Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng nồng độ các chất khí gây hiệu ứng nhà kính trong khí quyển là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến hiện tượng ấm lên toàn cầu và biến đổi khí hậu. Theo các dữ liệu tính toán từ Fourier được tác giả dẫn giải, hiệu ứng nhà kính tự nhiên đã giữ nhiệt độ trung bình của Trái Đất ở mức 15 °C thay vì mức -23 °C nếu không có tầng khí quyển, tức làm tăng khoảng 38 °C. Trong các chất khí gây hiệu ứng nhà kính, methane ($CH_4$) là hợp chất carbon phong phú thứ hai trong khí quyển với hàm lượng đo đạc đạt khoảng 1,9 ppmv. Mặc dù tổng thể tích phát thải thấp hơn carbon dioxide ($CO_2$), song tiềm năng làm ấm toàn cầu của $CH_4$ cao gấp 25 đến 26 lần so với $CO_2$ và đóng góp khoảng 20% vào hiện tượng ấm lên toàn cầu (theo số liệu từ Ủy ban Liên chính phủ về Biến đổi Khí hậu - IPCC, 2014). Nồng độ $CH_4$ trong không khí đang gia tăng trung bình 0,6% mỗi năm.

Về phương diện nguồn gốc phát thải, các hoạt động nông nghiệp là nguồn phát sinh khí nhà kính lớn, trong đó canh tác lúa nước chiếm trên 57% lượng phát thải $CH_4$ từ sản xuất nông nghiệp (chiếm khoảng 21% tổng lượng phát thải $CH_4$ toàn cầu). Do sức ép tăng trưởng dân số, sản lượng lúa nước được dự báo phải gia tăng khoảng 60% trong vòng ba thập kỷ tới, từ đó làm gia tăng nguy cơ ô nhiễm khí thải nếu không có các biện pháp can thiệp thích hợp. Các phương pháp xử lý vật lý và hóa học truyền thống như hấp phụ bằng than hoạt tính hoặc đốt đòi hỏi chi phí đầu tư cao nhưng hiệu suất thu hồi thấp. Do đó, việc ứng dụng nhóm vi khuẩn oxy hóa methane (Methane-Oxidizing Bacteria - MOB, hay Methanotrophs) có khả năng chuyển hóa $CH_4$ thành methanol nhờ hệ enzyme methane monooxygenase (MMO) được xác định là hướng tiếp cận sinh học có chi phí thấp và an toàn với môi trường. Tuy nhiên, việc phát hiện và định danh nhanh các chủng vi khuẩn này bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống gặp nhiều trở ngại do đặc tính khó nuôi cấy của vi sinh vật kỵ khí/hiếu khí chuyên biệt.

Khóa luận xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng cơ sở dữ liệu về gene mã hóa cho methane monooxygenase của vi khuẩn Methanotrophs.
  2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho vùng gene mục tiêu mã hóa cho methane monooxygenase của vi khuẩn Methanotrophs.
  3. Khảo sát và tối ưu hóa quy trình PCR phát hiện gene mã hóa cho methane monooxygenase của vi khuẩn Methanotrophs.
  4. Định danh chủng có khả năng làm giảm $CH_4$ bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên vùng gene 16S rRNA.

Để hoàn thành các mục tiêu trên, tác giả triển khai 5 nhiệm vụ thực hiện:

  1. Khai thác dữ liệu: Thu thập dữ liệu về các gene mã hóa enzyme pMMO và sMMO, thống kê thông tin và xác định gene mục tiêu.
  2. Thu thập trình tự vùng gene mục tiêu mã hóa pMMO và sMMO trên cơ sở dữ liệu NCBI.
  3. Khảo sát mồi cho phản ứng PCR: Thiết kế mồi đặc hiệu, kiểm tra các thông số vật lý và độ đặc hiệu của mồi.
  4. Tách chiết DNA và tối ưu hóa quy trình PCR phát hiện gene mục tiêu.
  5. Định danh mẫu mang gene pMO và sMO bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự vùng gene 16S rRNA.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: 48 mẫu môi trường tự nhiên và nhân tạo nghi nhận có sự hiện diện của vi khuẩn MOB, bao gồm: 32 mẫu đất lúa (thu thập tại độ sâu 10–15 cm từ đất ngập nước không qua xử lý khử trùng trong 30 ngày), 8 mẫu nước thải sau hầm biogas, 4 mẫu dịch dạ cỏ gia súc, và 4 mẫu nước thải hệ thống xử lý.
  • Phạm vi không gian: Mẫu được thu thập tại 4 tỉnh, thành phố phía Nam bao gồm Tây Ninh, Kiên Giang, Vĩnh Long và Bình Dương (trạm xử lý nước thải cơ sở 3 Trường Đại học Mở).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được tiến hành từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 07 năm 2020 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh và Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết về con đường chuyển hóa carbon của nhóm vi khuẩn Methanotrophs thuộc ngành Proteobacteria (gồm các lớp $\gamma$-Proteobacteria - Loại I, $\alpha$-Proteobacteria - Loại II, Loại X) và ngành Verrucomicrobia. Quá trình oxy hóa $CH_4$ bước đầu thành $CH_3OH$ được xúc tác bởi enzyme MMO tồn tại ở hai dạng:

  • Dạng hạt liên kết màng (particulate methane monooxygenase - pMMO): Phổ biến ở hầu hết các loài Methanotrophs, có trung tâm xúc tác chứa đồng, mã hóa bởi cụm gene pmoCAB gồm 3 tiểu đơn vị pmoB (45 kDa), pmoA (26 kDa) và pmoC (23 kDa). Trong đó, chuỗi trình tự của pmoC và pmoA có mức độ bảo tồn rất cao giữa các loài, trong khi pmoB không có tính bảo tồn nên không thích hợp làm chỉ thị phân tử.
  • Dạng hòa tan (soluble methane monooxygenase - sMMO): Được biểu hiện khi nồng độ đồng trong môi trường thấp, có trung tâm xúc tác diiron, mã hóa bởi operon mmoXYZCB. Trong đó, đoạn gene mmoX (mã hóa tiểu đơn vị $\alpha$-hydroxylase, khối lượng 61 kDa) là vùng trình tự bảo tồn cao nhất, được chọn làm trình tự đích phát hiện vi khuẩn mang sMMO.

Ngoài ra, nghiên cứu áp dụng nguyên lý kiểm soát chất lượng phản ứng PCR theo tiêu chuẩn của Ủy ban Tiêu chuẩn Hóa Châu Âu (CEN) và Tổ chức Tiêu chuẩn Hóa Quốc tế (ISO) thông qua việc thiết lập chứng nội (Internal Amplification Control - IAC). Đoạn gene 16S rRNA của vi khuẩn được sử dụng làm khuôn cho chứng nội để phát hiện các trường hợp âm tính giả sinh ra do chất ức chế hoặc sai hỏng chu trình nhiệt.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu kết hợp hai nhóm phương pháp: phân tích tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử (in vitro):

  • Phương pháp in silico: Khai thác cơ sở dữ liệu NCBI GenBank và PubMed Central để thu thập trình tự các gene pmoCAB, mmoX và 16S rRNA dưới định dạng FASTA. Căn gióng đa trình tự bằng BioEdit v7 và ClustalX để xác định các vùng bảo tồn. Thiết kế mồi bằng phần mềm Primer3 và kiểm tra độ đặc hiệu bắt cặp bằng công cụ BLAST. Đánh giá các thông số hóa lý của mồi thông qua IDT OligoAnalyzer, quy chuẩn chiều dài mồi trong giới hạn 15–30 bp, tỷ lệ %GC từ 40–60%, hiệu số nhiệt độ nóng chảy $\Delta Tm \le 5$ °C, và biến thiên năng lượng tự do Gibbs cho các cấu trúc thứ cấp (hairpin, self-dimer, hetero-dimer) đạt $|\Delta G| < 9$ kcal/mol. Phần mềm Annhyb 4 được dùng để mô phỏng khả năng bắt cặp; MEGA 7 dùng để phân tích tiến hóa và thiết lập cây phát sinh loài.
  • Phương pháp thực nghiệm:
    • Nuôi ủ làm giàu: Xử lý mẫu trong dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) để loại bỏ tạp chất và đất bám dính; sau đó nuôi lắc 250 vòng/phút ở 25 °C trong 5–7 ngày trên môi trường khoáng tối thiểu dAMS có bổ sung khí $CH_4$ làm nguồn carbon duy nhất.
    • Tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp ly trích hóa học truyền thống bằng hỗn hợp Phenol - Chloroform - Isopropanol, tủa DNA và hòa tan trong đệm TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH = 8). Đánh giá độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ OD tại bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ SmartSpec UV/VIS.
    • Kỹ thuật PCR: Phản ứng được thực hiện với hóa chất Master Mix 2X (Thermo Scientific) trên máy luân nhiệt. Thiết lập dải gradient nhiệt độ để xác định nhiệt độ bắt cặp ($Ta$) tối ưu cho từng cặp mồi.
    • Điện di kiểm tra: Sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TBE, nhuộm mẫu và kiểm tra dưới hệ thống chụp ảnh GelDoc XR (Bio-Rad) với thang chuẩn DNA 100 bp ladder.
    • Giải trình tự: Sản phẩm PCR được giải trình tự theo nguyên lý kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide (ddNTP) của Sanger.
Nhóm phương pháp Công cụ / Hóa chất sử dụng Mục đích thực hiện
Tin sinh học (in silico) NCBI, BLAST, BioEdit v7, ClustalX, Primer3, IDT OligoAnalyzer, Annhyb 4, MEGA 7 Khai thác dữ liệu, thiết kế và đánh giá mồi, mô phỏng phản ứng, dựng cây phát sinh
Làm giàu và tách chiết Môi trường dAMS sục khí $CH_4$, đệm PBS, Phenol, Chloroform, Isopropanol, đệm TE Làm giàu sinh khối vi khuẩn MOB, tách chiết DNA tổng số từ mẫu môi trường
Khuếch đại PCR Master Mix 2X (Thermo Scientific), máy luân nhiệt ESCO, gradient nhiệt độ Tối ưu hóa nhiệt độ lai, khuếch đại gene pMO, sMO, 16S rRNA và chứng nội IAC
Phân tích sản phẩm Agarose 1,5%, đệm TBE, thang DNA 100 bp, hệ thống GelDoc XR, máy giải trình tự Sanger Kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại qua điện di và xác định trình tự nucleotide

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1. Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết bao quát về chu trình phát thải và chuyển hóa methane trong sinh quyển:

  • Hệ thống hóa nguyên nhân, hiện trạng phát thải khí nhà kính toàn cầu và vai trò của $CH_4$. Tác giả làm rõ các cơ chế hóa sinh trong chu trình oxy hóa methane của vi khuẩn MOB qua chuỗi phản ứng liên tiếp: $CH_4 \rightarrow CH_3OH \rightarrow HCHO \rightarrow HCOOH \rightarrow CO_2$, được xúc tác bởi các enzyme MMO, methanol dehydrogenase (MDH), formaldehyde dehydrogenase (FADH) và formate dehydrogenase (FDH).
  • Phân tích chi tiết đặc điểm cấu trúc không gian và bản chất sinh học của hai hệ enzyme sMMO và pMMO. Cấu trúc tinh thể dạng homotrimer $(\alpha\beta\gamma)_3$ của pMMO và heterodimer $(\alpha\beta\gamma)_2$ của sMMO được phân tích cụ thể, đồng thời đối chiếu cơ chế điều hòa biểu hiện gene phụ thuộc vào nồng độ ion đồng ($Cu^{2+}$) trong môi trường.
  • Tổng kết cấu trúc phân tử của operon pmoCAB và mmoXYZCB. Tác giả chứng minh rằng việc nhắm vào các vùng bảo tồn trên pmoC, pmoA và mmoX là giải pháp tối ưu cho việc thiết kế mồi sinh học phân tử. Đồng thời, chương này giới thiệu cơ chế kỹ thuật PCR, giải trình tự Sanger và tầm quan trọng của hệ thống chứng nội IAC trong việc chuẩn hóa các phép thử chẩn đoán.
  • Tổng quan lịch sử nghiên cứu về Methanotrophs từ các công bố quốc tế (Whittenbury 1970, Bodrossy 1997, Gilbert 2000, Horz 2001, Ghashghavi 2017, Ngoc Loi Nguyen 2018) và trong nước (Nguyễn Thị Hiếu Thu 2016 trên chủng Methylomonas chuyển hóa $CH_4$ tạo sinh khối giàu đạm).

Phần 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các tiêu chuẩn kỹ thuật được áp dụng trong toàn bộ đề tài:

  • Phân loại 48 mẫu nghiên cứu theo nguồn gốc sinh thái và địa bàn thu thập cụ thể. Thiết lập quy chuẩn xử lý mẫu đất ruộng lúa tại độ sâu 10–15 cm, loại bỏ tạp chất qua đệm PBS và thực hiện nuôi ủ làm giàu có chọn lọc trên môi trường dAMS với khí $CH_4$ trong thời gian 5–7 ngày ở 25 °C và tốc độ lắc 250 vòng/phút.
  • Chi tiết hóa quy trình in silico bằng sơ đồ tiến trình logic gồm 8 bước từ khai thác dữ liệu, thiết kế mồi, đánh giá thông số lý hóa mồi, tách chiết DNA, tối ưu hóa PCR, điện di kiểm tra, giải trình tự Sanger và xây dựng cây phát sinh loài.
  • Liệt kê đầy đủ các danh mục hóa chất chuyên dụng (Phenol, Chloroform, Isopropanol, đệm TE, Master Mix 2X, Agarose 1,5%, đệm TBE, thang chuẩn 100 bp) cùng danh mục trang thiết bị chính bao gồm tủ thao tác PCR ESCO ADC-4B1, máy ly tâm lạnh Hettich Universal 320R, máy quang phổ SmartSpec UV/VIS và hệ thống chụp ảnh gel GelDoc XR Bio-Rad.

Phần 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu đo đạc, hình ảnh điện di và kết quả xử lý tin sinh học thu được:

  • Kết quả in silico: Thiết kế và đánh giá thành công các cặp mồi chuyên biệt đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn lý hóa:
    • Cặp mồi chứng nội IAC (IAC-F, IAC-R) hướng tới vùng gene 16S rRNA.
    • Cặp mồi pmoC-F và pmoA-R đặc hiệu cho đoạn liên vùng gene pmoCA của enzyme pMMO.
    • Cặp mồi mmoX-F và mmoX-R đặc hiệu cho gene mmoX của enzyme sMMO.
    • Cặp mồi định danh vi khuẩn 321F và 1430R hướng tới đoạn gene 16S rRNA.
  • Đánh giá chất lượng tách chiết DNA: Các mẫu DNA tách chiết từ nguồn mẫu làm giàu (đại diện là mẫu DL1, DL4 từ đất lúa) đạt độ tinh sạch tốt thông qua tỷ số mật độ quang học $OD_{260}/OD_{280}$, đảm bảo điều kiện tiến hành phản ứng khuếch đại gene.
  • Khảo sát tối ưu hóa nhiệt độ lai ($Ta$):
    • Phản ứng PCR với cặp mồi IAC-F/IAC-R được khảo sát trên dải gradient từ 51 °C đến 61 °C, cho kết quả khuếch đại băng vạch đơn, rõ nét, không xuất hiện sản phẩm phụ.
    • Cặp mồi pmoC-F/pmoA-R được tối ưu trên dải gradient 51 °C – 61 °C trên mẫu DNA DL1, xác định được điều kiện bắt cặp đặc hiệu cho vạch sản phẩm mục tiêu.
    • Cặp mồi mmoX-F/mmoX-R được tối ưu trên dải nhiệt độ 51 °C – 61 °C trên mẫu DNA DL4, cho thấy sản phẩm khuếch đại sắc nét và đồng nhất.
    • Cặp mồi định danh 321F/1430R được khảo sát trên dải gradient từ 54 °C đến 64 °C trên mẫu DNA DL1, cho băng khuếch đại đặc hiệu kích thước trên 1000 bp.
  • Kết quả giải trình tự và BLAST: Các sản phẩm PCR từ mẫu DL1 (với mồi pmoC-F/pmoA-R và mồi định danh) và mẫu DL4 (với mồi mmoX-F/mmoX-R và mồi định danh) được giải trình tự Sanger hai chiều. Dữ liệu nucleotide sau khi hiệu chỉnh mạch xuôi và mạch ngược được đối chiếu BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI, khẳng định các đoạn khuếch đại tương đồng cao với các trình tự gene pmoCA, mmoX và 16S rRNA của vi khuẩn Methanotrophs đã công bố.
  • Phân tích phát sinh loài: Từ dữ liệu giải trình tự vùng gene 16S rRNA của các mẫu nghiên cứu kết hợp với các trình tự đối chứng thu thập từ GenBank, cây phát sinh loài được thiết lập đồng thời bằng ba phương pháp: Maximum Likelihood (ML), Neighbor Joining (NJ) và Maximum Parsimony (MP) trên phần mềm MEGA 7. Kết quả phân tích xác nhận các mẫu phân lập đại diện thuộc chi Methylomonas sp. (nhóm vi khuẩn oxy hóa methane Loại I, họ Methylococcaceae).

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Nghiên cứu đã khảo sát thành công 48 mẫu môi trường và tối ưu hóa hệ thống phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn oxy hóa methane với các chỉ số kỹ thuật cụ thể:

Cặp mồi Trình tự đích Dải nhiệt độ gradient (°C) Mẫu đại diện kiểm tra Kết quả giải trình tự & Định danh
IAC-F / IAC-R 16S rRNA (Chứng nội IAC) 51 °C – 61 °C DL1 Băng đặc hiệu, kiểm soát âm tính giả cho hệ thống phản ứng
pmoC-F / pmoA-R pmoCA (Mã hóa enzyme pMMO) 51 °C – 61 °C DL1 (sản phẩm DL1.1) Tương đồng đặc hiệu với vùng gene pmoCA của Methanotrophs
mmoX-F / mmoX-R mmoX (Mã hóa enzyme sMMO) 51 °C – 61 °C DL4 (sản phẩm DL4.1) Tương đồng đặc hiệu với gene mmoX mã hóa tiểu đơn vị $\alpha$-hydroxylase
321F / 1430R 16S rRNA (Mồi định danh phân tử) 54 °C – 64 °C DL1, DL4 Định danh phân tử mẫu nghiên cứu thuộc chi Methylomonas sp.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Ứng dụng quy trình PCR tích hợp chứng nội IAC làm phương pháp kiểm nghiệm nhanh nhằm sàng lọc sự hiện diện của các chủng vi khuẩn oxy hóa methane từ các nguồn chất thải hữu cơ và đất nông nghiệp mà không cần trải qua giai đoạn phân lập thuần khiết kéo dài.
  • Kiến nghị sử dụng quy trình đã được chuẩn hóa để xây dựng ngân hàng giống vi khuẩn có hoạt tính phân giải methane cao, phục vụ định hướng nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học xử lý khí thải tại ruộng lúa ngập nước và các hệ thống biogas chăn nuôi quy mô nông hộ và công nghiệp.

Đóng góp mới của đề tài

  • Thiết lập quy trình phát hiện song song hai hệ gene chỉ thị quan trọng (pMO và sMO) chịu trách nhiệm chuyển hóa methane của vi khuẩn Methanotrophs tại khu vực phía Nam Việt Nam.
  • Tích hợp thành công chứng nội IAC vào quy trình phản ứng PCR, khắc phục triệt để hạn chế về hiện tượng âm tính giả thường gặp trong các phân tích sinh học phân tử đối với mẫu môi trường phức tạp (chứa nhiều hợp chất mùn humic, tạp chất hữu cơ).
  • Cung cấp dữ liệu phân tử thực nghiệm và mối quan hệ phát sinh loài của chi vi khuẩn Methylomonas sp. bản địa thu thập từ đất lúa, làm dày thêm cơ sở dữ liệu vi sinh vật môi trường tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Khóa luận chỉ tập trung tối ưu hóa các phản ứng PCR đơn lẻ và phản ứng kèm chứng nội trên một số lượng mẫu đại diện điển hình (chủ yếu là các mẫu đất lúa mã số DL1, DL4); chưa tiến hành khảo sát mở rộng trên toàn bộ 48 mẫu thu thập được. Đồng thời, nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ phát hiện sự hiện diện của gene và định danh phân tử chứ chưa định lượng mật độ tế bào hoặc đo lường tốc độ tiêu thụ khí $CH_4$ thực tế của các chủng phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Phát triển quy trình Multiplex PCR đồng thời phát hiện cả hai gene mục tiêu (pmoCA, mmoX) và chứng nội IAC trong cùng một ống phản ứng để tiết kiệm thời gian và chi phí hóa chất.
    • Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR (qPCR) nhằm định lượng số lượng bản sao gene mục tiêu trong các mẫu môi trường đất và nước theo thời gian thực.
    • Phân lập thuần khiết chủng vi khuẩn Methylomonas sp., tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng, hiệu suất oxy hóa $CH_4$ và khảo sát điều kiện tối ưu để sản xuất sinh khối làm chế phẩm vi sinh giảm thiểu phát thải khí nhà kính.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Công nghệ sinh học Môi trường và Vi sinh học ứng dụng.

Các nội dung có giá trị ứng dụng thực tiễn cao bao gồm:

  • Quy trình thiết kế và sàng lọc mồi in silico kết hợp đánh giá các thông số nhiệt động học ($\Delta G$, hairpin, dimer) bằng các phần mềm miễn phí và trực tuyến (BioEdit, Primer3, IDT OligoAnalyzer, BLAST).
  • Kỹ thuật thiết lập và vận hành hệ thống chứng nội IAC nhằm kiểm soát chất lượng phản ứng PCR đối với các mẫu dịch chiết thô từ đất và bùn thải.
  • Phương pháp luận phân tích phát sinh loài đa thuật ngữ (kết hợp Maximum Likelihood, Neighbor Joining và Maximum Parsimony) trên phần mềm MEGA 7 để định danh chính xác vi khuẩn đến cấp độ chi/loài.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn đoạn gene liên vùng pmoCA thay vì gene pmoB để thiết kế mồi phát hiện enzyme pMMO?

Theo các nghiên cứu trước của Gilbert và cộng sự (2000) cũng như Ghashghavi và cộng sự (2017) được tác giả trích dẫn trong chương Tổng quan tài liệu, cụm gene mã hóa pMMO gồm 3 tiểu đơn vị: pmoC, pmoA và pmoB. Tuy nhiên, qua phân tích căn gióng trình tự, pmoB không chứa các vùng trình tự bảo tồn giữa các loài Methanotrophs. Ngược lại, trình tự nucleotide của pmoC và pmoA chứa các vùng bảo tồn rất cao, thích hợp để thiết kế các cặp mồi chuyên biệt bắt cặp chính xác lên các loài vi khuẩn oxy hóa methane khác nhau. Do đó, đoạn liên vùng pmoCA được lựa chọn làm gene mục tiêu cho phản ứng PCR.

2. Vai trò của chứng nội (IAC) trong nghiên cứu này là gì và được thiết kế dựa trên đoạn gene nào?

Chứng nội (IAC) là một đoạn trình tự DNA luôn hiện diện trong tế bào (được tác giả thiết kế dựa trên vùng gene 16S rRNA bảo tồn của vi khuẩn) và được khuếch đại đồng thời trong phản ứng PCR. Vai trò của IAC là loại trừ kết quả âm tính giả. Nếu một phản ứng PCR không xuất hiện băng sản phẩm của gene mục tiêu (pMO hoặc sMO) nhưng có băng của IAC, điều đó khẳng định mẫu thực sự không chứa vi khuẩn đích. Ngược lại, nếu cả băng gene mục tiêu lẫn băng IAC đều không xuất hiện, phản ứng PCR được xác định là đã thất bại (do sự cố máy luân nhiệt, polymerase mất hoạt tính hoặc nồng độ chất ức chế trong mẫu quá cao).

3. Quy trình thu thập và tiền xử lý mẫu đất ruộng lúa được thực hiện như thế nào trước khi tách chiết DNA?

Mẫu đất ruộng lúa được lấy tại vùng đất ngập nước thuộc tỉnh Vĩnh Long và Kiên Giang, ở độ sâu từ 10 đến 15 cm tính từ mặt đất, với điều kiện bắt buộc là ruộng không qua khử trùng hoặc phun thuốc trong vòng 30 ngày trước thời điểm lấy mẫu. Để làm giàu vi khuẩn MOB, mẫu đất được lắc trong dung dịch đệm PBS nhằm loại bỏ các hạt đất và tạp chất bám dính, sau đó nuôi ủ trong môi trường lỏng khoáng tối thiểu dAMS có sục bổ sung khí $CH_4$ làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Bình nuôi cấy được lắc với vận tốc 250 vòng/phút ở nhiệt độ 25 °C trong thời gian từ 5 đến 7 ngày trước khi thu sinh khối để ly trích DNA.

4. Kết quả định danh sinh học phân tử bằng mồi 321F/1430R và phân tích cây phát sinh loài đã xác định được vi khuẩn nào?

Thông qua việc giải trình tự sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA bằng cặp mồi 321F/1430R trên các mẫu đại diện (DL1.1 và DL4.1) và phân tích cây phát sinh loài bằng 3 thuật toán Maximum Likelihood, Neighbor Joining và Maximum Parsimony trên phần mềm MEGA 7, tác giả đã định danh các mẫu DNA mang gene mục tiêu thuộc chi Methylomonas sp. Đây là nhóm vi khuẩn oxy hóa methane Loại I thuộc họ Methylococcaceae, lớp $\gamma$-Proteobacteria, sử dụng con đường ribulose monophosphate (RuMP) để đồng hóa carbon.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Hoài Linh đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR kết hợp chứng nội IAC nhằm phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn oxy hóa methane mang gene pMO và sMO. Thông qua sự kết hợp giữa phân tích tin sinh học in silico và kiểm chứng thực nghiệm trên 48 mẫu môi trường tự nhiên, đề tài đã tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ bắt cặp cho các cặp mồi chuyên biệt và định danh thành công vi khuẩn thuộc chi Methylomonas sp. từ đất ruộng lúa. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học và giải pháp kỹ thuật tin cậy phục vụ công tác sàng lọc nguồn vi sinh vật bản địa, hướng tới việc sản xuất các chế phẩm sinh học giảm thiểu phát thải khí nhà kính trong canh tác nông nghiệp bền vững.