Đồ Án Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Sản Xuất Chế Phẩm Chăn Nuôi Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

Khám phá đồ án tốt nghiệp ngành công nghệ sinh học về sản xuất chế phẩm chăn nuôi từ vi khuẩn bacillus subtilis, ứng dụng và tiềm năng.

• Đề tài: Nghiên Cứu Sản Xuất Chế Phẩm Chăn Nuôi Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• PHẦN MỞ ĐẦU
• Lý do chọn đề tài
• Mục tiêu đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis
• 1.1.1. Lịch sử phát hiện
• 1.1.2. Đặc điểm phân loại
• 1.1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.1.4. Đặc điểm sinh hóa
• 1.1.5. Tính đối kháng của B.subtilis đối với một số vi sinh vật gây bệnh
• 1.1.6. Khả năng sinh enzyme
• 1.2. Giới thiệu chung về probiotic
• 1.3. Vai trò của probiotic
• 1.4. Sơ lược về một số vi sinh vật gây bệnh trong chăn nuôi
• 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn B.subtilis
• 1.6. Quy trình tạo chế phẩm và các vấn đề liên quan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
• 2.2. Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy
• 2.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
• 2.3.1. Dụng cụ, thiết bị
• 2.4. Phương pháp
• 2.4.1. Quy trình sản xuất
• 2.4.2. Kiểm tra các đặc tính probiotic của B.subtilis
• 2.4.3. Kiểm tra hoạt lực enzyme
• 2.4.4. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men
• 2.4.5. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang
• 2.4.6. Kiểm tra đặc tính sản phẩm
• 2.4.7. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. Kiểm tra các đặc tính probiotic của B.subtilis
• 3.1.1. Thử nghiệm khả năng đối kháng với E.coli và Salmonella
• 3.1.2. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp của dạ dày
• 3.1.3. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật
• 3.2. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men
• 3.2.1. Kiểm tra số lượng tế bào B.subtilis sau sấy
• 3.2.2. Kiểm tra các chỉ tiêu của chế phẩm tạo ra
• 3.3. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang
• 3.3.1. Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của sản phẩm
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC I: SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
• PHỤ LỤC II: HÌNH ĐẾM KHUẨN LẠC

Tóm tắt

I. Khám Phá Bacillus Subtilis Lợi Khuẩn Cho Vật Nuôi

Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm chăn nuôi từ vi khuẩn Bacillus subtilis mở ra một hướng đi mới cho ngành chăn nuôi hiện đại, hướng tới sự phát triển bền vững và an toàn. Bacillus subtilis là một trực khuẩn Gram dương, có khả năng hình thành bào tử Bacillus subtilis siêu bền, giúp chúng sống sót qua các điều kiện khắc nghiệt của môi trường và hệ tiêu hóa vật nuôi. Lịch sử ghi nhận, B.subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1941 và nhanh chóng được ứng dụng trong y học để điều trị các bệnh rối loạn đường tiêu hóa. Ngày nay, vai trò của nó trong vai trò là một probiotic chăn nuôi ngày càng được khẳng định. Probiotic, theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), là những vi sinh vật sống khi được bổ sung với số lượng đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ. Trong bối cảnh ngành chăn nuôi đang đối mặt với nhiều thách thức về dịch bệnh và an toàn thực phẩm, việc sử dụng các lợi khuẩn cho vật nuôi như B. subtilis trở thành giải pháp ưu việt. Chế phẩm từ vi khuẩn này không chỉ giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường tiêu hóa cho gia súc. Khả năng sinh tổng hợp các enzyme tiêu hóa từ vi khuẩn như amylase, protease, và cellulase giúp vật nuôi hấp thu tối đa dinh dưỡng từ thức ăn. Điều này không chỉ nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn góp phần vào chăn nuôi bền vững, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường. Việc phát triển công nghệ sản xuất men vi sinh từ B. subtilis với chi phí thấp và hiệu quả cao là mục tiêu quan trọng của nhiều nghiên cứu khoa học, trong đó có đề tài “Thử nghiệm sản xuất chế phẩm chăn nuôi từ vi khuẩn Bacillus subtilis” của nhóm tác giả tại Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM.

1.1. Giới thiệu về men vi sinh Bacillus subtilis

Men vi sinh Bacillus subtilis là một trong những probiotic được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhất. Đây là trực khuẩn, Gram dương, có khả năng di động và đặc biệt là khả năng tạo nội bào tử. Chính đặc điểm này giúp B. subtilis tồn tại ở dạng tiềm sinh trong thời gian dài, chịu được nhiệt độ cao, sự thay đổi pH và các điều kiện bất lợi khác. Khi vào đường ruột của vật nuôi, các bào tử này sẽ nảy mầm thành dạng tế bào sinh dưỡng, phát triển và phát huy tác dụng. Chúng cạnh tranh vị trí bám và dinh dưỡng với các vi sinh vật gây hại, đồng thời sản sinh ra nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột.

1.2. Vai trò của probiotic trong chăn nuôi bền vững

Trong ngành chăn nuôi hiện đại, probiotic chăn nuôi đóng vai trò là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Việc bổ sung lợi khuẩn vào khẩu phần ăn giúp vật nuôi phòng ngừa các bệnh đường tiêu hóa, giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong. Hơn nữa, các chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh giúp giảm thiểu nguy cơ tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thịt, trứng, sữa, đảm bảo an toàn sinh học trong chăn nuôi. Các ứng dụng Bacillus subtilis không chỉ dừng lại ở việc cải thiện sức khỏe đường ruột mà còn giúp giảm mùi hôi chuồng trại thông qua việc phân giải các chất hữu cơ trong phân, góp phần tạo ra một môi trường chăn nuôi trong sạch và bền vững.

II. Thách Thức Từ Kháng Sinh Vi Khuẩn Gây Bệnh

Ngành chăn nuôi trong nhiều thập kỷ đã phụ thuộc vào kháng sinh để phòng và trị bệnh, cũng như kích thích tăng trưởng. Tuy nhiên, việc lạm dụng đã dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng. Vấn đề lớn nhất là sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, làm giảm hiệu quả điều trị và gây khó khăn trong công tác kiểm soát dịch bệnh. Bên cạnh đó, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi là mối đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người, gây ra các phản ứng dị ứng, rối loạn hệ vi sinh vật và góp phần vào cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh toàn cầu. Trước thực trạng này, việc tìm kiếm các chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh là một yêu cầu cấp bách. Song song với thách thức từ kháng sinh, vật nuôi còn phải đối mặt với sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh phổ biến như E.coli và Salmonella. Đây là hai tác nhân chính gây ra các bệnh đường ruột nguy hiểm như tiêu chảy, viêm ruột, nhiễm trùng huyết, đặc biệt ở gia súc, gia cầm non. Các bệnh này không chỉ gây thiệt hại kinh tế nặng nề do làm giảm năng suất, tăng chi phí điều trị mà còn có thể lây sang người. Do đó, một giải pháp hiệu quả phải có khả năng ức chế vi khuẩn có hại một cách tự nhiên và an toàn. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm từ chủng Bacillus subtilis cung cấp một câu trả lời tiềm năng cho cả hai thách thức trên, hướng tới một nền chăn nuôi bền vững và an toàn hơn.

2.1. Hậu quả của việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Việc sử dụng kháng sinh kéo dài trong chăn nuôi đã gây ra nhiều hệ lụy. Nổi bật là tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, khiến các phác đồ điều trị trở nên vô hiệu. Nghiên cứu chỉ ra rằng, tồn dư kháng sinh trong thịt không chỉ làm giảm chất lượng sản phẩm mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến người tiêu dùng. Hơn nữa, việc lạm dụng hóa chất này còn gây rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi, làm suy giảm hệ miễn dịch và khiến chúng dễ mắc các bệnh thứ phát. Đây là lý do chính thúc đẩy các nhà khoa học phát triển các phụ gia thức ăn sinh học an toàn hơn.

2.2. Phân tích các vi sinh vật gây bệnh E.coli và Salmonella

E.coli và Salmonella là hai trong số các vi khuẩn gây bệnh đường ruột nguy hiểm nhất trong chăn nuôi. E.coli thường gây tiêu chảy nặng ở heo con và gia cầm non, trong khi Salmonella có thể gây ra thể nhiễm trùng huyết hoặc viêm ruột, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao. Sự xâm nhập của chúng vào đường ruột gây tổn thương niêm mạc, rối loạn hấp thu và sản sinh độc tố. Việc kiểm soát các mầm bệnh này đòi hỏi các biện pháp can thiệp hiệu quả, và khả năng đối kháng của men vi sinh Bacillus subtilis đã được chứng minh là một trong những chiến lược tiềm năng nhất để ức chế vi khuẩn có hại.

III. Phương Pháp Đánh Giá Đặc Tính Probiotic Của B

Để một chủng vi sinh vật được công nhận là probiotic hiệu quả, nó phải trải qua các bài kiểm tra nghiêm ngặt về đặc tính sinh học. Nghiên cứu của nhóm tác giả Lê Công Trà My và cộng sự (2017) đã tiến hành đánh giá toàn diện các đặc tính của chủng Bacillus subtilis được lựa chọn. Một trong những tiêu chí quan trọng nhất là khả năng đối kháng với mầm bệnh. Kết quả cho thấy B. subtilis có hoạt tính ức chế vi khuẩn có hại rất mạnh. Cụ thể, đường kính vòng kháng khuẩn đối với E.coli đạt 27 ± 1.58 mm và đối với Salmonella là 33.33 ± 1.53 mm ở nồng độ cao nhất. Điều này chứng tỏ B. subtilis có thể cạnh tranh và tiêu diệt các mầm bệnh phổ biến trong đường ruột. Bên cạnh đó, khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt của hệ tiêu hóa là yếu tố quyết định. Thử nghiệm cho thấy bào tử Bacillus subtilis có khả năng chịu đựng pH thấp của dạ dày. Sau 4 giờ ở pH 2, tỷ lệ sống sót vẫn đạt 53.07%. Tương tự, vi khuẩn này cũng tỏ ra bền bỉ với muối mật, với tỷ lệ sống sót là 52.12% sau 4 giờ ở nồng độ muối mật 2%. Cuối cùng, khả năng sản xuất enzyme ngoại bào là một lợi thế lớn, giúp tăng cường tiêu hóa cho gia súc. Nghiên cứu đã xác định B. subtilis có thể sinh ra cả ba loại enzyme tiêu hóa từ vi khuẩn quan trọng: amylase (vòng phân giải 4.33 mm), protease (vòng phân giải 11.67 mm) và cellulase (vòng phân giải 4.58 mm), giúp vật nuôi phân giải tinh bột, protein và chất xơ hiệu quả.

3.1. Khả năng ức chế vi khuẩn có hại E.coli và Salmonella

Thử nghiệm trong nghiên cứu cho thấy B. subtilis tạo ra các vùng ức chế rõ rệt trên môi trường nuôi cấy có E.coli và Salmonella. Khả năng này đến từ việc vi khuẩn tiết ra các chất kháng khuẩn tự nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, làm giảm số lượng mầm bệnh một cách hiệu quả. Khả năng kháng Salmonella (vòng kháng 33.33 mm) tốt hơn so với E.coli (27 mm), cho thấy tiềm năng lớn trong việc phòng trị bệnh thương hàn ở vật nuôi.

3.2. Sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong pH thấp

Dạ dày vật nuôi có môi trường axit mạnh (pH 2-3), là rào cản lớn đối với hầu hết vi sinh vật. Tuy nhiên, nhờ cấu trúc bào tử bền vững, B. subtilis có thể vượt qua rào cản này. Kết quả nghiên cứu chứng minh rằng, ngay cả ở pH 2, tỷ lệ sống sót sau 4 giờ vẫn trên 50%. Khả năng này đảm bảo một lượng lớn lợi khuẩn cho vật nuôi có thể đến được ruột non và phát huy tác dụng, giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột.

3.3. Khả năng sinh enzyme tiêu hóa từ vi khuẩn B. subtilis

Một trong những lợi ích chính của ứng dụng Bacillus subtilis là khả năng sản xuất enzyme. Bằng cách tiết ra amylase, protease và cellulase, nó giúp vật nuôi tiêu hóa các thành phần thức ăn khó tiêu. Protease giúp phân giải protein, amylase thủy phân tinh bột, và cellulase phá vỡ chất xơ. Điều này không chỉ giúp vật nuôi hấp thu tốt hơn mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn bổ sung chăn nuôi, góp phần nâng cao hiệu suất tăng trọng.

IV. Quy Trình Sản Xuất Men Vi Sinh Bacillus Subtilis Tối Ưu

Để tạo ra một chế phẩm sinh học chất lượng cao, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất là yếu tố then chốt. Nghiên cứu đã xây dựng một quy trình lên men vi khuẩn hiệu quả để thu được sinh khối B. subtilis với mật độ cao. Quá trình bắt đầu từ việc hoạt hóa giống gốc, nhân giống qua hai cấp trong môi trường dinh dưỡng phù hợp. Môi trường lên men chính được lựa chọn từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như bột bắp, cám gạo và khô dầu lạc. Yếu tố thời gian lên men được khảo sát kỹ lưỡng để xác định thời điểm thu hoạch sinh khối tối ưu. Kết quả chỉ ra rằng, sau 48 giờ lên men, mật độ vi khuẩn CFU/g đạt mức cao nhất, với 234 x 10^15 CFU/g. Đây là thời điểm cuối pha log, khi tế bào vi khuẩn có hoạt tính sinh học mạnh nhất và sức sống tốt nhất. Sau khi thu hoạch, sinh khối được sấy khô ở nhiệt độ 45°C trong 2 ngày để bảo quản. Quá trình sấy làm giảm mật độ vi khuẩn CFU/g xuống còn 228 x 10^11 CFU/g, tuy nhiên đây vẫn là một mật độ rất cao, đáp ứng yêu cầu của một probiotic chăn nuôi hiệu quả. Bước cuối cùng trong công nghệ sản xuất men vi sinh là phối trộn sinh khối khô với chất mang (bã mía và cám gạo) để tạo ra sản phẩm hoàn chỉnh, sẵn sàng sử dụng như một phụ gia thức ăn sinh học. Việc sử dụng các nguyên liệu địa phương không chỉ giảm giá thành mà còn góp phần vào sự phát triển của ngành chăn nuôi bền vững.

4.1. Tối ưu hóa thời gian trong quy trình lên men vi khuẩn

Thời gian lên men ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng và chất lượng tế bào. Nghiên cứu đã theo dõi sự phát triển của B. subtilis qua các mốc thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Kết quả cho thấy mật độ tế bào tăng nhanh và đạt đỉnh ở 48 giờ. Sau thời điểm này, số lượng tế bào bắt đầu giảm dần. Do đó, việc thu hoạch sinh khối tại mốc 48 giờ được xác định là tối ưu để đảm bảo sản phẩm cuối cùng có mật độ vi khuẩn CFU/g cao nhất.

4.2. Kỹ thuật sấy và phối trộn để bảo toàn mật độ vi khuẩn

Sau lên men, sinh khối được sấy ở nhiệt độ thấp (45°C) để hạn chế tác động nhiệt lên tế bào vi khuẩn sống. Mặc dù có sự suy giảm nhất định, mật độ vi khuẩn CFU/g sau sấy vẫn đạt mức cao. Bước tiếp theo là phối trộn với chất mang. Thí nghiệm đã khảo sát nhiều tỷ lệ khác nhau và xác định tỷ lệ tối ưu là 10 phần sinh khối : 85 phần bã mía : 5 phần cám gạo. Tỷ lệ này không chỉ giúp duy trì mật độ vi khuẩn ổn định trong thời gian dài mà còn tối ưu hóa chi phí sản xuất.

V. Ứng Dụng Bacillus Subtilis Tạo Phụ Gia Thức Ăn Sinh Học

Kết quả nghiên cứu không chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm mà còn mở ra ứng dụng Bacillus subtilis thực tiễn trong việc sản xuất phụ gia thức ăn sinh học. Chế phẩm cuối cùng, sau khi được phối trộn theo tỷ lệ tối ưu (10:85:5), đã được kiểm tra lại về chất lượng và hiệu quả. Một trong những chỉ tiêu quan trọng nhất là mật độ vi khuẩn CFU/g sống trong sản phẩm. Việc phối trộn với chất mang như bã mía và cám gạo không chỉ giúp bảo quản mà còn cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn duy trì sự sống. Kết quả kiểm tra cho thấy, tỷ lệ phối trộn 10:85:5 duy trì được số lượng tế bào sống cao nhất sau 15 ngày bảo quản, chứng tỏ đây là công thức tối ưu. Bên cạnh đó, hiệu quả kháng khuẩn của sản phẩm thành phẩm cũng được đánh giá. Kết quả xác nhận rằng ngay cả sau khi đã pha chế thành thức ăn bổ sung chăn nuôi, chế phẩm vẫn giữ được khả năng ức chế vi khuẩn có hại E.coli và Salmonella một cách mạnh mẽ. Điều này cho thấy các hoạt chất sinh học do B. subtilis tạo ra vẫn được bảo toàn trong suốt quá trình sản xuất và phối trộn. Việc bổ sung chế phẩm này vào khẩu phần ăn hàng ngày sẽ giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi, tạo ra một hàng rào bảo vệ tự nhiên chống lại các mầm bệnh, từ đó góp phần nâng cao sức khỏe và năng suất, hướng tới một nền an toàn sinh học trong chăn nuôi.

5.1. Kết quả kiểm tra mật độ vi khuẩn CFU g trong chế phẩm

Thử nghiệm trên 5 tỷ lệ phối trộn khác nhau cho thấy tỷ lệ 10:85:5 (sinh khối : bã mía : cám gạo) cho kết quả tốt nhất. Ở tỷ lệ này, số lượng vi khuẩn sống được duy trì ổn định và cao nhất sau 15 ngày. Việc giảm lượng cám gạo (nguồn Nitơ) xuống 5% dường như tạo điều kiện tối ưu cho sự tồn tại của bào tử Bacillus subtilis trong môi trường bảo quản khô, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về nhu cầu dinh dưỡng của chủng vi khuẩn này.

5.2. Hiệu quả kháng khuẩn của chế phẩm chăn nuôi thành phẩm

Sản phẩm cuối cùng ở tỷ lệ 10:85:5 và 10:75:15 đều cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh. Cụ thể, chúng có thể ức chế Salmonella ngay cả khi pha loãng đến nồng độ 10^-3. Điều này chứng minh rằng chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh này có hoạt tính cao và ổn định, sẵn sàng để ứng dụng trong thực tiễn chăn nuôi để kiểm soát các bệnh do E.coli và Salmonella gây ra, đảm bảo sức khỏe cho đàn vật nuôi.

VI. Tương Lai Của Chế Phẩm Sinh Học Thay Thế Kháng Sinh

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm chăn nuôi từ vi khuẩn Bacillus subtilis đã chứng minh được tính khả thi và hiệu quả, mở ra một tương lai đầy hứa hẹn cho ngành chăn nuôi Việt Nam. Việc phát triển thành công các chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh không chỉ là một giải pháp khoa học mà còn là một bước đi chiến lược hướng tới chăn nuôi bền vững. Những sản phẩm như men vi sinh Bacillus subtilis giúp giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh, qua đó hạn chế tình trạng kháng thuốc và đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng. Tiềm năng của probiotic chăn nuôi là rất lớn, không chỉ giúp vật nuôi khỏe mạnh, tăng trưởng tốt mà còn cải thiện môi trường chăn nuôi. Khi được ứng dụng rộng rãi, các chế phẩm này sẽ góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch, có trách nhiệm và cạnh tranh hơn trên thị trường quốc tế. Hướng đi này hoàn toàn phù hợp với xu thế toàn cầu về an toàn sinh học trong chăn nuôi. Trong tương lai, các nghiên cứu cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp, đa dạng hóa các chủng Bacillus subtilis để phù hợp với từng loại vật nuôi cụ thể, và tiến hành các thử nghiệm thực địa quy mô lớn để khẳng định hiệu quả kinh tế. Sự kết hợp giữa khoa học, công nghệ và chính sách hỗ trợ từ nhà nước sẽ là động lực quan trọng để đưa các phụ gia thức ăn sinh học trở thành một phần không thể thiếu trong ngành chăn nuôi hiện đại.

6.1. Tiềm năng phát triển của probiotic chăn nuôi tại Việt Nam

Với nguồn nguyên liệu nông nghiệp dồi dào như cám gạo, bã mía, Việt Nam có lợi thế lớn để phát triển công nghệ sản xuất men vi sinh với chi phí thấp. Nhu cầu về thực phẩm sạch và an toàn ngày càng tăng cao, tạo ra thị trường rộng lớn cho các sản phẩm probiotic chăn nuôi. Việc làm chủ công nghệ sản xuất sẽ giúp giảm nhập khẩu, tăng tính chủ động và tạo ra các sản phẩm chất lượng cao, mang thương hiệu Việt.

6.2. Hướng tới an toàn sinh học trong chăn nuôi hiện đại

An toàn sinh học trong chăn nuôi là mục tiêu cuối cùng. Việc sử dụng các chế phẩm từ B. subtilis là một phần quan trọng của chiến lược này. Nó giúp xây dựng một hệ sinh thái đường ruột khỏe mạnh cho vật nuôi, tăng cường sức đề kháng tự nhiên và giảm thiểu việc sử dụng hóa chất. Đây là con đường tất yếu để ngành chăn nuôi Việt Nam phát triển bền vững, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong thực tiễn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây, thuốc kháng sinh và các chất hóa học thường được sử dụng phổ biến nhằm phòng ngừa và điều trị dịch bệnh cho vật nuôi (gia súc, gia cầm, tôm, cá). Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh trong thời gian dài đã gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng như sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng thuốc, tình trạng rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột khiến bệnh tái phát nặng và khó điều trị hơn. Đặc biệt, sự tồn dư kháng sinh trong thực phẩm làm suy giảm phẩm chất thịt và giá trị thương phẩm, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng và thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

Để giải quyết vấn đề trên, việc sử dụng các chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật sống có lợi (probiotic) đang được định hướng thay thế kháng sinh. Các vi sinh vật này hỗ trợ cân bằng hệ vi sinh đường tiêu hóa, phòng trị bệnh và kích thích tăng trọng mà không để lại tồn dư hóa chất độc hại. Xuất phát từ bối cảnh đó, đề tài đồ án tốt nghiệp "Thử nghiệm sản xuất chế phẩm chăn nuôi từ vi khuẩn Bacillus subtilis" (hay "Thử nghiệm sản xuất thức ăn chăn nuôi từ Bacillus subtilis") đã được nhóm sinh viên Lê Công Trà My, Lê Châu Thủy Tiên và Phạm Hoàng Tiến thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS. Đỗ Thị Hiền tại Khoa Công nghệ Sinh học & Kỹ thuật Môi trường, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM (hoàn thành vào tháng 7 năm 2017).

Nhiệm vụ và mục tiêu nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm:

1. Sản xuất chế phẩm chăn nuôi thô với mật độ vi sinh vật sống cao, hoạt lực enzyme cao từ các nguồn cơ chất môi trường sản xuất rẻ tiền.
2. Khảo sát và đánh giá các đặc tính probiotic tiêu biểu của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis:
   • Khả năng sống sót trong điều kiện pH thấp mô phỏng dịch vị dạ dày (pH 2; 2,5; 3).
   • Khả năng chịu đựng muối mật ở các nồng độ khác nhau (0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%).
   • Khả năng đối kháng, ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột thường gặp gồm Escherichia coli và Salmonella.
   • Khả năng sinh các enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa thức ăn (amylase, protease, cellulase).
3. Khảo sát thời gian lên men tối ưu để thu nhận sinh khối cực đại và khảo sát tỷ lệ phối trộn giữa sinh khối lên men với các chất mang (bã mía, cám gạo) để tạo ra sản phẩm chế phẩm chăn nuôi đạt chất lượng ổn định.

Đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis (được hoạt hóa từ men vi sinh Entero Lactyl), các chủng vi sinh vật kiểm định đối kháng gồm Escherichia coli và Salmonella. Phạm vi thực nghiệm được triển khai tại Trung tâm Thí nghiệm thực hành (Cơ sở Tân Kỳ Tân Quý) – Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM trong khoảng thời gian từ ngày 24/4/2017 đến ngày 16/6/2017.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm áp dụng

• Phân loại học và đặc tính vi sinh vật: Theo hệ thống phân loại Bergey (1994), Bacillus subtilis thuộc bộ Eubacteriales, họ Bacillaceae, giống Bacillus, loài Bacillus subtilis. Đây là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,5–0,8 µm × 1,5–3 µm, có khả năng di động nhờ chiên mao, tạo nội bào tử hình bầu dục chịu nhiệt, chịu ẩm và hóa chất tốt. Đặc điểm sinh hóa đặc trưng gồm: catalase dương tính (+), indol âm tính (-), Methyl Red (+), Voges-Proskauer (+), sử dụng citrate (+), khử nitrate (+), làm tan chảy gelatin (+), phân giải tinh bột (+), lên men đường glucose, saccharose, maltose, arabinose, xylose, mannitol (+), nhưng không lên men lactose (-).
• Khái niệm và cơ chế Probiotic: Định nghĩa theo Fuller (1989) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2001), probiotic là các vi sinh vật sống khi bổ sung vào cơ thể vật chủ với số lượng đầy đủ sẽ đem lại lợi ích sức khỏe bằng cách cải thiện hệ vi sinh đường ruột. Cơ chế tác động bao gồm: tiết các acid hữu cơ (acid lactic, acid béo bay hơi) và chất kháng khuẩn để hạ pH lòng ruột; cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc và cạnh tranh dinh dưỡng với mầm bệnh (E. coli, Salmonella); củng cố biểu mô ruột; kích thích miễn dịch đường tiêu hóa.
• Hệ enzyme ngoại bào: B. subtilis có khả năng tiết các enzyme tiêu hóa ngoại bào quan trọng: $\alpha$-amylase thủy phân liên kết $\alpha$-1,4 glucoside trong tinh bột; cellulase thủy phân liên kết $\beta$-1,4 glucoside trong cellulose; protease (proteinase và peptidase) thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein thành các đoạn peptid ngắn và acid amin tự do.

Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

• Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
  • Môi trường giữ giống, đếm khuẩn lạc và thử kháng khuẩn: Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar - NA).
  • Môi trường khảo sát pH và muối mật: Môi trường lỏng MRS.
  • Môi trường nhân giống cấp 1 (môi trường lỏng): Rỉ đường 3%, Peptone 15 g/L, muối khoáng 10 g/L.
  • Môi trường lên men cấp 2 (lên men bán rắn): Bột bắp xay mịn 70 g, cám gạo 30 g, khô dầu lạc 50 g, phân bón DAP 0,75 g, nước 80%.
  • Môi trường phát hiện enzyme ngoại bào: Môi trường thạch cơ chất bổ sung tương ứng tinh bột 10 g/L (amylase), sữa gầy 5 g/L (protease), hoặc carboxymethyl cellulose - CMC 10 g/L (cellulase), cùng NaCl 30 g/L và Agar 20 g/L.
• Phương pháp kiểm tra đặc tính Probiotic:
  • Khả năng kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa giấy (đường kính đĩa giấy 9 mm) tẩm dịch nuôi cấy B. subtilis ở các độ pha loãng ($10^0, 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5}$) đặt lên đĩa thạch NA đã trải đều huyền phù vi khuẩn chỉ thị (E. coli hoặc Salmonella), ủ 37°C trong 24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn vô cảm.
  • Khả năng chịu pH thấp: Nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể điều chỉnh pH về các mức 2; 2,5; 3 (bằng HCl 1M). Lấy mẫu tại các mốc 0h, 2h, 4h để cấy gạt lên đĩa NA, ủ 24 giờ và đếm số lượng khuẩn lạc sống sót.
  • Khả năng chịu muối mật: Nuôi cấy trong MRS dịch thể chứa nồng độ muối mật 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%. Lấy mẫu tại các thời điểm 0h, 2h, 4h, cấy trải trên thạch NA để xác định tỷ lệ sống sót.
  • Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Cấy đĩa giấy tẩm dịch vi khuẩn lên môi trường cơ chất tương ứng, ủ 37°C trong 24 giờ. Xác định vòng phân giải bằng dung dịch $\text{I}_2$ 0,1N (cho amylase), thuốc thử Lugol 0,1N (cho cellulase), và dung dịch $\text{HgCl}_2$ (cho protease).
• Quy trình sản xuất và khảo sát công nghệ:
  • Khảo sát thời gian lên men: Lên men bán rắn ở nhiệt độ phòng trên khay môi trường cấp 2 với tỷ lệ cấy giống 10% trong các mốc thời gian 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Lấy mẫu pha loãng đến nồng độ $10^{-14}$ để đếm khuẩn lạc (CFU/g).
  • Sấy khô và kiểm tra sinh khối sau sấy: Sấy ở nhiệt độ 45°C trong 2 ngày, nghiền mịn và xác định mật độ vi sinh vật sống còn lại.
  • Khảo sát tỷ lệ phối trộn chất mang: Phối trộn sinh khối lên men khô với bã mía và cám gạo đã tiệt trùng/sấy khô theo 5 tỷ lệ (chế phẩm : bã mía : cám gạo) gồm 10:45:45, 10:55:35, 10:65:25, 10:75:15, 10:85:5. Theo dõi mật độ vi khuẩn sống sau 5, 10, 15 ngày và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm hoàn thiện.
• Phương pháp xử lý số liệu: Phân tích phương sai và xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics; biểu diễn đồ thị bằng Microsoft Excel 2007.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn bộ cơ sở lý luận về loài vi khuẩn Bacillus subtilis, bao gồm lịch sử phát hiện từ năm 1941 bởi Tổ chức Y học Nazi của Đức trong phân ngựa nhằm điều trị bệnh lỵ cho binh lính ở Bắc Phi, cho đến các công trình phân lập thuần khiết của Henry và Albot giai đoạn 1949–1957 mở ra liệu pháp "subtilis therapy". Tác giả trình bày chi tiết về hình thái, sinh hóa, khả năng đối kháng nấm bệnh và vi khuẩn nhờ tốc độ phát triển nhanh và sinh chất kháng sinh tự nhiên, cùng đặc tính tiết enzyme tiêu hóa $\alpha$-amylase, cellulase, protease.

Chương này cũng tổng hợp khái niệm, vai trò của probiotic trong việc bảo vệ hàng rào niêm mạc ruột, tác động miễn dịch và điều hòa hệ vi sinh đường ruột; phân tích cơ chế gây tiêu chảy, mất nước ion của độc tố ruột từ vi khuẩn E. coli (LT, STa, STb) và bệnh viêm ruột, nhiễm trùng huyết do Salmonella (S. choleraesuis, S. typhimurium) trên heo và gia cầm. Đồng thời, tác giả điểm lại các nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis trong và ngoài nước (chế phẩm Biosubtyl của Nguyễn Văn Đông năm 1993; nghiên cứu trên gà của Đậu Ngọc Hào năm 2001; chế phẩm Vitom3 của Tạ Thị Vịnh năm 2002; chế phẩm BIO-C của Đinh Văn Cải năm 2004; chế phẩm Bioplus 2B tại Đức và dòng Bacillus S11 tại Thái Lan), từ đó vạch ra quy trình kiểm soát chất lượng từ khâu ống giống, nhân giống hai cấp, lên men thu sinh khối đến phối trộn chất mang.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa điểm, mốc thời gian thực hiện đề tài tại Trung tâm Thí nghiệm thực hành của Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, các chủng vi sinh vật sử dụng và công thức thành phần hóa chất cho từng môi trường thí nghiệm (môi trường giữ giống, môi trường cấp 1 rỉ đường - peptone, môi trường lên men cấp 2 tận dụng nguồn phụ phẩm bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc, phân bón DAP, cùng các môi trường cơ chất định tính enzyme).

Toàn bộ quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi vi sinh được sơ đồ hóa rõ ràng từ khâu hoạt hóa giống, hấp khử trùng 121°C/15 phút, nhân giống cấp 1, đổ khay lên men ở nhiệt độ phòng, đánh tơi, sấy khô tại 45°C trong 2 ngày, nghiền mịn và phối trộn chất mang. Các bước thực nghiệm kiểm tra hoạt tính probiotic (kháng khuẩn bằng khuếch tán đĩa giấy, chịu pH 2–3, chịu muối mật 0,5%–2%, định tính phân giải tinh bột/CMC/protein) và các bước bố trí thí nghiệm theo dõi động thái mật độ tế bào ở các mốc thời gian lên men và các công thức phối trộn bảo quản đều được quy chuẩn hóa phương pháp đo đạc và thống kê.

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm kèm bảng biểu, hình ảnh đĩa thạch và biểu đồ so sánh:

• Khả năng đối kháng vi khuẩn kiểm định: Chủng B. subtilis ức chế rõ rệt cả E. coli và Salmonella. Khả năng kháng Salmonella biểu hiện mạnh hơn E. coli ở các nồng độ dịch khuẩn từ $10^0$ đến $10^{-3}$. Kết quả này tương đồng với các công bố trước đó của Trần Thị Bích Quyên (2012), Trần Quốc Việt (2009) và Đặng Ngọc Phương Uyên (2007).
• Khả năng chịu pH dạ dày: Khảo sát trong thời gian 4 giờ (thời gian lưu thức ăn ở dạ dày gia súc) cho thấy tỷ lệ sống sót giảm dần theo độ hạ pH. Sau 4 giờ, tỷ lệ sống sót của vi khuẩn đạt 81,50% ở pH 3; 65,83% ở pH 2,5 và 53,56% ở pH 2.
• Khả năng chịu muối mật: Ở các nồng độ muối mật từ 0,5% đến 2,0% sau 4 giờ, tỷ lệ sống sót của B. subtilis đạt từ 79,48% (tại nồng độ 0,5%) xuống 52,24% (tại nồng độ 2,0%). Dù thấp hơn một số dòng phân lập thủy sản của Văn Thị Thủy (2011) hay Trần Thị Bích Quyên (2012), chủng vi khuẩn vẫn duy trì tỷ lệ sống trên 50% ở nồng độ mật tối đa tại ruột non.
• Hoạt lực enzyme ngoại bào: Kết quả tạo vòng phân giải trên đĩa thạch ghi nhận đường kính phân giải đạt 4,58 mm đối với cả 3 enzyme amylase, protease và cellulase.
• Động thái sinh trưởng và thời gian lên men tối ưu: Mật độ tế bào B. subtilis tăng mạnh từ sau 24 giờ và đạt giá trị cực đại tại mốc 48 giờ ($234 \pm 5 \times 10^{15}\text{ CFU/g}$), sau đó giảm dần ở mốc 60 giờ và 72 giờ khi bước vào pha suy thoái. Do đó, thời gian lên men 48 giờ là điểm dừng thu sinh khối tối ưu.
• Mật độ tế bào sau sấy: Sau khi sấy ở 45°C trong 2 ngày, mật độ tế bào đạt $228 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$ (giảm đáng kể so với trước khi sấy do thời gian sấy kéo dài làm một phần tế bào suy thoái).
• Tỷ lệ phối trộn chất mang và hoạt tính sản phẩm: Khảo sát 5 tỷ lệ phối trộn (chế phẩm : bã mía : cám gạo) sau 5, 10, 15 ngày cho thấy công thức 10:85:5 duy trì mật độ tế bào sống ổn định và đạt mức phân hạng cao nhất trong phân tích thống kê ($155,56 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$), đồng thời giữ được đường kính vòng kháng khuẩn cao đối với Salmonella ($18 \pm 1,88\text{ mm}$) và E. coli.

Chỉ tiêu khảo sát	Điều kiện / Mốc thời gian	Kết quả đo đạc
Đường kính vòng kháng E. coli	Nồng độ $10^0$	$27 \pm 1\text{ mm}$
Đường kính vòng kháng E. coli	Nồng độ $10^{-3}$	$8\text{ mm}$
Đường kính vòng kháng Salmonella	Nồng độ $10^0$	$33,58\text{ mm}$
Đường kính vòng kháng Salmonella	Nồng độ $10^{-3}$	$7\text{ mm}$
Tỷ lệ sống sót ở pH 3 sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$81,50%$ (giảm 18,50%)
Tỷ lệ sống sót ở pH 2,5 sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$65,83%$ (giảm 34,17%)
Tỷ lệ sống sót ở pH 2 sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$53,56%$ (giảm 46,44%)
Tỷ lệ sống sót ở Muối mật 0,5% sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$79,48%$ (giảm 20,52%)
Tỷ lệ sống sót ở Muối mật 1,0% sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$75,83%$ (giảm 24,17%)
Tỷ lệ sống sót ở Muối mật 1,5% sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$62,21%$ (giảm 37,79%)
Tỷ lệ sống sót ở Muối mật 2,0% sau 4h	Môi trường MRS lỏng	$52,24%$ (giảm 47,76%)
Vòng phân giải Amylase	Cơ chất tinh bột 10 g/L	$4,58\text{ mm}$
Vòng phân giải Protease	Cơ chất sữa gầy 5 g/L	$4,58\text{ mm}$
Vòng phân giải Cellulase	Cơ chất CMC 10 g/L	$4,58\text{ mm}$
Mật độ tế bào cực đại (48h lên men)	Môi trường bán rắn cấp 2	$234 \pm 5 \times 10^{15}\text{ CFU/g}$
Mật độ tế bào sau sấy 45°C (2 ngày)	Sản phẩm sấy khô	$228 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$
Mật độ tế bào TB công thức 10:85:5	Sau 5–15 ngày bảo quản	$155,56 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết các kết luận chính của đề tài: Chủng Bacillus subtilis khảo nghiệm đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn probiotic cốt lõi (chịu được pH dạ dày, chịu được nồng độ muối mật 2%, ức chế mạnh E. coli và Salmonella, sinh 3 loại enzyme tiêu hóa ngoại bào). Đề tài đã xây dựng thành công công thức môi trường lên men bán rắn rẻ tiền từ phụ phẩm nông nghiệp (bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc, DAP) đạt mật độ cực đại $234 \times 10^{15}\text{ CFU/g}$ ở 48 giờ nuôi cấy và xác định tỷ lệ phối trộn chế phẩm : bã mía : cám gạo tối ưu là 10:85:5.

Nhóm tác giả đề xuất các kiến nghị tiếp theo: cần nghiên cứu tối ưu hóa chế độ sấy (rút ngắn thời gian sấy dưới 2 ngày hoặc cải tiến nhiệt độ/thiết bị sấy) để giảm thiểu hao hụt sinh khối tế bào sống; theo dõi thời gian bảo quản sản phẩm ở các mốc dài hơn (1–6 tháng); và tiến hành thử nghiệm bổ sung chế phẩm trực tiếp trên khẩu phần ăn của vật nuôi thực tế để đánh giá các chỉ tiêu tăng trọng và phòng chống tiêu chảy.

---

Kết quả và đóng góp

• Kết quả thực nghiệm chính:
  1. Xác định đặc tính sinh học probiotic của chủng vi khuẩn: Chủng B. subtilis có hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn gây bệnh đường ruột (vòng kháng Salmonella đạt 33,58 mm và E. coli đạt 27 mm ở nồng độ gốc $10^0$); tỷ lệ sống sót sau 4 giờ tiếp xúc với pH 2 đạt 53,56% và tiếp xúc với muối mật nồng độ cao nhất 2,0% đạt 52,24%; thể hiện hoạt tính sinh cả 3 enzyme ngoại bào phân giải tinh bột, protein và chất xơ (đường kính vòng phân giải amylase, protease, cellulase đều đạt 4,58 mm).
  2. Tối ưu hóa thông số lên men: Xác định được thời gian lên men bán rắn trên môi trường cấp 2 tối ưu là 48 giờ ở nhiệt độ phòng, thu nhận mật độ sinh khối sống đạt mức $234 \pm 5 \times 10^{15}\text{ CFU/g}$.
  3. Lựa chọn tỷ lệ phối trộn kinh tế: Xác định tỷ lệ phối trộn chế phẩm sinh khối : bã mía : cám gạo tối ưu là 10:85:5. Công thức này giúp duy trì mật độ vi sinh vật sống trung bình ở mức $155,56 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$ sau 15 ngày, giữ vững hoạt tính kháng khuẩn với Salmonella ($18 \pm 1,88\text{ mm}$), đồng thời tận dụng tỷ lệ bã mía cao (85%) giúp giảm đáng kể chi phí nguyên liệu so với việc dùng nhiều cám gạo.
• Giải pháp và kiến nghị của tác giả: Đề xuất ứng dụng quy trình sản xuất chế phẩm bán rắn quy mô phòng thí nghiệm vào sản xuất thức ăn chăn nuôi bổ sung probiotic; kiến nghị rút ngắn chu kỳ sấy khô nhằm khắc phục sự sụt giảm mật độ vi khuẩn (từ $10^{17}\text{ CFU/g}$ xuống $10^{13}\text{ CFU/g}$ sau 2 ngày sấy ở 45°C).
• Đóng góp học thuật và thực tiễn: Chứng minh tính khả thi của việc tận dụng các phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ (rỉ đường, bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc, bã mía) làm cơ chất lên men và chất mang phối trộn để sản xuất chế phẩm sinh học thô chứa Bacillus subtilis có mật độ tế bào sống cao và hoạt tính probiotic ổn định, đóng góp giải pháp thay thế kháng sinh trong chăn nuôi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Quy trình sấy khô sản phẩm ở 45°C kéo dài 2 ngày khiến mật độ tế bào vi khuẩn sống bị sụt giảm mạnh (từ mức $234 \times 10^{15}\text{ CFU/g}$ xuống $228 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$) do vi khuẩn bị chuyển dịch từ pha log sang pha suy thoái.
  • Số lần lặp lại thí nghiệm ở một số chỉ tiêu chịu muối mật và sinh enzyme còn ít, điều kiện ủ và thao tác cấy truyền chưa được tối ưu hóa dẫn đến hoạt lực phân giải enzyme đo được (4,58 mm) thấp hơn so với một số công bố trước đây.
  • Thời gian khảo sát chất lượng chế phẩm phối trộn sau sản xuất mới dừng lại ở mốc 15 ngày, chưa đánh giá được hạn sử dụng dài hạn (3–6 tháng).
  • Nghiên cứu mới hoàn thành ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên đàn vật nuôi thực tế.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Thử nghiệm các phương pháp làm khô cải tiến hoặc rút ngắn thời gian sấy để bảo toàn tối đa số lượng tế bào vi khuẩn sống.
  • Khảo sát các điều kiện môi trường tối ưu (nhiệt độ, pH, độ ẩm, tỷ lệ cơ chất) nhằm nâng cao hoạt lực sinh enzyme amylase, protease, cellulase của chủng vi khuẩn.
  • Đánh giá độ ổn định và mật độ sống của vi khuẩn trong chế phẩm phối trộn ở thời gian bảo quản dài ngày hơn (từ 1 đến 6 tháng).
  • Bổ sung chế phẩm vào khẩu phần ăn của gia súc, gia cầm hoặc thủy sản để đánh giá hiệu quả thực tế về tốc độ tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn và khả năng phòng ngừa tiêu chảy.

---

Giá trị tham khảo

Đồ án tốt nghiệp là tài liệu tham khảo cho:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Chăn nuôi - Thú y, Công nghệ Thực phẩm: Tham khảo quy trình thực nghiệm nuôi cấy vi sinh vật bán rắn, phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu probiotic tiêu chuẩn (in vitro) như thử thách pH dạ dày, muối mật, hoạt tính kháng khuẩn đối kháng bằng đĩa giấy và phương pháp định tính enzyme ngoại bào.
• Kỹ thuật viên và cán bộ nghiên cứu sản xuất thức ăn chăn nuôi: Tham khảo công thức môi trường lên men tận dụng phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ (bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc, bã mía, rỉ đường, phân bón DAP) và phương pháp phối trộn chất mang để tối ưu giá thành chế phẩm sinh học thô.
• Các phần đáng chú ý: Quy trình công nghệ sơ đồ hóa sản xuất thức ăn chăn nuôi vi sinh (Hình 2.1), phương pháp luận bố trí thử nghiệm chịu pH/muối mật (Mục 2.4.2) và số liệu so sánh thời gian lên men qua các mốc giờ từ 0 đến 72 giờ (Bảng 3.6).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis sử dụng trong đề tài có nguồn gốc từ đâu và môi trường nhân giống cấp 1 gồm những thành phần nào?
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập và hoạt hóa từ men vi sinh dạng nước thương mại Entero Lactyl. Môi trường nhân giống lỏng cấp 1 gồm có: Rỉ đường 3%, Peptone 15 g/L và Muối khoáng 10 g/L.

2. Thành phần môi trường lên men cấp 2 (lên men bán rắn) được nhóm tác giả xây dựng như thế nào?
Môi trường lên men cấp 2 tận dụng các nguồn nguyên liệu phụ phẩm rẻ tiền gồm: Bột bắp xay mịn 70 g, Cám gạo 30 g, Khô dầu lạc 50 g, phân bón DAP 0,75 g và tỷ lệ bổ sung nước là 80%.

3. Khả năng sống sót của Bacillus subtilis sau 4 giờ trong môi trường pH thấp mô phỏng dạ dày và môi trường muối mật ruột non đạt bao nhiêu phần trăm?
Sau 4 giờ khảo sát:

• Ở môi trường pH thấp: Tỷ lệ sống sót đạt 81,50% tại pH 3; 65,83% tại pH 2,5 và 53,56% tại pH 2.
• Ở môi trường muối mật: Tỷ lệ sống sót đạt 79,48% ở nồng độ 0,5%; 75,83% ở nồng độ 1,0%; 62,21% ở nồng độ 1,5% và 52,24% ở nồng độ cao nhất 2,0%.

4. Thời gian lên men bán rắn tối ưu để thu nhận mật độ vi khuẩn cao nhất là bao lâu và số lượng tế bào đạt được là bao nhiêu?
Thời gian lên men tối ưu là 48 giờ ở nhiệt độ phòng (cuối pha log). Tại thời điểm này, mật độ tế bào Bacillus subtilis đạt mức cực đại là $234 \pm 5 \times 10^{15}\text{ CFU/g}$.

5. Tại sao nhóm tác giả lại lựa chọn tỷ lệ phối trộn chế phẩm : bã mía : cám gạo là 10:85:5?
Tỷ lệ phối trộn 10:85:5 được lựa chọn vì công thức này đạt mức phân hạng thống kê cao nhất về mật độ tế bào sống ($155,56 \times 10^{11}\text{ CFU/g}$ sau 15 ngày), duy trì đường kính vòng kháng khuẩn cao với Salmonella ($18 \pm 1,88\text{ mm}$), đồng thời sử dụng lượng bã mía lớn (85%) giúp hạ giá thành sản phẩm đáng kể do giá bã mía trên thị trường rẻ hơn nhiều so với cám gạo.

---

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp "Thử nghiệm sản xuất chế phẩm chăn nuôi từ vi khuẩn Bacillus subtilis" của nhóm sinh viên Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra về việc đánh giá đặc tính probiotic của chủng vi khuẩn và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học thô. Kết quả thực nghiệm chứng minh chủng Bacillus subtilis có khả năng sống sót tốt trong môi trường pH dạ dày và muối mật ruột non (>50%), đối kháng mạnh với hai chủng vi khuẩn gây bệnh E. coli và Salmonella, đồng thời tiết ra ba loại enzyme tiêu hóa amylase, protease và cellulase. Nghiên cứu đã xác định được thời gian lên men bán rắn tối ưu ở 48 giờ và lựa chọn được tỷ lệ phối trộn chất mang 10 chế phẩm : 85 bã mía : 5 cám gạo giúp duy trì mật độ vi sinh vật cao và tối ưu hóa giá thành sản phẩm chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Sơ lược về Bacillus subtilis 1. Lịch sử phát hiện B.subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức Y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.

Đến những năm 1949 – 1957, khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được chủng B.subtilis thuần khiết thì ứng dụng của vi khuẩn này mới trở nên rộng rãi. Từ đó, thuật ngữ “subtilic therapy” ra đời.subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như là sinh vật phòng và điều trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy…[4] Ngày nay, B.subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi và nhiều tiềm năng ứng dụng hiệu quả trong y học, chăn nuôi, công nghiệp… 1. Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994) thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillace Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 1. Đặc điểm hình thái B.subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương, kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn.

Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào.subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ… 1. Đặc điểm sinh hóa Bảng 1. Các phản ứng sinh hóa của B.subtilis Các phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + DO.SUBTILIS Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di dộng + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Manitol + Glucose + Lactose - Maltose + (The Holt, 1992) [4] 1. Tính đối kháng của B.subtilis đối với một số vi sinh vật gây bệnh Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau.

Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của B.subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡngtrong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế. Khả năng sinh enzyme B.

subtilis có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzym ngoại bào có hoạt tính cao như: amylase, protease và cellulase… 1. Enzyme amylase Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Amylase là các enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các polyose tương tự như dextrin, glucogen. Ở vi khuẩn Bacillus enzyme chủ yếu trong DO.SUBTILIS nhóm này là α-amylase, α-amylase có khả năng thủy phân tinh bột mạnh và tạo thành những dextrin cao phân tử tạo màu với iot, α-amylase vi khuẩn được ổn định bằng ion canxi.

Phạm vi pH tác dụng tối thích là khoảng 6,5 – 7, α-amylase vi khuẩn bền vững với nhiệt độ cao và có thể giữ được hoạt tính ở cả nhiệt độ trên 70 oC. Nó có thể dịch hóa tinh bột nhanh ở 75 oC và thậm chí ở cả 100 oC.