Xây dựng quy trình khuếch đại chọn lọc hbv rna trong mẫu huyết tương nhằm đánh giá biến động tải lượng hbv rna ở bệnh nhân viêm gan mạn tính

Nghiên cứu quy trình khuếch đại chọn lọc HBV RNA, đánh giá biến động tải lượng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Giải pháp mới trong chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Vũ Nguyễn Quỳnh Anh
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQGHN
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xây Dựng Quy Trình Khuếch Đại Chọn Lọc HBV RNA Trong Mẫu Huyết Tương Nhằm Đánh Giá Biến Động Tải Lượng HBV RNA Ở Bệnh Nhân Viêm Gan Mạn Tính
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: Năm 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ. TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan viêm gan B mạn tính
• 1.2. Dịch tễ học
• 1.3. Chẩn đoán viêm gan B mạn tính
• 1.4. Điều trị viêm gan B mạn tính và những thách thức
• 1.5. Đặc điểm sinh học của virus viêm gan B
• 1.5.1. Phân loại học
• 1.5.2. Cấu trúc của hạt virus HBV
• 1.5.3. Cấu trúc của hệ gen virus
• 1.5.4. Chu trình nhân lên của virus
• 1.5.5. Đường lây nhiễm của virus HBV
• 1.6. Ý nghĩa dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT
• 1.6.1. Phát hiện dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT
• 1.6.2. Nguồn gốc của HBV RNA huyết tương
• 1.6.3. Ý nghĩa của dấu ấn HBV RNA huyết tương
• 1.6.4. Các nghiên cứu trên thế giới về HBV RNA
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu, vật liệu và hóa chất nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng tham gia nghiên cứu
• 2.1.2. Vật liệu, hóa chất
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu
• 2.2.2. Thiết kế trình tự primer và probe cho quy trình định lượng HBV RNA
• 2.2.3. Tổng hợp chứng dương HBV RNA in-vitro
• 2.2.4. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA huyết tương
• 2.2.5. Phân tích, xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA
• 3.1.1. Tối ưu nồng độ mồi
• 3.1.2. Tối ưu nồng độ probe
• 3.1.3. Tối ưu nồng độ chất phụ gia
• 3.1.4. Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược
• 3.1.5. Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược
• 3.1.6. Tối ưu thể tích mẫu
• 3.1.7. Thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA
• 3.1.7.1. Quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA tối ưu
• 3.1.7.2. Xây dựng đường chuẩn quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA
• 3.1.7.3. Xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA
• 3.1.7.4. Đánh giá cặp mồi định lượng HBV RNA
• 3.2. Phân tích biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân VGBMT
• 3.2.1. Mô tả đặc điểm của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
• 3.2.2. Biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân ở các thời điểm điều trị khác nhau
• 3.2.3. Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau
• 3.2.4. Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến thanh thải HBeAg ở tháng thứ 6 ở các thời điểm điều trị khác nhau
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Viêm Gan B Mạn Tính Cập Nhật Mới Nhất

Viêm gan B mạn tính (VGBMT) là vấn đề sức khỏe toàn cầu, đặc biệt ở châu Á. Bệnh do virus viêm gan B (HBV) gây ra, với tỷ lệ nhiễm và tử vong cao. Hơn 40% người nhiễm HBV mạn tính gặp biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan. Việc điều trị bằng thuốc kháng virus nucleot(s)ide (NA) gặp nhiều khó khăn do cccDNA tồn tại dai dẳng trong tế bào gan. Điều trị kéo dài với NA có thể gây đột biến kháng thuốc và nguy cơ tổn thương gan. Do đó, việc đánh giá cccDNA rất quan trọng để xác định thời điểm dừng điều trị và hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, đánh giá cccDNA đòi hỏi sinh thiết gan, gây khó khăn trong thực tế. HBV RNA, được phát hiện từ năm 1996, là dấu ấn sinh học hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA để đánh giá biến động tải lượng virus ở bệnh nhân VGBMT, khắc phục nhược điểm của các quy trình trước đây cần DNase để loại bỏ DNA.

1.1. Dịch Tễ Học Viêm Gan B Mạn Tính Số Liệu Thống Kê

Ước tính có khoảng hai tỷ người từng nhiễm HBV, trong đó 296 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính. Tỷ lệ dương tính HBsAg là 3.6%, thay đổi theo khu vực địa lý. Các khu vực có tỉ lệ lưu hành thấp (dưới 2%) phân bố ở các các khu vực như Bắc Mỹ và Tây Âu; các nước có tỷ lệ trung bình (2-7%) như các nước ở Địa Trung Hải, Đông Âu, Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%) là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan và Đông Á. Việt Nam nằm trong nhóm có tỷ lệ nhiễm HBV cao, 10-20% dân số. Số ca tử vong do xơ gan và ung thư gan liên quan đến VGBMT tăng 33% giai đoạn 1990-2013, với hơn 686.000 ca năm 2013 trên toàn cầu. Tỷ lệ tiến triển sang mạn tính cao nhất ở trẻ sơ sinh (90%), giảm dần ở trẻ em và người lớn. Các nghiên cứu mô hình đã dự đoán đến năm 2025, nước ta sẽ có khoảng 8 triệu trường hợp nhiễm viêm gan B mạn tính và khoảng 58.600 ca ung thư gan có liên quan đến HBV, và ước tính tỉ lệ tử vong hàng năm liên quan đến HBV là 40.

1.2. Chẩn Đoán Viêm Gan B Mạn Tính Dấu Ấn Virus Học Quan Trọng

Chẩn đoán viêm gan B mạn tính dựa trên đặc điểm sinh hóa, virus học, mô học và loại trừ các nguyên nhân khác. Các xét nghiệm chức năng gan, huyết thanh (HBsAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe) được thực hiện để đánh giá giai đoạn bệnh. Nồng độ HBV DNA được theo dõi để đánh giá tiến triển bệnh và hiệu quả điều trị. Sinh thiết gan giúp xác định giai đoạn xơ hóa và tình trạng viêm hoại tử gan. Theo Quyết định 3310/QĐ-BYT, VGBMT được xác định khi HBsAg và/hoặc HBV DNA dương tính ≥ 6 tháng, hoặc HBsAg dương tính và anti-HBc IgM âm tính. Chẩn đoán chính xác là rất quan trọng cho theo dõi và tiên lượng.

II. Thách Thức Điều Trị Viêm Gan B Cần Giải Pháp Mới

Mục tiêu điều trị viêm gan B mạn tính là ức chế nhân lên của HBV, cải thiện chức năng gan, ngăn ngừa xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Các thuốc điều trị hiện nay như interferon-α (IFN-α), lamivudine và adefovir giúp đạt được đáp ứng điều trị (HBV DNA không phát hiện, HBeAg âm tính, cải thiện chức năng gan). Quyết định 3310/QĐ-BYT chỉ dẫn nguyên tắc điều trị: ưu tiên thuốc uống nucleot(s)ide analogues (NA), điều trị lâu dài, tuân thủ điều trị. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất là không thể chữa khỏi hoàn toàn do cccDNA tồn tại trong tế bào gan. Thuốc kháng virus chỉ giảm tổn thương gan, không loại bỏ cccDNA hoàn toàn. Do đó, bệnh nhân thường phải điều trị suốt đời.

2.1. Kháng Thuốc và Tái Phát Vấn Đề Nhức Nhối Khi Điều Trị HBV

Điều trị kháng virus kéo dài có thể dẫn đến kháng thuốc. Mặc dù chuyển đảo huyết thanh HBeAg và ức chế HBV DNA được coi là thời điểm dừng thuốc, tỷ lệ tái phát cao (90%). Thanh thải HBsAg được coi là thời điểm dừng thuốc lý tưởng, nhưng tỉ lệ đạt được thấp khi dùng thuốc đơn lẻ. Chính vì vậy, việc nghiên cứu một phác đồ điều trị lý tưởng hoặc tìm ra những dấu ấn sinh học mới có thể xác định chính xác và hiệu quả thời điểm ngừng thuốc an toàn là vô cùng cần thiết trong quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính. Do đó, cần nghiên cứu các dấu ấn sinh học mới để xác định thời điểm ngừng thuốc an toàn và hiệu quả.

2.2. Vai Trò của cccDNA Tại Sao HBV Khó Chữa Khỏi Hoàn Toàn

cccDNA là dạng genome DNA của virus, tồn tại trong tế bào gan và là khuôn mẫu cho quá trình phiên mã các gen của virus. Các loại thuốc kháng virus đang được áp dụng điều trị hiện nay đều chỉ có thể làm giảm tổn thương gan và ngăn ngừa các diễn tiến nghiêm trọng hơn của bệnh gan chứ không hoàn toàn loại bỏ cccDNA, nên viêm gan B mạn tính thường không được chữa khỏi hoàn toàn và bệnh nhân thường điều trị suốt đời.

III. HBV RNA Định Lượng Dấu Ấn Sinh Học Tiềm Năng Mới

HBV RNA được phát hiện trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Nghiên cứu chỉ ra rằng HBV RNA có thể có ý nghĩa trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT. Vai trò của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ và hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan sẽ được phản ánh bởi nồng độ RNA của HBV (HBV RNA). Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV RNA là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT.

3.1. Ý nghĩa của HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT

Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV RNA là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT

3.2. Nguồn gốc của HBV RNA huyết tương

Vai trò của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ và hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan sẽ được phản ánh bởi nồng độ RNA của HBV (HBV RNA).

IV. Phương Pháp Khuếch Đại Chọn Lọc HBV RNA Tối Ưu Quy Trình

Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển và tối ưu hóa một quy trình khuếch đại chọn lọc HBV RNA mới để định lượng chính xác tải lượng virus ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Điểm khác biệt của quy trình này là loại bỏ sự cần thiết của DNase trong quá trình tách chiết RNA, giảm thời gian xử lý mẫu và bảo toàn chất lượng RNA tốt hơn. Qua đó cải thiện độ chính xác và hiệu quả của xét nghiệm.

4.1. Thiết kế Primer và Probe Đặc Hiệu cho HBV RNA

Quy trình xây dựng primer và probe cần được thiết kế đặc hiệu để phát hiện RNA của virus viêm gan B (HBV), đồng thời tránh phản ứng chéo với các loại RNA khác. Việc chọn lọc kỹ lưỡng các primer và probe này đảm bảo tính chính xác và độ nhạy của xét nghiệm định lượng HBV RNA.

4.2. Tối Ưu Hóa Các Thông Số RT qPCR Để Định Lượng HBV RNA

Cần tối ưu hóa nồng độ mồi, nồng độ probe, nồng độ chất phụ gia, nhiệt độ bước phiên mã ngược và thời gian bước phiên mã ngược, thể tích mẫu để thực hiện RT-qPCR định lượng HBV RNA hiệu quả, đảm bảo quá trình phiên mã ngược diễn ra hiệu quả và phản ứng qPCR được thực hiện tối ưu.

4.3. Xây dựng đường chuẩn quy trình RT qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA

Quy trình này giúp xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA, Đảm bảo quá trình xây dựng đường chuẩn được hiệu quả, nhằm tăng tính chính xác của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA

V. Phân Tích Biến Động Tải Lượng HBV RNA Kết Quả Nghiên Cứu

Nghiên cứu này tiến hành phân tích biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau. Tải lượng HBV RNA được đo lường ở các nhóm bệnh nhân khác nhau theo các mốc thời gian khác nhau trong quá trình điều trị, điều này cho phép đánh giá hiệu quả điều trị.

5.1. Biến động tỉ lệ dương tính của HBV RNA liên quan đến HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau

Kết quả nghiên cứu sẽ giúp làm sáng tỏ mối liên hệ giữa biến động tải lượng HBV RNA và HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về sự thay đổi virus học và đáp ứng điều trị ở bệnh nhân viêm gan B.

5.2. Biến động tỉ lệ dương tính của HBV RNA liên quan đến thanh thải HBeAg ở tháng thứ 6 ở các thời điểm điều trị khác nhau

Qua việc phân tích dữ liệu, nghiên cứu này có thể cung cấp thông tin quan trọng về khả năng sử dụng HBV RNA để dự đoán thanh thải HBeAg và đánh giá hiệu quả điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

VI. Tiềm Năng Ứng Dụng của HBV RNA Trong Quản Lý HBV

Nghiên cứu này góp phần khẳng định tiềm năng của HBV RNA như một dấu ấn sinh học quan trọng trong quản lý viêm gan B mạn tính. Kết quả nghiên cứu có thể giúp cải thiện chiến lược điều trị, dự đoán đáp ứng điều trị và theo dõi bệnh nhân hiệu quả hơn.

6.1. HBV RNA giúp cá thể hóa điều trị và nâng cao hiệu quả

Thông qua việc theo dõi tải lượng HBV RNA, các bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị phù hợp với từng bệnh nhân, từ đó tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về HBV RNA và vai trò của nó trong viêm gan B

Nghiên cứu sâu hơn về HBV RNA có thể giúp khám phá các cơ chế bệnh sinh mới và phát triển các phương pháp điều trị tiên tiến hơn cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan B mạn tính (VGBMT) là một trong những vấn đề y tế toàn cầu nghiêm trọng, với khoảng 296 triệu người mắc trên toàn thế giới theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Tỷ lệ nhiễm HBsAg trung bình toàn cầu là 3,6%, trong đó khu vực Đông Á và Việt Nam có tỷ lệ cao, lên đến 10-20% trong dân số chung và có thể lên tới 31-54% ở các vùng nguy cơ cao. VGBMT là nguyên nhân hàng đầu gây xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), với hơn 686.000 ca tử vong liên quan đến các biến chứng này trong năm 2013. Việc điều trị VGBMT hiện nay chủ yếu dựa trên thuốc kháng virus đồng đẳng nucleot(s)ide analogues (NA) như entecavir và tenofovir, tuy nhiên hiệu quả điều trị còn hạn chế do sự tồn tại dai dẳng của cccDNA trong tế bào gan, khiến bệnh nhân phải điều trị kéo dài và có nguy cơ kháng thuốc.

Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình khuếch đại chọn lọc HBV RNA trong mẫu huyết tương để đánh giá biến động tải lượng HBV RNA ở bệnh nhân VGBMT. Mục tiêu cụ thể là thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA không cần bước xử lý DNase, từ đó đánh giá biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân trước và trong quá trình điều trị. Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Quân Y 103, Hà Nội, trong năm 2022, với ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp dấu ấn sinh học mới giúp theo dõi hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh nhân VGBMT.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Sinh học phân tử virus HBV: HBV là virus thuộc họ Hepadnaviridae, có hệ gen DNA sợi đôi không khép kín (rcDNA) dài khoảng 3,2 kb, mã hóa cho 4 khung đọc mở (ORF) chồng lên nhau, bao gồm các gen mã hóa protein vỏ, polymerase, kháng nguyên lõi (HBcAg) và kháng nguyên e (HBeAg). cccDNA tồn tại trong nhân tế bào gan là khuôn mẫu phiên mã cho các RNA virus, trong đó có pregenomic RNA (pgRNA) – mạch khuôn cho tổng hợp DNA virus.

• Vai trò của HBV RNA huyết tương: HBV RNA, đặc biệt là pgRNA, được phát hiện trong huyết tương bệnh nhân VGBMT và được xem là dấu ấn sinh học tiềm năng phản ánh hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan. HBV RNA có thể tồn tại trong các virion chưa trưởng thành và có thể được định lượng bằng kỹ thuật RT-qPCR để theo dõi biến động tải lượng virus trong quá trình điều trị.

• Mô hình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA: Phương pháp RT-qPCR kết hợp bước phiên mã ngược giúp khuếch đại và định lượng chính xác HBV RNA trong mẫu huyết tương, với thiết kế cặp primer và probe đặc hiệu vùng gen S bảo tồn của HBV, tránh nhiễm DNA virus và không cần bước xử lý DNase.

Các khái niệm chính bao gồm: cccDNA, pgRNA, RT-qPCR, tải lượng HBV RNA, HBeAg, và thuốc kháng virus NA.

Phương pháp nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: 115 bệnh nhân VGBMT được chẩn đoán theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Gan mật Mỹ 2009, thu thập mẫu huyết tương trước điều trị, sau 3 tháng (49 mẫu) và 6 tháng (46 mẫu) điều trị tại Bệnh viện Quân Y 103. Nhóm chứng gồm 50 người khỏe mạnh không nhiễm HBV.

• Vật liệu và hóa chất: Sử dụng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit để tách chiết RNA từ 500 µL huyết tương, enzyme phiên mã ngược WarmStart® RTx Reverse Transcriptase, primer và probe thiết kế đặc hiệu vùng gen S của HBV.

• Thiết kế primer và probe: Dựa trên trình tự gen S vùng N-terminal bảo tồn, cặp primer được thiết kế để khuếch đại chọn lọc HBV RNA, tránh khuếch đại DNA virus, không cần xử lý DNase.

• Quy trình RT-qPCR: Tối ưu các thành phần phản ứng (mồi 0,5 µM, probe 0,2 µM), nhiệt độ phiên mã ngược 50°C trong 10 phút, thể tích mẫu RNA 10 µL, chu trình PCR gồm 45 vòng với biến tính 94°C, gắn mồi 63°C, kéo dài 72°C.

• Phân tích số liệu: Tải lượng HBV RNA được tính theo công thức chuẩn, quy đổi log10 bản sao/mL, phân tích thống kê bằng kiểm định Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis và Chi-square với mức ý nghĩa p < 0,05.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân tích trong năm 2022, theo dõi biến động tải lượng HBV RNA ở các thời điểm trước điều trị, 3 tháng và 6 tháng điều trị.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA thành công: Quy trình không cần bước xử lý DNase, với nồng độ mồi 0,5 µM và probe 0,2 µM, nhiệt độ phiên mã ngược 50°C trong 10 phút, thể tích mẫu 10 µL cho hiệu suất khuếch đại cao và độ đặc hiệu tốt. Đường chuẩn tuyến tính trong dải 10^1 đến 10^6 bản sao/µL với hệ số tương quan R² > 0,99.

2. Tỷ lệ dương tính HBV RNA ở bệnh nhân VGBMT trước điều trị là khoảng 80%, giảm còn 60% sau 3 tháng và 45% sau 6 tháng điều trị (Bảng 10). Tải lượng HBV RNA trung vị giảm từ 5,2 log10 bản sao/mL trước điều trị xuống còn 3,8 log10 bản sao/mL sau 6 tháng (p < 0,05).

3. Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến trạng thái HBeAg: Nhóm HBeAg dương tính có tỷ lệ dương tính HBV RNA cao hơn (90%) so với nhóm HBeAg âm tính (55%) trước điều trị. Tải lượng HBV RNA giảm nhanh hơn ở nhóm HBeAg dương tính trong 6 tháng điều trị (Bảng 14, 15).

4. Tốc độ suy giảm HBV RNA chậm hơn so với HBV DNA trong quá trình điều trị: Tốc độ suy giảm HBV RNA trung bình 0,25 log10 bản sao/mL/tháng, trong khi HBV DNA giảm 0,35 log10 bản sao/mL/tháng (Bảng 11, 12), cho thấy HBV RNA có thể là dấu ấn sinh học phản ánh hoạt động cccDNA bền vững hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA được thiết lập có độ nhạy và đặc hiệu cao, phù hợp để theo dõi biến động tải lượng HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT. Việc không cần bước xử lý DNase giúp rút ngắn thời gian và bảo toàn chất lượng RNA, nâng cao tính thực tiễn trong lâm sàng.

Tỷ lệ dương tính và tải lượng HBV RNA giảm dần theo thời gian điều trị phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, khẳng định HBV RNA là dấu ấn sinh học tiềm năng để đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát. Sự khác biệt về biến động HBV RNA giữa nhóm HBeAg dương tính và âm tính phản ánh vai trò của HBeAg trong hoạt động phiên mã và nhân lên virus.

So sánh với tải lượng HBV DNA, HBV RNA giảm chậm hơn, cho thấy HBV RNA có thể phản ánh hoạt động của cccDNA trong gan, điều mà HBV DNA không thể hiện đầy đủ do bị ức chế bởi thuốc NA. Dữ liệu này hỗ trợ việc sử dụng HBV RNA như một chỉ số bổ sung trong quản lý điều trị VGBMT.

Các biểu đồ biểu diễn biến động tải lượng HBV RNA và HBV DNA theo thời gian điều trị, phân nhóm theo trạng thái HBeAg sẽ minh họa rõ nét sự khác biệt và xu hướng giảm tải lượng virus, giúp bác sĩ lâm sàng đưa ra quyết định điều trị chính xác hơn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA trong theo dõi điều trị VGBMT: Khuyến nghị các cơ sở y tế triển khai kỹ thuật này để đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát, giúp tối ưu hóa phác đồ điều trị. Thời gian thực hiện: trong vòng 6-12 tháng.

2. Phát triển bộ kit xét nghiệm thương mại dựa trên quy trình đã thiết lập: Hỗ trợ chuẩn hóa và mở rộng ứng dụng trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm trên toàn quốc. Chủ thể thực hiện: các công ty công nghệ sinh học, thời gian 1-2 năm.

3. Đào tạo nhân viên y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm về kỹ thuật RT-qPCR HBV RNA: Đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả xét nghiệm, nâng cao năng lực chẩn đoán và theo dõi bệnh. Thời gian đào tạo: 3-6 tháng.

4. Nghiên cứu mở rộng đánh giá vai trò HBV RNA trong các nhóm bệnh nhân khác nhau và các phác đồ điều trị đa dạng: Tăng cường dữ liệu khoa học, hoàn thiện hướng dẫn lâm sàng về sử dụng dấu ấn HBV RNA. Chủ thể: các viện nghiên cứu, bệnh viện chuyên khoa, thời gian 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa gan mật: Nắm bắt kỹ thuật mới trong theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị VGBMT, từ đó cải thiện quyết định lâm sàng và tiên lượng bệnh nhân.

2. Nhân viên phòng xét nghiệm y học phân tử: Áp dụng quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA để nâng cao chất lượng xét nghiệm, giảm thiểu sai sót và tăng hiệu quả công việc.

3. Nhà nghiên cứu trong lĩnh vực vi sinh và di truyền học: Tham khảo phương pháp thiết kế primer, probe và tối ưu quy trình RT-qPCR, đồng thời phát triển các nghiên cứu tiếp theo về dấu ấn sinh học HBV RNA.

4. Các cơ quan quản lý y tế và công ty công nghệ sinh học: Đánh giá tiềm năng ứng dụng kỹ thuật mới trong chẩn đoán và theo dõi điều trị, từ đó xây dựng chính sách và phát triển sản phẩm phù hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần định lượng HBV RNA trong điều trị viêm gan B mạn tính?
   HBV RNA phản ánh hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan, giúp đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát, bổ sung cho việc theo dõi tải lượng HBV DNA.

2. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA có ưu điểm gì so với các phương pháp trước đây?
   Quy trình không cần bước xử lý DNase, giảm thời gian và bảo toàn chất lượng RNA, đồng thời có độ nhạy và đặc hiệu cao, phù hợp cho ứng dụng lâm sàng.

3. Tải lượng HBV RNA thay đổi như thế nào trong quá trình điều trị?
   Tải lượng HBV RNA giảm dần theo thời gian điều trị, nhưng giảm chậm hơn so với HBV DNA, phản ánh sự tồn tại dai dẳng của cccDNA và hoạt động phiên mã virus.

4. Liệu HBV RNA có thể thay thế hoàn toàn HBV DNA trong theo dõi điều trị không?
   HBV RNA không thay thế hoàn toàn HBV DNA mà nên được sử dụng bổ sung để cung cấp thông tin toàn diện hơn về hoạt động virus và hiệu quả điều trị.

5. Có thể áp dụng quy trình này ở các phòng xét nghiệm thông thường không?
   Với thiết bị RT-qPCR phổ biến và quy trình tối ưu, kỹ thuật có thể được triển khai rộng rãi sau đào tạo và chuẩn hóa, phù hợp với các phòng xét nghiệm y học phân tử hiện đại.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA trong mẫu huyết tương, không cần bước xử lý DNase, với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Tải lượng HBV RNA giảm dần trong quá trình điều trị VGBMT, tỷ lệ dương tính giảm từ 80% xuống còn 45% sau 6 tháng điều trị.
• Biến động HBV RNA liên quan mật thiết đến trạng thái HBeAg, phản ánh hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan.
• HBV RNA giảm chậm hơn HBV DNA, cho thấy vai trò quan trọng trong theo dõi hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát.
• Đề xuất áp dụng kỹ thuật này trong lâm sàng, phát triển bộ kit xét nghiệm và đào tạo nhân lực để nâng cao chất lượng quản lý bệnh viêm gan B mạn tính.

Tiếp theo, cần mở rộng nghiên cứu đa trung tâm và đa dạng nhóm bệnh nhân để hoàn thiện hướng dẫn sử dụng HBV RNA trong điều trị. Các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm được khuyến khích triển khai kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu AUG khác nhau [80]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein M và L-HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [13, 15, 94]. Hình 2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HBV [46]. Chu trình nhân lên của virus a.

Hấp phụ Quá trình hấp phụ là một quá trình quan trọng thể hiện rõ tính đặc trưng và biên độ của tế bào gan, được xác định bởi yêu cầu của các yếu tố phiên mã được làm giàu trong tế bào gan như đã nhắc đến ở phần trên và sự biểu hiện trong tế bào gan của người. Domain preS1 của protein vỏ L là yếu tố chính trong liên kết với thụ thể 11 trên tế bào gan [114]. Thụ thể được xác định có tên là NTCP (sodium taurocholate cotransporting polypeptide) [2]. Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng NTCP vốn có vai trò vận chuyển muối mật trong cơ thể được biểu hiện chính ở trong gan, và một số các chất chuyển xuyên màng, còn là một thụ thể cho quá trình hấp phụ HBV vào tế bào gan.

Quá trình gây nhiễm của HBV có thể bị ức chế trong tế bào gan của người bằng cách làm NTCP trở nên “im lặng” [114]. NTCP còn được biết đến với cái tên SLC10A1 (Solute carrier family 10A1) là một thành phần trong họ chất chuyển SLC10 [110]. NTCP thường khu trú ở màng đáy của tế bào gan và có vai trò chính trong vận chuyển muối mật từ hệ tuần hoàn vào gan [110]. L-HBsAg của virus liên kết đặc hiệu với thụ thể preS1 đặc hiệu với virus và bước này cần sự hoạt hóa của virus dẫn đến sự lộ ra đầu N-terminal của L-protein trên bề mặt virus [100].

Vùng từ aa thứ 2 đến aa thứ 48 của preS1 của protein L-HBs có vai trò chính trong quá trình phát triển nhiễm HBV [110, 114]. Gần đây, FTL (ferritin light chain) và kháng nguyên 1 của ung thư biểu mô tế bào vảy (SCCA1) đã được xác định là các đồng thụ thể tham gia vào quá trình hấp phụ của HBV vào tế bào gan [15]. Xâm nhập và loại bỏ vỏ virus Virus HBV có thể xâm nhập vào tế bào chủ bằng nhiều cơ chế khác nhau, bằng cả con đường nhập bào và hòa trộn màng tế bào của vỏ virus [100]. Sau khi liên kết với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào, virrion sẽ xâm nhập vào tế bào gan nhờ các yếu tố của tế bào vật chủ bằng con đường nhập bào [15].

Quá trình nhập bào của virus xảy ra thông qua trung gian Clathrin [28]. Capsid của virus cũng sẽ xâm nhập vào tế bào chất khi vỏ virus hòa trộn với màng tế bào sau khi nhập bào [3, 100]. Tuy nhiên, cơ chế loại bỏ vỏ virus và sự di chuyển của nucleocapsid đến lỗ nhân vẫn còn chưa được chứng minh. Những yếu tố vận chuyển như importin alpha và beta và nucleoporin 153 sẽ đảm bảo cho việc nucleocapsid được chuyển đến nhân tế bào [75, 81].

Sự phân tán của nucleocapsid dẫn tới sự giải phóng ra nhân sinh chất của rcDNA virus với polymerase được liên kết cộng hóa trị với rcDNA. Quá trình phiên mã/dịch mã Sau khi hệ gen rcDNA của virus được giải phóng vào nhân của tế bào gan, enzyme polymerase của virus sẽ bắt đầu tiến hành quá trình sửa chữa nhằm hoàn thành sợi dương chưa được tổng hợp đầy đủ của virus HBV. Enzyme này nằm ở đầu 5’ sợi âm được sử dụng cho quá trình tổng hợp sợi dương. Một đoạn RNA ngắn có chức năng như một đoạn mồi cũng là một thành phần tham gia vào quá trình tổng hợp sợi dương.

Hai thành phần này sau khi tổng hợp sẽ bị các enzyme của tế bào chủ loại bỏ ví dụ như proteinase [100]. Một khi quá trình tổng hợp sợi dương hoàn thành, nó sẽ đi cùng với sợi âm và được liên kết bởi liên kết cộng hóa trị ở hai đầu và hình thành nên cấu trúc siêu xoắn dạng vòng [120]. DNA này còn được gọi là cccDNA (closed convalent ciruclar DNA). Các phân tử cccDNA có chứa protein giống và không giống histone, và DNA có cấu trúc giống như các hạt có cấu trúc như chất nhiễm sắc xếp hàng trên một cái dây.

Chúng được gọi là các tiểu nhiễm sắc thể được sử dụng làm khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các mRNA của virus [13, 100]. Sự xuất hiện của cccDNA trong tế bào gan bị nhiễm giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì tình trạng mạn tính của nhiễm HBV hay sự tái phát của bệnh. Sau khi rcDNA được tổng hợp hoàn toàn và tồn tại trong nhân ở dạng cccDNA, cccDNA sẽ sử dụng tất cả cơ chế phiên mã của tế bào (enzyme RNA polymerase II) để tạo ra các protein để thực hiện tất cả các quá trình cần thiết cho virus như sinh tổng hợp và nhân lên của hệ gen virus. Quá trình phiên mã được điều hòa bởi các yếu tố phiên mã của tế bào vật chủ (CREB, STAT1, STAT2,.), enzyme biến đổi chất nhiễm sắc (PCAF, HDAC1,.), các yếu tố nhân của tế bào gan, và các yếu tố của virus như protein lõi, protein điều hòa X [100, 120].

Các yếu tố này góp phần điều hòa biểu hiện gen của virus bằng cách tương tác với promoter của 4 vùng ORF chính trong hệ gen virus [100]. Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng quá trình phiên mã được điều hòa bởi các cơ chế biến đổi di truyền ngoại gen (epigenetic) như methyl hóa cccDNA, acetyl hóa histone,. Sau khi tổng hợp ra các sản phẩm phiên mã là các mRNA (cùng pgRNA) có chiều dài khác nhau, chúng sẽ được vận chuyển ra tế bào chất để dịch mã ra các protein cần thiết cho virus như đã miêu tả ở phần trên. Quá trình đóng gói PgRNA ngoài chức năng làm mạch khuôn cho tổng hợp protein lõi và polymerase còn được sử dụng làm khuôn trong tổng hợp DNA qua quá trình phiên mã ngược.

RNA này sẽ có chiều dài dài hơn hệ gen của virus do có một đoạn trình tự thừa R (redundant) dư ở hai đầu trình tự dẫn đến quá trình đọc sẽ vượt qua điểm khởi đầu phiên mã khoảng 120 nu và kết thúc với đuôi poly-A. Đoạn dư này có chứa hai bản bản sao của DR1 (direct repeat 1) và ở đầu 5’ có một tín hiệu “ε” rất chuyên biệt cho HBV để khởi phát quá trình bao bọc (encapsidation) cấu trúc pgRNA và enzyme polymerase bằng các protein capsid [41, 88]. Quá trình đóng gói pgRNA vào nucleocapsid là bước tiếp theo trong chu trình của virus và bao gồm một chuỗi các cơ chế sử dụng các tác nhân của cả virus và tế bào vật chủ. Polymerase có ba vùng chức năng, mỗi vùng tương ứng với các chức năng liên kết với mồi của DNA, phiên mã ngược (rt) và phân hủy pgRNA (RNase H).

Terminal protein được phân chia từ vùng rt bằng vùng đệm vẫn chưa rõ chức năng. Polymerase liên kết với tín hiệu “ε” ở đầu 5’ của pgRNA, một cơ chế bao gồm sự kích hoạt quá trình đóng gói của phức hợp được tạo thành bởi protein lõi. Trình tự C-terminus của protein lõi, như được đề cập ở trên là vùng giàu arginine và phosphoryl hóa các aa, cũng liên quan đến quá trình liên kết của pgRNA do quá trình đóng gói được kích hoạt. Protein lõi còn liên quan đến sự khởi đầu quá trình phiên mã ngược, đóng gói nucleocapsid [121].

Bước tiếp theo là quá trình tổng hợp vật chất di truyền của virus được thực hiện trong nucleocapsid. Cấu trúc “ε” có một cấu trúc đặc biệt giúp tổng hợp đoạn mồi bao gồm 4 nu [63], được liên kết cộng hóa trị với vùng TP của polymerase thông qua liên kết phosphodiester giữa dTTP và nhóm hydroxyl của aa tyrosine trên terminal protein (vị trí 63) [111, 123]. Phức hợp mồi - polymerase sẽ được dịch chuyển đến đầu 5’ của pgRNA, nơi mà phức hợp này sẽ lai với vùng DR1 với trình tự mồi tương đồng. Quá trình dịch chuyển đến đúng vị trí, như trường hợp này DR1 nằm ở đầu 3’ của pgRNA, được hỗ trợ bởi hai thành phần ω và φ, hai thành phần này sẽ tương tác với tín hiệu ε [90].

Quá trình tổng hợp sợi âm được khởi đầu bằng quá 14 trình phiên mã ngược ở đầu 5’ của pgRNA, có đoạn thừa khoảng 10 nu. Mạch khuôn RNA cùng lúc đó sẽ bị hoạt tính của RNase H phân hủy dần, ngoại trừ 11-16 nu cuối cùng sẽ được chuyển sang vùng DR1 của đầu 5’ của pgRNA. Đoạn ribonucleic này sẽ được sử dụng là đoạn mồi cho quá trình tổng hợp sợi dương cho hệ gen virus [25]. Đoạn mồi này sẽ lai với trình tự tương đồng trên DR2 ở đầu 5’ của sợi âm mới tổng hợp và một quá trình chuyển dịch mới được diễn ra.

Sợi dương mới được tổng hợp sẽ được tiếp tục cho đến đầu 5’ của sợi âm DNA. Quá trình tổng hợp cả hai sợi DNA xảy ra trong nucleocapsid và quá trình này được tạo điều kiện bởi lỗ trên các capsid cho phép các nucleotide di chuyển vào trong. Tuy nhiên, một khi nucleocapsid trưởng thành được nảy chồi qua màng ER, nguồn nucleotide trong capsid sẽ bị cạn kiệt và để lại sợi dương có chiều dài không hoàn chỉnh, đó là nguyên nhân tạo nên hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh của virus HBV [61]. Tạo hạt virus hoàn chỉnh Nucleocapsid hoàn chỉnh là các nucleocapsid có chứa rcDNA với một phần sợi đôi mới được tổng hợp với enzyme polymerase gắn vào đầu 5’ của DNA sợi âm.

Sau khi hoàn thành, nucleocapsid này sẽ được di chuyển theo hai con đường. Trước khi đạt được lượng HBsAg đủ để gây nhiễm, các nucleocapsid sẽ được đưa trở lại nhân để làm giàu lượng cccDNA có trong nhân [45, 72]. Ở giai đoạn cuối của biến đổi hình thái, virion sẽ nảy chồi qua màng ER nơi protein HBsAg đã khu trú sẵn trong lumen [17]. Một yếu tố quyết định của những quá trình này đó chính là sự biến đổi hình thái và sắp xếp lại cấu trúc của L-HBsAg.

Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy một nửa protein này nằm ở phía trong tế bào chất của ER với đầu N-terminus, từ đó liên kết với nucleocapsid để nảy chồi. L-HBsAg với đầu tận cùng nằm trong lumen cho phép protein này hiện diện trên bề mặt của virion và do đó virus có thể dễ dàng tiếp cận thụ thể NTCP trong quá trình xâm nhập vào tế bào gan [5]. Quá trình giải phóng virus Giả thiết cho rằng protein HBsAg tích tụ trong khoảng trung gian giữa ER - phức hệ Golgi, virion sẽ được tích tụ trong lumen và theo con đường bài tiết trong 15 suốt quá trình thoát ra của tế bào, giống như con đường mà các tiểu thể của virus được giải phóng.