1.2. VECTOR TÁCH DÒNG
• 1.2.1. Các loại vector tách dòng
• 1.3. VECTOR BIỂU HIỆN
• 1.3.1. Các hệ thống biểu hiện gen
• 1.4. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. Sinh phẩm trong nghiên cứu
• 1.4.2. Hóa chất và môi trường
• 1.4.3. Cặp mồi dùng trong nghiên cứu
• 1.5. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 1.6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.6.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
• 1.6.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi
• 1.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.7.1. Tách chiết ADN tổng số
• 1.7.2. Kiểm tra ADN hệ gen bằng máy đo quang phổ
• 1.7.3. Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 1.7.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 1.7.5. Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1
• 1.8. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.8.1. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2
• 1.8.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.5
• 1.9. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về Trypanosoma evansi và bệnh tiên mao trùng

Trypanosoma evansi là một loại ký sinh trùng đơn bào gây bệnh tiên mao trùng ở gia súc, đặc biệt là trâu, bò và ngựa. Bệnh này có tỷ lệ mắc cao ở Việt Nam, đặc biệt tại các vùng núi và trung du. Kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Nghiên cứu này tập trung vào việc tách dòng gen và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2, một kháng nguyên có tính ổn định và đặc hiệu cao. Các phương pháp kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học được áp dụng để tạo ra dòng tế bào vi khuẩn biểu hiện gen này, nhằm phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.

1.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của Trypanosoma evansi

Trypanosoma evansi có cấu trúc đơn bào với kích thước nhỏ, hình dạng thon dài và một roi tự do. Kháng nguyên bề mặt của nó bao gồm hai loại: kháng nguyên ổn định và kháng nguyên biến đổi. Kháng nguyên ổn định không thay đổi trong quá trình ký sinh, trong khi kháng nguyên biến đổi liên tục thay đổi để né tránh hệ miễn dịch của vật chủ. Điều này làm cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh trở nên phức tạp. Nghiên cứu này tập trung vào kháng nguyên RoTAT 1.2, một kháng nguyên ổn định có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam

Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây ra đã được ghi nhận tại nhiều vùng ở Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi và trung du. Tỷ lệ mắc bệnh ở trâu và bò dao động từ 7% đến 30%, với tỷ lệ tử vong cao. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống và hiện đại đã được áp dụng, nhưng việc phát hiện sớm và chính xác vẫn là thách thức. Nghiên cứu này nhằm tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp từ gen RoTAT 1.2 để phát triển Kit chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao, giúp kiểm soát bệnh hiệu quả hơn.

II. Phương pháp nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen

Nghiên cứu này sử dụng các kỹ thuật phân tử như PCR và tách dòng gen để xác định và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi. Quy trình bao gồm tách chiết ADN tổng số, khuếch đại gen bằng PCR, tạo dòng gen vào vector biểu hiện, và biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Các bước này được thực hiện nhằm tạo ra protein tái tổ hợp có thể sử dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu miễn dịch học.

2.1. Tách chiết ADN và khuếch đại gen

ADN tổng số của Trypanosoma evansi được tách chiết từ mẫu máu gia súc nhiễm bệnh. Gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được khuếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của quá trình khuếch đại. Kết quả cho thấy gen RoTAT 1.2 có kích thước khoảng 1.2 kb, phù hợp với kỳ vọng.

2.2. Tạo dòng gen và biểu hiện protein

Gen RoTAT 1.2 được tạo dòng vào vector pET32a(+) và biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Quá trình biểu hiện protein được kích hoạt bằng IPTG, và protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực. Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot xác nhận sự hiện diện của protein RoTAT 1.2 với kích thước khoảng 45 kDa. Đây là cơ sở quan trọng để phát triển Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.

III. Kết quả và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã thành công trong việc tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi. Protein tái tổ hợp được tạo ra có thể sử dụng để phát triển Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng với độ nhạy và đặc hiệu cao. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh ở gia súc, đặc biệt tại các vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao như miền núi và trung du Việt Nam.

3.1. Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu

Nghiên cứu này đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của kháng nguyên bề mặt trong Trypanosoma evansi. Việc tách dòng và biểu hiện thành công gen RoTAT 1.2 mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh học phân tử và miễn dịch học, đặc biệt là trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ký sinh trùng.

3.2. Ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán bệnh

Sản phẩm của nghiên cứu là kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2, có thể được sử dụng để sản xuất Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Kit này có khả năng phát hiện đặc hiệu kháng thể kháng Trypanosoma evansi trong máu gia súc, giúp chẩn đoán nhanh và chính xác. Điều này góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra, đặc biệt tại các vùng nông thôn và miền núi Việt Nam.