Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm In Vitro Của Các Chất Phân Lập Từ Cây Muồng Lùn (Chamaecrista Pumila)

Nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn Chamaecrista pumila Lam K Larsen.

• Tác giả: Vũ Thùy Linh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thùy Dương
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm In Vitro Từ Cây Muồng Lùn
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về viêm
• 1.2. Khái niệm về viêm
• 1.3. Nguyên nhân gây viêm
• 1.4. Diễn biến cơ bản của quá trình viêm
• 1.5. Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào
• 1.6. Các đích tác dụng chống viêm hiện nay
• 1.7. Tổng quan về cây muồng lùn
• 1.7.1. Tên khoa học
• 1.7.2. Đặc điểm thực vật
• 1.7.3. Thành phần hóa học. Tác dụng sinh học
• 2. CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chuẩn bị mẫu thử
• 2.3. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 2.4. Dòng tế bào
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào
• 2.6.2. Phương pháp sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn sử dụng mô hình gây giải phóng NO trên đại thực bào
• 2.6.3. Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của chất tiềm năng nhất trên đại thực bào
• 2.6.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn
• 3.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào trên đại thực bào
• 3.3. Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO trên đại thực bào
• 3.4. Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm và các cơ chế liên quan của ML6
• 3.4.1. Giá trị IC50 trên tác dụng ức chế giải phóng NO
• 3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng đến hình thái đại thực bào
• 3.4.3. Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng IL-6 và IL-1β trên đại thực bào
• 3.4.4. Đánh giá tác dụng ức chế chuyển vị nhân của NF-κB trên đại thực bào
• 3.5. Đánh giá tác dụng ức chế quá trình pyroptosis trên đại thực bào
• 3.6. Đánh giá tác dụng ức chế hình thành nhóm oxy hoạt động trong đại thực bào
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Bàn luận về kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm của các chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat muồng lùn
• 4.2. Bàn luận về tác dụng chống viêm và một số cơ chế liên quan của ML6
• 4.3. Bàn luận về lựa chọn dòng tế bào nghiên cứu
• 4.4. Bàn luận về tác dụng ức chế giải phóng chất trung gian hóa học
• 4.5. Bàn luận về định hướng cơ chế tác dụng chống viêm
• KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm In Vitro Từ Cây Muồng Lùn

Cây muồng lùn (Chamaecrista pumila) đã được biết đến với nhiều tác dụng sinh học, đặc biệt là tác dụng chống viêm. Nghiên cứu này nhằm khám phá các hợp chất có trong cây muồng lùn và khả năng chống viêm của chúng thông qua các thí nghiệm in vitro. Viêm là một phản ứng sinh lý quan trọng, nhưng nếu không được kiểm soát, nó có thể dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng. Do đó, việc tìm kiếm các dược liệu tự nhiên có tác dụng chống viêm là rất cần thiết.

1.1. Cây Muồng Lùn Đặc Điểm và Thành Phần Hóa Học

Cây muồng lùn có tên khoa học là Chamaecrista pumila, thuộc họ Đậu. Phần trên mặt đất của cây thường được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh viêm. Thành phần hóa học của cây bao gồm nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, như flavonoid và alkaloid, có khả năng chống viêm và chống oxy hóa.

1.2. Tác Dụng Chống Viêm Của Cây Muồng Lùn

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây muồng lùn có tác dụng chống viêm mạnh mẽ. Các hợp chất chiết xuất từ cây này có khả năng ức chế sự giải phóng các chất trung gian gây viêm như NO và cytokine, từ đó giảm thiểu tình trạng viêm trong cơ thể.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm

Mặc dù cây muồng lùn có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu tác dụng chống viêm của nó vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là thiếu thông tin về cơ chế tác dụng của các hợp chất trong cây. Ngoài ra, việc xác định liều lượng và phương pháp chiết xuất cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của các hợp chất này.

2.1. Thiếu Thông Tin Về Cơ Chế Tác Dụng

Nhiều nghiên cứu hiện tại chỉ tập trung vào việc xác định hoạt tính chống viêm mà chưa đi sâu vào cơ chế tác dụng của các hợp chất. Điều này làm hạn chế khả năng ứng dụng thực tiễn của cây muồng lùn trong điều trị viêm.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Chiết Xuất và Định Lượng

Việc chiết xuất các hợp chất từ cây muồng lùn cần phải được thực hiện cẩn thận để đảm bảo giữ lại hoạt tính sinh học. Các phương pháp chiết xuất khác nhau có thể dẫn đến sự khác biệt lớn về hiệu quả của các hợp chất, do đó cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa quy trình này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm In Vitro

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp in vitro để đánh giá tác dụng chống viêm của các hợp chất phân lập từ cây muồng lùn. Các mô hình tế bào được sử dụng để kiểm tra khả năng ức chế sự giải phóng NO và các cytokine gây viêm. Phương pháp này cho phép đánh giá chính xác hiệu quả của các hợp chất trong điều kiện kiểm soát.

3.1. Mô Hình Tế Bào Sử Dụng Trong Nghiên Cứu

Mô hình tế bào đại thực bào được sử dụng để đánh giá tác dụng chống viêm của các hợp chất. Các tế bào này có khả năng phản ứng mạnh mẽ với các tác nhân gây viêm, từ đó giúp xác định hiệu quả của các hợp chất chiết xuất từ cây muồng lùn.

3.2. Phương Pháp Đánh Giá Tác Dụng Chống Viêm

Các phương pháp như ELISA và xét nghiệm MTT được áp dụng để đánh giá tác dụng chống viêm. Những phương pháp này cho phép đo lường chính xác nồng độ NO và các cytokine trong môi trường nuôi cấy tế bào, từ đó xác định được hiệu quả của các hợp chất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm Của Cây Muồng Lùn

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất phân lập từ cây muồng lùn có tác dụng chống viêm rõ rệt. Các hợp chất này không chỉ ức chế sự giải phóng NO mà còn làm giảm nồng độ các cytokine gây viêm như IL-6 và IL-1β. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của cây muồng lùn trong điều trị các bệnh viêm.

4.1. Đánh Giá Tác Dụng Ức Chế Giải Phóng NO

Các hợp chất từ cây muồng lùn cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ sự giải phóng NO trong mô hình tế bào đại thực bào. Kết quả này cho thấy tiềm năng của cây muồng lùn trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến viêm.

4.2. Tác Dụng Giảm Nồng Độ Cytokine

Nghiên cứu cũng ghi nhận sự giảm nồng độ cytokine IL-6 và IL-1β trong môi trường nuôi cấy tế bào. Điều này cho thấy các hợp chất từ cây muồng lùn có khả năng điều chỉnh phản ứng viêm một cách hiệu quả.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm

Nghiên cứu về tác dụng chống viêm của cây muồng lùn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các dược liệu tự nhiên. Kết quả cho thấy cây muồng lùn có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh viêm. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ hơn về cơ chế tác dụng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Y Học

Cây muồng lùn có thể trở thành một nguồn dược liệu quý giá trong điều trị các bệnh viêm. Việc phát triển các sản phẩm từ cây này có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ so với các thuốc chống viêm hiện có.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các hợp chất chính có trong cây muồng lùn và cơ chế tác dụng của chúng. Điều này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phát triển các sản phẩm dược phẩm hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đại cương về viêm 1. Khái niệm về viêm Viêm là một phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, nhưng cũng được coi là phản ứng bệnh lý do quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng các cơ quan. Các đặc trưng của viêm bao gồm: sưng, nóng, đỏ, đau [1], [16].

Nguyên nhân gây viêm Mọi nguyên nhân dẫn đến tổn thương và làm chết một lượng tối thiểu tế bào tại chỗ đều có thể gây viêm tại vị trí đó. Nguyên nhân gây viêm được chia thành hai nhóm chính theo nguồn khởi phát của phản ứng viêm là nguyên nhân ngoại sinh và nội sinh [1], [16]. Nguyên nhân ngoại sinh - Cơ học: từ sây sát nhẹ đến chấn thương nặng, gây phá hủy tế bào và mô. - Vật lý: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hoá protid tế bào gây tổn thương enzym, tia xạ (UV, tia X) tạo ra các gốc oxy tự do gây phá hủy một số enzym oxy hóa và gây tổn thương ADN.

- Hoá học: các acid, base mạnh, các chất hoá học (thuốc trừ sâu, các độc tố) gây huỷ hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym. - Sinh học: virus, vi khuẩn, ký sinh trùng đơn bào, đa bào hoặc nấm [1], [16]. Nguyên nhân nội sinh Có thể gặp các nguyên nhân như thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng. Ngoài ra, viêm có thể xuất phát từ phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể, như viêm cầu thận, viêm trong hiện tượng Arthus [1], [16].

Diễn biến cơ bản của quá trình viêm Tại ổ viêm, có 4 quá trình biến đổi chủ yếu: rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa, tổn thương mô và tăng sinh tế bào. Các quá trình này diễn ra đan xen và liên quan chặt chẽ với nhau [1]. Rối loạn tuần hoàn Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm xuất hiện sớm, ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể. Biến đổi này gồm 4 hiện tượng chính:  Rối loạn vận mạch Ngay khi các yếu tố gây viêm tác động, ổ viêm lần lượt xuất hiện các hiện tượng sau: Co mạch: Hiện tượng co mạch có tính phản xạ xảy ra rất sớm và rất ngắn do thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại [1], [30].

3 Sung huyết động mạch: Xảy ra ngay sau co mạch, là sự giải phóng các enzym từ lysosom của tế bào chết, các hóa chất trung gian có hoạt tính từ tế bào mast và bạch cầu hay các sản phẩm tạo ra sau quá trình thực bào của bạch cầu. Động mạch vi tuần hoàn giãn rộng, tăng cả lưu lượng lẫn áp lực máu. Biểu hiện bên ngoài của sung huyết động mạch là máu đỏ tươi, căng phồng, đau và nóng [1], [30]. Sung huyết tĩnh mạch: Thần kinh vận mạch bị tê liệt, các chất gây giãn mạch ứ lại nhiều hơn tại ổ viêm.

Ổ viêm bớt nóng, từ màu đỏ tươi của giai đoạn sung huyết động mạch chuyển sang màu tím sẫm, phù do tăng tính thấm, cảm giác đau giảm, chuyển sang đau âm ỉ do hóa chất trung gian và các ion K+, H+ tích tụ lại. Quá trình này giúp dọn sạch ổ viêm, ngăn cản sự lan rộng của các tác nhân gây bệnh [1], [30]. Ứ máu: Sau sung huyết tĩnh mạch, hiện tượng ứ máu xuất hiện do một số cơ chế như bạch cầu bám vào thành mạch, cản trở lưu thông máu, tế bào nội mô hoạt hóa và phì đại làm xuất hiện nhiều tế bào bám dính, các chất dãn mạch như NO, histamin làm tăng tính thấm dẫn đến máu đặc quánh, tăng độ nhớt máu tạo ma sát lớn. Hiện tượng ứ máu có vai trò cô lập ổ viêm, tăng cường quá trình sửa chữa ô viêm và khiến các yếu tố gây bệnh không thể lan rộng [1], [30].

 Tạo dịch rỉ viêm Dịch rỉ viêm là sản phẩm xuất tiết tại ổ viêm xuất hiện từ giai đoạn sung huyết động mạch và có tính chất bảo vệ. Tuy nhiên, lượng lớn dịch rỉ viêm sẽ gây chèn ép mô xung quanh gây đau nhức hoặc hạn chế vận động các cơ quan. Dịch rỉ viêm gồm 2 thành phần chính: Các thành phần bình thường từ máu thoát ra như nước, muối, protein huyết tương và các thành phần hữu hình của máu tích tại ổ viêm (gồm hồng cầu, tiểu cầu và chủ yếu là bạch cầu) [1], [30]. Các chất mới được hình thành do rối loạn chuyển hóa và tổn thương mô, bao gồm: các hóa chất trung gian như histamin, serotonin, acetylcholin; các protein khối lượng phân tử nhỏ từ 8 – 12 acid amin; các acid nhân; các enzym do hoại tử tế bào [1], [30].

 Bạch cầu xuyên mạch Bạch cầu rời khỏi dòng trục, tiến về phía ngoại vi tới bề mặt nội mô thành mạch khi tính thấm thành mạch tăng, có sự thoát mạch và máu chảy chậm. Bạch cầu trườn theo vách mạch, bám dính và xuyên mạch [1]. Tùy thuộc vào bản chất của tác nhân gây viêm, giai đoạn viêm mà các loại bạch cầu tới vị trí viêm sẽ khác nhau. Ở đa số giai đoạn viêm cấp, giai đoạn đầu chủ yếu là bạch cầu trung tính, tiếp theo là bạch cầu mono, cuối cùng là bạch cầu ái toan [1].

4  Bạch cầu thực bào Bạch cầu thực bào là hiện tượng bạch cầu bắt giữ, tiêu diệt yếu tố gây viêm. Có hai cơ chế chính là phụ thuộc oxy (nhờ quá trình oxy hóa của NADPH oxidase, myeloperoxidase và NO synthetase), và cơ chế không phụ thuộc oxy (nhờ các enzym trong lysosom) [1]. Rối loạn chuyển hóa  Rối loạn chuyển hóa glucid Ở giai đoạn sung huyết động mạch, sự chuyển hóa glucid chủ yếu là ái khí, tạo ra CO2. Khi bắt đầu có chuyển hóa yếm khí sẽ tạo ra acid lactic tích tụ lại trong ổ viêm, do vậy pH giảm dầu từ ngoài vào trong [1].

 Rối loạn chuyển hóa lipid Tại ổ viêm, lượng acid béo, lipid và cetonic đều tăng cao. Ngoài tác động của yếu tố gây viêm, acid arachidonic chuyển hóa thành prostaglandin và leucotrien sẽ gây giãn mạch mạnh, gây sốt [1].  Rối loạn chuyển hóa protid Chuyển hóa protid tăng do hoạt tính cao của các enzym protease và cytokin TNF. Các chất chuyển hóa như polypeptid và acid amin tăng lên và tích tụ tại ổ viêm [1].

Tổn thương mô Tại ổ viêm thường bao gồm các tổn thương tiên phát và tổn thương thứ phát. Tổn thương tiên phát phụ thuộc vào nguyên nhân gây viêm, có thể rất nhỏ (trầy xước) hoặc rất lớn (dập nát, nhiễm khuẩn) gây hoại tử tế bào. Tổn thương thứ phát do những rối loạn tại ổ viêm, phụ thuộc vào cường độ của nguyên nhân và mức độ phản ứng của cơ thể [1]. Tăng sinh tế bào Viêm bắt đầu bằng tổn thương tế bào và kết thúc bằng quá trính tăng sinh, tái tạo, làm lành vết thương.

Giai đoạn đầu quá trình viêm có sự tăng sinh các loại tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân và lympho bào. Ở cuối quá trình viêm, sự tăng sinh vượt mức hoại tử giúp ổ viêm được sửa chữa. Các tế bào nhu mô của cơ quan bị viêm có thể tái sinh đầy đủ, cấu trúc và chức năng vẫn được phục hồi. Tuy nhiên, một phần nhu mô có thể thay thế bằng mô xơ [1].

Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào Triệu chứng của phản ứng viêm được đóng góp chủ yếu bởi các chất trung gian hóa học. Trong viêm cấp tính, các chất này có nguồn gốc từ tế bào hoặc từ huyết tương. Các chất trung gian có nguồn gốc từ tế bào thường nằm trong các hạt nội bào và sẽ được tiết ra hoặc được tổng hợp mới khi tế bào được kích thích bởi tác nhân gây viêm [25], [30].1: Các chất trung gian hóa học có nguồn gốc từ tế bào Các acid amin vận mạch: histamin, serotonin Enzym lysosom Được tế Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) bào tiết ra hoặc tân tạo Prostagladin, leukotrien Nitric oxid và các nitric oxid synthase Cytokin  Các acid amin vận mạch Histamin Histamin dự trữ nhiều nhất trong hạt của tế bào mast, được giải phóng khi tế bào mast thoái hóa để đáp ứng với các kích thích. Histamin được giải phóng gây giãn và tăng tính thấm tiểu động mạch [42].

Serotonin Serotonin (5-hydroxytryptamin) là chất trung gian có sẵn trong tiểu cầu và một số tế bào thần kinh nội tiết. Serotonin có tác dụng giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch [15].  Enzym lysosom Enzym lysosom do bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân tiết ra. Khi được giải phóng, enzym lysosom sẽ tiêu diệt vi sinh vật, gây phá hủy mô do phân huỷ các đại phân tử và peroxid hóa lipid của màng tế bào [7], [9].

 Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) có nguồn gốc từ phospholipid, thường là phosphatidylcholin [7], [9]. Các tế bào như tiểu cầu, tế bào nội mô, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính tổng hợp PAF với số lượng nhỏ. Phospholipase A2 (PLA2) bất hoạt hoạt động của PAF và hoạt động của PAF được kích thích khi tế bào bị viêm. 6 Ngoài vai trò hoạt hóa và kích hoạt tiểu cầu, PAF có chức năng tăng tính thấm, tăng phản ứng oxy hóa, giãn mạch và hóa ứng động các tế bào viêm [9].

 Các chất chuyển hóa của acid arachidonic (prostaglandin, leukotrien) Acid arachidonic (AA) sinh ra từ phospholipid của màng tế bào dưới tác động của PLA2 khi chịu các kích thích hoặc thông qua các chất trung gian khác. AA chuyển hóa và tạo thành các chất trung gian của phản ứng viêm bao gồm prostaglandin, leukotrien [39]. Prostaglandin Enzym cyclooxygenase (COX) chuyển hóa AA tạo thành prostaglandin (PGs) và thromboxan (prostanoids) [9]. Có 4 loại PG có hoạt tính sinh học chính được tạo ra trong cơ thể: prostaglandin E2 (PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α).

Lượng PG rất ít hoặc hầu như không có ở các mô bình thường. Trong phản ứng viêm, mức độ tổng hợp PG thay đổi đáng kể khi có sự xâm nhập của bạch cầu và các tế bào miễn dịch. PG làm tăng tính thấm thành mạch, gây giãn mạch, sốt và khuếch đại cơn đau [7], [9]. LT được phân thành 4 loại bao gồm cysteinyl leukotrien, LTB4, LTG4 và LTB5.

Trong đó, LTB4 là LT điển hình trong phản ứng viêm; LTB4 kích thích hoá ứng động bạch cầu trung tính, kích hoạt bạch cầu trung tính thoái hoá và giải phóng các chất trung gian gây viêm [17]. Ngoài ra, LT có tác dụng mạnh trong co thắt phế quản và tăng tính thấm tĩnh mạch [7].  Các nhóm oxy hoạt động và nito oxid Các nhóm oxy hoạt động Nhóm oxy hoạt động (ROS) bao gồm các gốc oxy tự do như anion superoxid, hydroxyl, hydroperoxyl.