CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Genistein Genistein [Hình 1.] có công thức phân tử là C15H10O5 (5,7-dihydroxy-3-(4- hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-một) một hợp chất tự nhiên có cấu trúc thuộc nhóm hợp chất isoflavone. 1: Cấu trúc hóa học của genistein Genistein là một isoflavone chính có trong đậu tương và một số loại thực vật như: cây lupin, đậu fava, đậu nành, sắn dây. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, genistein có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường [1] [2] [3].
Bệnh tiểu đường là do nồng độ glucose trong máu tăng cao so với bình thường. Glucose là sản phẩm của quá trình thủy phân carbohydrate sẽ làm tăng nồng độ đường glucose trong máu. Quá trình này được xúc tác bởi enzyme glucosidase. Vì vậy, nếu enzyme này bị ức chế sẽ làm giảm lượng đường glucose trong máu và đây được xem là một phương pháp điều trị bệnh tiểu đường.
Thử nghiệm in vitro cho thấy genistein ức chế mạnh α-glucosidase. Ngoài ra, cơ chế ức chế α-glucosidase bởi genistein đã được công bố [4]. Tuy nhiên, bản chất ức chế của genistein đối với α-glucosidase và động học của quá trình ức chế chưa được nghiên cứu đầy đủ. Vì vậy, mục tiêu của luận văn là làm sáng tỏ thêm cơ chế và động học của quá trình ức chế α-glucosidase bởi genistein thông qua các phép đo phổ phát huỳnh quang và động học enzyme.
Hiện tượng dập tắt huỳnh quang Khi chiếu xạ liên tục vào phân tử có khả năng phát huỳnh quang F. Phân tử phát huỳnh quang sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F*) [Hình 1. Từ 3 trạng thái kích thích, F* có thể quay về trạng thái nền thông qua quá trình phát xạ và quá trình phi phát xạ. 2: Hiện tượng dập tắt huỳnh quang Tốc độ quá trình phát xạ được xác định bởi phương trình (1): vf = kf[F*] (1) (Trong đó kf là hằng số tốc độ quá trình phát xạ) Tốc độ quá trình phi phát xạ được xác định bởi phương trình (2): vt = kt[F*] (2) (Trong đó kt là tổng các hằng số tốc độ của các quá trình phi phát xạ) Trong điều kiện kích thích liên tục thì tốc độ hình thành F* và tốc độ giảm hoạt F*→ F là như nhau.
Nồng độ F* được xác định bởi phương trình (3): 𝐈𝐚 [F*] = (3) 𝒌𝐟 +∑𝒌𝐭 Trong đó: Ia là tốc độ hình thành (F*). Nếu trong dung dịch có phân tử dập tắt huỳnh quang Q thì ngoài hai quá trình phát xạ và phi phát xạ để F* quay về trạng thái nền F thì F* có thể giảm hoạt thông qua quá trình dập tắt huỳnh quang lưỡng phân tử theo phương trình (4): 4 F* + Q → F + Q, vQ = kq[F*][Q] (4) Nồng độ của [F*] khi có Q là: 𝐈𝐚 [F*] = (5) 𝒌𝐟 +∑𝒌𝐭 +𝒌𝐪 [𝐐] Hiệu suất lượng tử (tỷ số giữa tốc độ phát huỳnh quang F*→F và tốc độ hình thành F*) khi không có Q được biểu diễn bởi phương trình (6): 𝒌 [𝐅∗]𝟎 𝒌𝐟 𝝋𝟎𝒇 = 𝐟 = (6) 𝐈𝐚 𝒌𝐟 + ∑𝒌𝐭 Hiệu suất lượng tử khi có Q được biểu diễn bởi phương trình (7): 𝒌 [𝐅∗]0 𝒌𝐟 𝝋𝒇 = 𝐟 = (7) 𝐈𝐚 𝒌𝐟 +∑𝒌𝐭 +𝒌𝐪 [𝐐] Tỷ lệ của hai hiệu suất lượng tử là: 𝝋𝟎 𝒇 𝒌 +∑𝒌𝐭 +𝒌𝐪 [𝐐] 𝒌𝐪 [𝐐] = 𝐟 = 𝟏+ = 1 + kqτ0 [Q] = 1 + Ksv[Q] (8) 𝝋𝒇 𝒌𝐟 + ∑𝒌𝐭 𝒌𝐟 + ∑𝒌𝐭 1 o = 𝑘f + 𝑘t là thời gian sống của F* khi không có Q. Phương trình (8) được gọi là phương trình Stern-Volmer và Ksv là hằng số Stern-Volmer. Hằng số Ksv là tỷ lệ của hằng số dập tắt lưỡng phân tử so với hằng số phân rã đơn phân tử và thứ nguyên là L.
Vì hiệu suất lượng tử tỉ lệ với cường độ phát huỳnh quang. Nếu gọi F0 và F là cường độ phát huỳnh quang khi không có Q và có mặt Q trong dung dịch thì: 𝑭𝟎 = 1 + Ksv[Q] (9) 𝑭 Như vậy, hằng số Stern – Volmer Ksv là hệ số gốc của phương trình (9). 5 Trong cơ chế dập tắt huỳnh quang động học, giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng là giai đoạn hình thành phức chất trung gian [FQ]* với hằng số tốc độ kd (difusion controlled limit). Sai lệch khỏi phương trình Stern-Volmer Khi có mặt của chất dập tắt huỳnh quang Q thì quá trình dập tắt huỳnh quang F* bởi Q có thể xảy ra theo hai cơ chế hoặc dập tắt huỳnh quang động (dynamic quenching) hoặc dập tắt huỳnh quang tĩnh (static quenching) hoặc cả hai [5] theo phương trình (11): Động: F* + Q [FQ]* F+Q+∆ hv (11) Tĩnh: F+Q [FQ] Cơ chế dập tắt huỳnh quang động: F* và Q tương tác với nhau.
Quá trình dập tắt này không phát xạ. Ngoài ra, chất dập tắt phải khuếch tán và va chạm với F* trong suốt thời gian sống của F*. Vì Q tương tác với F* nên quá trình dập tắt huỳnh quang động làm thay đổi thời gian sống của F*. Cơ chế dập tắt huỳnh quang tĩnh: F và Q tương tác hình thành phức chất [FQ] ở trạng thái nền.
Quá trình này không làm thay đổi thời gian sống của F*. Nếu có sự tham gia của quá trình dập tắt huỳnh quang tĩnh thì thông tin về quá trình tạo phức chất giữa F và Q được biểu diễn bằng phương trình (12) [6] [7]. Hiện tượng phát huỳnh quang của enzyme hoặc protein: Có 3 amino acid trong enzyme có khả năng phát huỳnh quang bao gồm: Tryptophan, tyrosin, phenylalanine [Hình 1. 3: Cấu trúc hóa học của tryptophan Hình 1.
4: Cấu trúc hóa học của tyrosin Hình 1. 5: Cấu trúc hóa học của phenylalanine Nếu kích thích với bước sóng thích hợp sẽ thu được các phổ phát huỳnh quang của từng amino acid [Hình 1. 6: Phổ hấp thụ (a) và phổ phát xạ (b) của tryptophan, tyrosin, phenylalanine Như vậy nếu một chất ức chế có tương tác với enzyme, cụ thể là có tương tác với các amino acid này thì khi có hiện diện của chất ức chế cường độ phát huỳnh quang của enzyme sẽ thay đổi. Dựa vào hiện tượng này có thể xác định động học của quá trình dập tắt huỳnh quang của enzyme bởi các chất ức chế.
Phức chất phát huỳnh quang giữa enzyme và ANS (8-anilinonaphthalene-1- sulfonic acid) ANS [Hình 1.7] có thể tạo phức với enzyme thông qua tương tác kỵ nước, phức chất này có thể phát huỳnh quang khi được kích thích ở bước sóng thích hợp [8] [9]. Nếu một chất ức chế có tương tác với enzyme thông qua tương tác kỵ nước thì chất ức chế này có thể cạnh tranh việc tạo phức giữa ANS với enzyme hay nói cách khác cường độ phát huỳnh quang của phức [ANS – enzyme] sẽ giảm khi có mặt của chất ức chế. Bằng phương pháp này có thể xác định loại liên kết của chất ức chế với enzyme. 7: Cấu trúc của ANS (8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid) 8 1.
Động học Enzyme Chất ức chế có thể ức chế enzyme thông qua các cơ chế: Ức chế cạnh tranh [Hình 1.8] hoặc ức chế không cạnh tranh [Hình 1.9] hoặc cả hai. 8: Ức chế cạnh tranh Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition): Chất nền (substrate) sẽ liên kết với khoang gắn kết của enzyme. Tiếp theo enzyme sẽ xúc tác phản ứng và tạo ra sản phẩm. Tuy nhiên, khi có mặt của chất ức chế (inhibitor) thì chất ức chế có thể liên kết vào cùng khoang gắn kết với chất nền.
Lúc này chất ức chế sẽ cạnh tranh với chất nền tại khoang gắn kết. Chất ức chế này được gọi là chất ức chế cạnh tranh. 9: Ức chế không cạnh tranh Chất ức chế không cạnh tranh (Non-Competitive inhibition): Khi không có mặt chất ức chế thì vai trò xúc tác của enzyme vẫn xảy ra bình thường, nghĩa là chất nền sẽ gắn kết vào khoang gắn kết trên enzyme. Tuy nhiên, khi có mặt của chất ức chế và chất ức chế không gắn vào đúng khoang gắn kết của chất nền mà gắn vào một trí khác (khoang gắn kết khác) trên enzyme.
Điều này làm khoang gắn kết của chất nền bị thay đổi hình dạng và lúc này chất nền không thể gắn vào khoang gắn kết. Chất ức chế này gọi là chất ức chế không cạnh tranh. Chất ức chế không cạnh tranh (Un-Competitive inhibition): Chỉ liên kết với phức hợp enzym-cơ chất chứ không liên kết với enzym tự do. Liên kết cơ chất có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc xảy ra trong enzym và làm lộ ra vị trí liên kết chất ức chế hoặc chất ức chế có thể liên kết trực tiếp với cơ chất liên kết với enzym.
Trong cả hai trường hợp, chất ức chế không cạnh tranh với cơ chất để có cùng vị trí liên kết, do đó không thể khắc phục sự ức chế bằng cách tăng nồng độ cơ chất. Cả Km và Vmax đều thay đổi, nhưng một dạng động học đặc biệt xuất hiện trong các điều kiện trạng thái ổn định. Việc xác định cơ chế ức chế có thể dựa vào đồ thị Lineweaver-Burk thông qua phương trình (14) [10] [11] [12]. 𝟏 𝑲𝒎 +[𝑺] 𝑲𝒎 𝟏 𝟏 = = + (14) 𝒗 𝒗𝒎𝒂𝒙 [𝑺] 𝒗𝒎𝒂𝒙 [𝑺] 𝒗𝒎𝒂𝒙 10 Trong đó, v là tốc độ phản ứng, vmax là tốc độ phản ứng cực đại.
Km = [S] khi v = vmax/2. Như vậy Km là nồng độ của chất nền mà tại đó v = vmax/2 với vmax là tốc độ cực đại. Km là hằng số Michaelis, xác định ái lực của chất nền với ezyme. Nếu Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn và ngược lại.
Bằng cách xây dựng đồ thị 1/v (1/OD) với 1/[S] sẽ xác định được Km [Hình 1. 10: Đồ Thị Lineweaver−Burk Dựa vào kết quả thực nghiệm xây dựng đồ thị Lineweaver−Burk có thể xác định cơ chế ức chế của một chất ức chế đối với enzyme bằng cách thay đổi nồng độ của chất nền và chất ức chế. 11: Ức chế cạnh tranh Khi nồng độ chất ức chế tăng thì ái lực của chất nền và enzyme giảm, nghĩa là Km tăng nồng độ chất nền tại đó có 1/v = 1/vmax muốn đạt vmax thì cần tăng nồng độ chất nền khi có chất ức chế, nghĩa là Km tăng. 12: Ức chế không cạnh tranh 12 Ức chế không cạnh tranh sẽ làm thay đổi vmax (ngăn cản sự hình thành sản phẩm) chứ không ảnh hưởng đến ái lực của của chất nền đối với enzyme nên Km không đổi.
(c) Cả ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh [Hình 1. 13: Ức chế vừa cạnh tranh vừa không cạnh tranh Ức chế cạnh tranh làm thay đổi ái lực của chất nền với enzyme, nghĩa là làm thay đổi Km nhưng vmax không đổi (vào đúng khoang gắn kết của chất nền) và ức chế không cạnh tranh làm thay đổi hoạt độ enzyme nên vmax thay đổi, chứ ko thay đổi Km (khác khoang gắn kết).