Đặt vấn đề Với sự đa đạng của cộng đồng vi sinh vật có ích trong đất, nhưng việc khai thác và ứng dụng các nguồn vi sinh vật có ích vào sản xuất còn nhiều hạn chế. Ngày nay, các nhà khoa học trên thế giới cũng như nước ta đã và đang tăng cường nghiên cứu để ứng dụng nhiều hơn vai trò của vi sinh vật trong nông nghiệp. Nhiều chế phẩm sinh học đã đáp ứng được nhu cầu của xã hội trước nguy cơ ô nhiễm môi trường, biến đổi khí hậu, an toàn thực phẩm. Vi sinh vật có cấu tạo đơn giản nhưng lại có khả năng phân chia, sinh sản rất nhanh với hệ enzyme phong phú có khả năng phân hủy hầu như mọi dạng vật chất trong tự nhiên.
Việc tìm ra những loài vi sinh vật có ích sống trong đất vùng rễ và nội sinh trong cây mang ý nghĩa thiết thực cho nền nông nghiệp hiện đại. Vì vậy, việc sử dụng những loài vi sinh vật này giúp nâng cao năng suất cây trồng một cách an toàn, bền vững và thân thiện với môi trường. Hàm lượng đạm trong không khí tồn tại dưới hình thức N2 có thể xem như nguồn đạm vô tận cho cây xanh đưa vào chuỗi thức ăn. Ước tính hằng năm có khoảng 160 – 176 triệu tấn N2 khí quyển được cố định và chuyển hóa thành các dạng đạm khác nhau nhờ vi khuẩn cố định đạm (Hardy và Holsten, 1972; Gibson, 1995).
Lượng đạm này gấp đôi so với lượng phân đạm sản xuất mỗi năm của toàn thế giới mà lại không tốn chi phí và không gây ô nhiễm môi trường. Nhiều vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh đã được công bố là có khả năng cố định đạm. Sự tồn lại lân khó tiêu trong đất đa phần là do hoạt động sản xuất nông nghiệp của con người.000 tấn P2O5 được bón vào đất nông nghiệp ở đồng bằng sông Cửu Long nhưng cây trồng chỉ sử dụng khoảng 1/3 (Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh, 2006). Vì tế bào có thể hút được nhiều loại lân nhưng hấp thụ cao nhất là ở dạng HPO42- hoặc H2PO4-.
Tuy nhiên, dạng hòa tan trong đất này thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (Goldstein, 1994). Dạng phổ biến của lân là không tan, thường gặp trong đá dưới dạng apatite, hydroxyapatite, oxyapatite hay các dạng kết hợp với sắt, nhôm, mangan. Ngoài ra, đất nông nghiệp còn có thể chứa một lượng lớn lân nguồn gốc từ việc bón phân lân vô cơ thường xuyên mà cây trồng không hấp thu hết, sau đó bị cố kết trong đất dưới dạng khó tan. Nhiều loài vi khuẩn cũng đã được mô tả về khả năng chuyển hóa lân khó tan thành dạng mà cây xanh có thể hấp thu được.
Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy nhiều loài vi sinh vật đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh vừa có khả năng cố định đạm, vừa hòa tan được lân khó tan, thậm chí là phân giải các hợp chất hữu cơ, các hợp chất chứa kali 1 như kaolinite, illite, montmorilonite, v. (Lin Qi-mei et al., 2002; Zhao et al. Các loài vi sinh vật này có thể bổ sung nguồn dinh dưỡng cơ bản cho cây mà lại hết sức thân thiện với môi trường. Muốn có chế phẩm phân bón vi sinh tốt, cần phải chọn lọc được các chủng vi sinh vật có sức cạnh tranh lớn, thích ứng rộng, có khả năng cung cấp các dưỡng chất thiết yếu cho cây trồng; đồng thời sinh tổng hợp được các chất tăng trưởng thực vật.
Bên cạnh đó, vi sinh vật được phân lập từ cây trồng và vùng đất bản địa sẽ đạt được trạng thái sinh trưởng tốt nhất, thân thiện với môi trường và có hiệu quả cao nhất khi được chủng trở lại loại cây trồng và vùng đất đó. Đất phèn có môi trường axit cao trong đó nhôm phóng thích và các kim loại nặng hòa tan, các cộng đồng vi khuẩn trong loại đất này có một cấu trúc hoàn toàn khác với những vi khuẩn trong các môi trường khác. Tuy nhiên, các hệ sinh thái vi khuẩn trong đất phèn rất ít được biết đến về mặt chức năng hoặc cấu trúc cộng đồng. Phân lập vi sinh vật và nghiên cứu chức năng của vi khuẩn và các động thái của cộng đồng vi khuẩn trong đất phèn sẽ thể hiện một bước quan trọng trong việc đạt được một sự hiểu biết về sự hình thành và cải tạo đất phèn.
Bên cạnh những trở ngại trong canh tác do khí hậu bất thường, sự gia tăng phát thải độc chất từ đất phèn có thể đưa đến sự thay đổi hệ sinh thái đất và giảm đa dạng sinh học trong đất. Nghiên cứu về đất phèn ở Việt Nam và trên thế giới đều cho rằng đất phèn có hàm lượng chất hữu cơ cao và hàm lượng đạm tổng số cao, vi sinh vật (VSV) đất có vai trò rất quan trọng trong sự chuyển hóa các dưỡng chất này thành hữu dụng cho cây trồng. Phát triển các mô hình canh tác thích hợp kết hợp ứng dụng công nghệ sinh học trong sử dụng VSV bản địa có lợi sẽ khai thác được tiềm năng sử dụng đất phèn và do đó góp phần ổn định sản xuất và đời sống kinh tế cho người nông dân trên vùng đất phèn Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Các bất lợi môi trường về độc chất gia tăng bất thường của phèn và mặn do biến đổi khí hậu có thể tiêu diệt và VSV có lợi đang hiện hữu trong đất phèn ĐBSCL.
Việc phân lập, nhận diện và lưu giữ sẽ giúp bảo tồn nguồn tài nguyên sinh vật, đồng thời các nghiên cứu ứng dụng sẽ giúp nâng cao độ phì nhiêu đất và sản xuất cây trồng một cách có hiệu quả hơn. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant associated bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện.2 Mục tiêu Phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất và nội sinh trong cây lúa, khoai lang trên đất phèn. Xác định và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân có ảnh hưởng đến sinh trưởng, năng suất của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Đề xuất 2-3 chủng vi khuẩn triển vọng phục vụ cho ổn định năng suất của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Thu thập mẫu đất, mẫu cây của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn ở các vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long.
- Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả năng cố định đạm, hòa tan lân. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và một số đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn được phân lập. Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của các chủng vi khuẩn được phân lập. - Nội dung 3: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Nhận diện một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Nội dung 4: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành đánh giá hiệu quả vi khuẩn. Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn ở pH = 4. Xác định khả năng hòa tan lân (Fe-PO4, Al-PO4) của vi khuẩn ở pH = 4.
- Nội dung 5: Xác định hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi khuẩn lên năng suất lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới. Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng. - Nội dung 6: Xác định hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi khuẩn lên năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới. 3 Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa, khoai lang. * Phạm vi nghiên cứu: 4 vùng đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long.5 Những đóng góp mới của luận án Phân lập được 431 dòng vi khuẩn liên kết với cây lúa, trong đó có 272 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 159 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm.
Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Phân lập được 424 chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai, trong đó có 271 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 153 dòng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, một số lượng nhỏ các chủng vi khuẩn có tế bào dạng hình cầu, Gram dương.
Các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và có khả năng hòa tan lân khó tan. Hai mươi chín chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa mà có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn: Bacilli, Gammaproteobacteria và Betaproteobacteria. Mười hai chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA.
Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 2 nhóm vi khuẩn: Bacilli và Gammaproteobacteria. Không bón đạm đã làm giảm năng suất lúa trên đất phèn, Long Mỹ - Hậu Giang, Hòn Đất - Kiên Giang và Hồng Dân, Bạc Liêu, nhưng bón 60 kg N ha-1 kết hợp với vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis X1 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Hòn Đất-Kiên Giang. Tương tự, vi khuẩn B. vietnamiensis X3 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Long Mỹ - Hậu Giang, và Hồng Dân, 4 Bạc Liêu.
Tuy nhiên, không bón lân chưa thể hiện sự thiếu lân trên ba vùng phèn trên nên chưa đưa đến sự khác biệt về năng suất của sử dụng vi khuẩn B.