Xây dựng quy trình khuếch đại chọn lọc HBV RNA trong mẫu huyết tương nhằm đánh giá biến động tải lượng HBV RNA ở bệnh nhân viêm gan mạn tính

• Tác giả: Vũ Nguyễn Quỳnh Anh
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQGHN
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xây Dựng Quy Trình Khuếch Đại Chọn Lọc HBV RNA Trong Mẫu Huyết Tương Nhằm Đánh Giá Biến Động Tải Lượng HBV RNA Ở Bệnh Nhân Viêm Gan Mạn Tính
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: Năm 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ. TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan viêm gan B mạn tính
• 1.2. Dịch tễ học
• 1.3. Chẩn đoán viêm gan B mạn tính
• 1.4. Điều trị viêm gan B mạn tính và những thách thức
• 1.5. Đặc điểm sinh học của virus viêm gan B
• 1.5.1. Phân loại học
• 1.5.2. Cấu trúc của hạt virus HBV
• 1.5.3. Cấu trúc của hệ gen virus
• 1.5.4. Chu trình nhân lên của virus
• 1.5.5. Đường lây nhiễm của virus HBV
• 1.6. Ý nghĩa dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT
• 1.6.1. Phát hiện dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT
• 1.6.2. Nguồn gốc của HBV RNA huyết tương
• 1.6.3. Ý nghĩa của dấu ấn HBV RNA huyết tương
• 1.6.4. Các nghiên cứu trên thế giới về HBV RNA
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu, vật liệu và hóa chất nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng tham gia nghiên cứu
• 2.1.2. Vật liệu, hóa chất
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu
• 2.2.2. Thiết kế trình tự primer và probe cho quy trình định lượng HBV RNA
• 2.2.3. Tổng hợp chứng dương HBV RNA in-vitro
• 2.2.4. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA huyết tương
• 2.2.5. Phân tích, xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA
• 3.1.1. Tối ưu nồng độ mồi
• 3.1.2. Tối ưu nồng độ probe
• 3.1.3. Tối ưu nồng độ chất phụ gia
• 3.1.4. Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược
• 3.1.5. Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược
• 3.1.6. Tối ưu thể tích mẫu
• 3.1.7. Thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA
• 3.1.7.1. Quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA tối ưu
• 3.1.7.2. Xây dựng đường chuẩn quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA
• 3.1.7.3. Xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA
• 3.1.7.4. Đánh giá cặp mồi định lượng HBV RNA
• 3.2. Phân tích biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân VGBMT
• 3.2.1. Mô tả đặc điểm của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu
• 3.2.2. Biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân ở các thời điểm điều trị khác nhau
• 3.2.3. Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau
• 3.2.4. Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến thanh thải HBeAg ở tháng thứ 6 ở các thời điểm điều trị khác nhau
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Viêm Gan B Mạn Tính Cập Nhật Mới Nhất

Viêm gan B mạn tính (VGBMT) là vấn đề sức khỏe toàn cầu, đặc biệt ở châu Á. Bệnh do virus viêm gan B (HBV) gây ra, với tỷ lệ nhiễm và tử vong cao. Hơn 40% người nhiễm HBV mạn tính gặp biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư gan. Việc điều trị bằng thuốc kháng virus nucleot(s)ide (NA) gặp nhiều khó khăn do cccDNA tồn tại dai dẳng trong tế bào gan. Điều trị kéo dài với NA có thể gây đột biến kháng thuốc và nguy cơ tổn thương gan. Do đó, việc đánh giá cccDNA rất quan trọng để xác định thời điểm dừng điều trị và hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, đánh giá cccDNA đòi hỏi sinh thiết gan, gây khó khăn trong thực tế. HBV RNA, được phát hiện từ năm 1996, là dấu ấn sinh học hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA để đánh giá biến động tải lượng virus ở bệnh nhân VGBMT, khắc phục nhược điểm của các quy trình trước đây cần DNase để loại bỏ DNA.

1.1. Dịch Tễ Học Viêm Gan B Mạn Tính Số Liệu Thống Kê

Ước tính có khoảng hai tỷ người từng nhiễm HBV, trong đó 296 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính. Tỷ lệ dương tính HBsAg là 3.6%, thay đổi theo khu vực địa lý. Các khu vực có tỉ lệ lưu hành thấp (dưới 2%) phân bố ở các các khu vực như Bắc Mỹ và Tây Âu; các nước có tỷ lệ trung bình (2-7%) như các nước ở Địa Trung Hải, Đông Âu, Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%) là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan và Đông Á. Việt Nam nằm trong nhóm có tỷ lệ nhiễm HBV cao, 10-20% dân số. Số ca tử vong do xơ gan và ung thư gan liên quan đến VGBMT tăng 33% giai đoạn 1990-2013, với hơn 686.000 ca năm 2013 trên toàn cầu. Tỷ lệ tiến triển sang mạn tính cao nhất ở trẻ sơ sinh (90%), giảm dần ở trẻ em và người lớn. Các nghiên cứu mô hình đã dự đoán đến năm 2025, nước ta sẽ có khoảng 8 triệu trường hợp nhiễm viêm gan B mạn tính và khoảng 58.600 ca ung thư gan có liên quan đến HBV, và ước tính tỉ lệ tử vong hàng năm liên quan đến HBV là 40.

1.2. Chẩn Đoán Viêm Gan B Mạn Tính Dấu Ấn Virus Học Quan Trọng

Chẩn đoán viêm gan B mạn tính dựa trên đặc điểm sinh hóa, virus học, mô học và loại trừ các nguyên nhân khác. Các xét nghiệm chức năng gan, huyết thanh (HBsAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe) được thực hiện để đánh giá giai đoạn bệnh. Nồng độ HBV DNA được theo dõi để đánh giá tiến triển bệnh và hiệu quả điều trị. Sinh thiết gan giúp xác định giai đoạn xơ hóa và tình trạng viêm hoại tử gan. Theo Quyết định 3310/QĐ-BYT, VGBMT được xác định khi HBsAg và/hoặc HBV DNA dương tính ≥ 6 tháng, hoặc HBsAg dương tính và anti-HBc IgM âm tính. Chẩn đoán chính xác là rất quan trọng cho theo dõi và tiên lượng.

II. Thách Thức Điều Trị Viêm Gan B Cần Giải Pháp Mới

Mục tiêu điều trị viêm gan B mạn tính là ức chế nhân lên của HBV, cải thiện chức năng gan, ngăn ngừa xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Các thuốc điều trị hiện nay như interferon-α (IFN-α), lamivudine và adefovir giúp đạt được đáp ứng điều trị (HBV DNA không phát hiện, HBeAg âm tính, cải thiện chức năng gan). Quyết định 3310/QĐ-BYT chỉ dẫn nguyên tắc điều trị: ưu tiên thuốc uống nucleot(s)ide analogues (NA), điều trị lâu dài, tuân thủ điều trị. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất là không thể chữa khỏi hoàn toàn do cccDNA tồn tại trong tế bào gan. Thuốc kháng virus chỉ giảm tổn thương gan, không loại bỏ cccDNA hoàn toàn. Do đó, bệnh nhân thường phải điều trị suốt đời.

2.1. Kháng Thuốc và Tái Phát Vấn Đề Nhức Nhối Khi Điều Trị HBV

Điều trị kháng virus kéo dài có thể dẫn đến kháng thuốc. Mặc dù chuyển đảo huyết thanh HBeAg và ức chế HBV DNA được coi là thời điểm dừng thuốc, tỷ lệ tái phát cao (90%). Thanh thải HBsAg được coi là thời điểm dừng thuốc lý tưởng, nhưng tỉ lệ đạt được thấp khi dùng thuốc đơn lẻ. Chính vì vậy, việc nghiên cứu một phác đồ điều trị lý tưởng hoặc tìm ra những dấu ấn sinh học mới có thể xác định chính xác và hiệu quả thời điểm ngừng thuốc an toàn là vô cùng cần thiết trong quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính. Do đó, cần nghiên cứu các dấu ấn sinh học mới để xác định thời điểm ngừng thuốc an toàn và hiệu quả.

2.2. Vai Trò của cccDNA Tại Sao HBV Khó Chữa Khỏi Hoàn Toàn

cccDNA là dạng genome DNA của virus, tồn tại trong tế bào gan và là khuôn mẫu cho quá trình phiên mã các gen của virus. Các loại thuốc kháng virus đang được áp dụng điều trị hiện nay đều chỉ có thể làm giảm tổn thương gan và ngăn ngừa các diễn tiến nghiêm trọng hơn của bệnh gan chứ không hoàn toàn loại bỏ cccDNA, nên viêm gan B mạn tính thường không được chữa khỏi hoàn toàn và bệnh nhân thường điều trị suốt đời.

III. HBV RNA Định Lượng Dấu Ấn Sinh Học Tiềm Năng Mới

HBV RNA được phát hiện trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Nghiên cứu chỉ ra rằng HBV RNA có thể có ý nghĩa trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT. Vai trò của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ và hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan sẽ được phản ánh bởi nồng độ RNA của HBV (HBV RNA). Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV RNA là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT.

3.1. Ý nghĩa của HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT

Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV RNA là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT

3.2. Nguồn gốc của HBV RNA huyết tương

Vai trò của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ và hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan sẽ được phản ánh bởi nồng độ RNA của HBV (HBV RNA).

IV. Phương Pháp Khuếch Đại Chọn Lọc HBV RNA Tối Ưu Quy Trình

Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển và tối ưu hóa một quy trình khuếch đại chọn lọc HBV RNA mới để định lượng chính xác tải lượng virus ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Điểm khác biệt của quy trình này là loại bỏ sự cần thiết của DNase trong quá trình tách chiết RNA, giảm thời gian xử lý mẫu và bảo toàn chất lượng RNA tốt hơn. Qua đó cải thiện độ chính xác và hiệu quả của xét nghiệm.

4.1. Thiết kế Primer và Probe Đặc Hiệu cho HBV RNA

Quy trình xây dựng primer và probe cần được thiết kế đặc hiệu để phát hiện RNA của virus viêm gan B (HBV), đồng thời tránh phản ứng chéo với các loại RNA khác. Việc chọn lọc kỹ lưỡng các primer và probe này đảm bảo tính chính xác và độ nhạy của xét nghiệm định lượng HBV RNA.

4.2. Tối Ưu Hóa Các Thông Số RT qPCR Để Định Lượng HBV RNA

Cần tối ưu hóa nồng độ mồi, nồng độ probe, nồng độ chất phụ gia, nhiệt độ bước phiên mã ngược và thời gian bước phiên mã ngược, thể tích mẫu để thực hiện RT-qPCR định lượng HBV RNA hiệu quả, đảm bảo quá trình phiên mã ngược diễn ra hiệu quả và phản ứng qPCR được thực hiện tối ưu.

4.3. Xây dựng đường chuẩn quy trình RT qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA

Quy trình này giúp xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA, Đảm bảo quá trình xây dựng đường chuẩn được hiệu quả, nhằm tăng tính chính xác của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA

V. Phân Tích Biến Động Tải Lượng HBV RNA Kết Quả Nghiên Cứu

Nghiên cứu này tiến hành phân tích biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau. Tải lượng HBV RNA được đo lường ở các nhóm bệnh nhân khác nhau theo các mốc thời gian khác nhau trong quá trình điều trị, điều này cho phép đánh giá hiệu quả điều trị.

5.1. Biến động tỉ lệ dương tính của HBV RNA liên quan đến HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau

Kết quả nghiên cứu sẽ giúp làm sáng tỏ mối liên hệ giữa biến động tải lượng HBV RNA và HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về sự thay đổi virus học và đáp ứng điều trị ở bệnh nhân viêm gan B.

5.2. Biến động tỉ lệ dương tính của HBV RNA liên quan đến thanh thải HBeAg ở tháng thứ 6 ở các thời điểm điều trị khác nhau

Qua việc phân tích dữ liệu, nghiên cứu này có thể cung cấp thông tin quan trọng về khả năng sử dụng HBV RNA để dự đoán thanh thải HBeAg và đánh giá hiệu quả điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

VI. Tiềm Năng Ứng Dụng của HBV RNA Trong Quản Lý HBV

Nghiên cứu này góp phần khẳng định tiềm năng của HBV RNA như một dấu ấn sinh học quan trọng trong quản lý viêm gan B mạn tính. Kết quả nghiên cứu có thể giúp cải thiện chiến lược điều trị, dự đoán đáp ứng điều trị và theo dõi bệnh nhân hiệu quả hơn.

6.1. HBV RNA giúp cá thể hóa điều trị và nâng cao hiệu quả

Thông qua việc theo dõi tải lượng HBV RNA, các bác sĩ có thể đưa ra quyết định điều trị phù hợp với từng bệnh nhân, từ đó tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn.

6.2. Nghiên cứu sâu hơn về HBV RNA và vai trò của nó trong viêm gan B

Nghiên cứu sâu hơn về HBV RNA có thể giúp khám phá các cơ chế bệnh sinh mới và phát triển các phương pháp điều trị tiên tiến hơn cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Tổng quan nghiên cứu

Viêm gan B mạn tính (VGBMT) là một trong những vấn đề y tế toàn cầu nghiêm trọng, với khoảng 296 triệu người mắc trên toàn thế giới theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Tỷ lệ nhiễm HBsAg trung bình toàn cầu là 3,6%, trong đó khu vực Đông Á và Việt Nam có tỷ lệ cao, lên đến 10-20% trong dân số chung và có thể lên tới 31-54% ở các vùng nguy cơ cao. VGBMT là nguyên nhân hàng đầu gây xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), với hơn 686.000 ca tử vong liên quan đến các biến chứng này trong năm 2013. Việc điều trị VGBMT hiện nay chủ yếu dựa trên thuốc kháng virus đồng đẳng nucleot(s)ide analogues (NA) như entecavir và tenofovir, tuy nhiên hiệu quả điều trị còn hạn chế do sự tồn tại dai dẳng của cccDNA trong tế bào gan, khiến bệnh nhân phải điều trị kéo dài và có nguy cơ kháng thuốc.

Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình khuếch đại chọn lọc HBV RNA trong mẫu huyết tương để đánh giá biến động tải lượng HBV RNA ở bệnh nhân VGBMT. Mục tiêu cụ thể là thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA không cần bước xử lý DNase, từ đó đánh giá biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân trước và trong quá trình điều trị. Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Quân Y 103, Hà Nội, trong năm 2022, với ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp dấu ấn sinh học mới giúp theo dõi hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh nhân VGBMT.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Sinh học phân tử virus HBV: HBV là virus thuộc họ Hepadnaviridae, có hệ gen DNA sợi đôi không khép kín (rcDNA) dài khoảng 3,2 kb, mã hóa cho 4 khung đọc mở (ORF) chồng lên nhau, bao gồm các gen mã hóa protein vỏ, polymerase, kháng nguyên lõi (HBcAg) và kháng nguyên e (HBeAg). cccDNA tồn tại trong nhân tế bào gan là khuôn mẫu phiên mã cho các RNA virus, trong đó có pregenomic RNA (pgRNA) – mạch khuôn cho tổng hợp DNA virus.

• Vai trò của HBV RNA huyết tương: HBV RNA, đặc biệt là pgRNA, được phát hiện trong huyết tương bệnh nhân VGBMT và được xem là dấu ấn sinh học tiềm năng phản ánh hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan. HBV RNA có thể tồn tại trong các virion chưa trưởng thành và có thể được định lượng bằng kỹ thuật RT-qPCR để theo dõi biến động tải lượng virus trong quá trình điều trị.

• Mô hình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA: Phương pháp RT-qPCR kết hợp bước phiên mã ngược giúp khuếch đại và định lượng chính xác HBV RNA trong mẫu huyết tương, với thiết kế cặp primer và probe đặc hiệu vùng gen S bảo tồn của HBV, tránh nhiễm DNA virus và không cần bước xử lý DNase.

Các khái niệm chính bao gồm: cccDNA, pgRNA, RT-qPCR, tải lượng HBV RNA, HBeAg, và thuốc kháng virus NA.

Phương pháp nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: 115 bệnh nhân VGBMT được chẩn đoán theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Gan mật Mỹ 2009, thu thập mẫu huyết tương trước điều trị, sau 3 tháng (49 mẫu) và 6 tháng (46 mẫu) điều trị tại Bệnh viện Quân Y 103. Nhóm chứng gồm 50 người khỏe mạnh không nhiễm HBV.

• Vật liệu và hóa chất: Sử dụng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit để tách chiết RNA từ 500 µL huyết tương, enzyme phiên mã ngược WarmStart® RTx Reverse Transcriptase, primer và probe thiết kế đặc hiệu vùng gen S của HBV.

• Thiết kế primer và probe: Dựa trên trình tự gen S vùng N-terminal bảo tồn, cặp primer được thiết kế để khuếch đại chọn lọc HBV RNA, tránh khuếch đại DNA virus, không cần xử lý DNase.

• Quy trình RT-qPCR: Tối ưu các thành phần phản ứng (mồi 0,5 µM, probe 0,2 µM), nhiệt độ phiên mã ngược 50°C trong 10 phút, thể tích mẫu RNA 10 µL, chu trình PCR gồm 45 vòng với biến tính 94°C, gắn mồi 63°C, kéo dài 72°C.

• Phân tích số liệu: Tải lượng HBV RNA được tính theo công thức chuẩn, quy đổi log10 bản sao/mL, phân tích thống kê bằng kiểm định Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis và Chi-square với mức ý nghĩa p < 0,05.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân tích trong năm 2022, theo dõi biến động tải lượng HBV RNA ở các thời điểm trước điều trị, 3 tháng và 6 tháng điều trị.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA thành công: Quy trình không cần bước xử lý DNase, với nồng độ mồi 0,5 µM và probe 0,2 µM, nhiệt độ phiên mã ngược 50°C trong 10 phút, thể tích mẫu 10 µL cho hiệu suất khuếch đại cao và độ đặc hiệu tốt. Đường chuẩn tuyến tính trong dải 10^1 đến 10^6 bản sao/µL với hệ số tương quan R² > 0,99.

2. Tỷ lệ dương tính HBV RNA ở bệnh nhân VGBMT trước điều trị là khoảng 80%, giảm còn 60% sau 3 tháng và 45% sau 6 tháng điều trị (Bảng 10). Tải lượng HBV RNA trung vị giảm từ 5,2 log10 bản sao/mL trước điều trị xuống còn 3,8 log10 bản sao/mL sau 6 tháng (p < 0,05).

3. Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến trạng thái HBeAg: Nhóm HBeAg dương tính có tỷ lệ dương tính HBV RNA cao hơn (90%) so với nhóm HBeAg âm tính (55%) trước điều trị. Tải lượng HBV RNA giảm nhanh hơn ở nhóm HBeAg dương tính trong 6 tháng điều trị (Bảng 14, 15).

4. Tốc độ suy giảm HBV RNA chậm hơn so với HBV DNA trong quá trình điều trị: Tốc độ suy giảm HBV RNA trung bình 0,25 log10 bản sao/mL/tháng, trong khi HBV DNA giảm 0,35 log10 bản sao/mL/tháng (Bảng 11, 12), cho thấy HBV RNA có thể là dấu ấn sinh học phản ánh hoạt động cccDNA bền vững hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA được thiết lập có độ nhạy và đặc hiệu cao, phù hợp để theo dõi biến động tải lượng HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT. Việc không cần bước xử lý DNase giúp rút ngắn thời gian và bảo toàn chất lượng RNA, nâng cao tính thực tiễn trong lâm sàng.

Tỷ lệ dương tính và tải lượng HBV RNA giảm dần theo thời gian điều trị phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, khẳng định HBV RNA là dấu ấn sinh học tiềm năng để đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát. Sự khác biệt về biến động HBV RNA giữa nhóm HBeAg dương tính và âm tính phản ánh vai trò của HBeAg trong hoạt động phiên mã và nhân lên virus.

So sánh với tải lượng HBV DNA, HBV RNA giảm chậm hơn, cho thấy HBV RNA có thể phản ánh hoạt động của cccDNA trong gan, điều mà HBV DNA không thể hiện đầy đủ do bị ức chế bởi thuốc NA. Dữ liệu này hỗ trợ việc sử dụng HBV RNA như một chỉ số bổ sung trong quản lý điều trị VGBMT.

Các biểu đồ biểu diễn biến động tải lượng HBV RNA và HBV DNA theo thời gian điều trị, phân nhóm theo trạng thái HBeAg sẽ minh họa rõ nét sự khác biệt và xu hướng giảm tải lượng virus, giúp bác sĩ lâm sàng đưa ra quyết định điều trị chính xác hơn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA trong theo dõi điều trị VGBMT: Khuyến nghị các cơ sở y tế triển khai kỹ thuật này để đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát, giúp tối ưu hóa phác đồ điều trị. Thời gian thực hiện: trong vòng 6-12 tháng.

2. Phát triển bộ kit xét nghiệm thương mại dựa trên quy trình đã thiết lập: Hỗ trợ chuẩn hóa và mở rộng ứng dụng trong các bệnh viện và phòng xét nghiệm trên toàn quốc. Chủ thể thực hiện: các công ty công nghệ sinh học, thời gian 1-2 năm.

3. Đào tạo nhân viên y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm về kỹ thuật RT-qPCR HBV RNA: Đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả xét nghiệm, nâng cao năng lực chẩn đoán và theo dõi bệnh. Thời gian đào tạo: 3-6 tháng.

4. Nghiên cứu mở rộng đánh giá vai trò HBV RNA trong các nhóm bệnh nhân khác nhau và các phác đồ điều trị đa dạng: Tăng cường dữ liệu khoa học, hoàn thiện hướng dẫn lâm sàng về sử dụng dấu ấn HBV RNA. Chủ thể: các viện nghiên cứu, bệnh viện chuyên khoa, thời gian 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa gan mật: Nắm bắt kỹ thuật mới trong theo dõi và đánh giá hiệu quả điều trị VGBMT, từ đó cải thiện quyết định lâm sàng và tiên lượng bệnh nhân.

2. Nhân viên phòng xét nghiệm y học phân tử: Áp dụng quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA để nâng cao chất lượng xét nghiệm, giảm thiểu sai sót và tăng hiệu quả công việc.

3. Nhà nghiên cứu trong lĩnh vực vi sinh và di truyền học: Tham khảo phương pháp thiết kế primer, probe và tối ưu quy trình RT-qPCR, đồng thời phát triển các nghiên cứu tiếp theo về dấu ấn sinh học HBV RNA.

4. Các cơ quan quản lý y tế và công ty công nghệ sinh học: Đánh giá tiềm năng ứng dụng kỹ thuật mới trong chẩn đoán và theo dõi điều trị, từ đó xây dựng chính sách và phát triển sản phẩm phù hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần định lượng HBV RNA trong điều trị viêm gan B mạn tính?
   HBV RNA phản ánh hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan, giúp đánh giá hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát, bổ sung cho việc theo dõi tải lượng HBV DNA.

2. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA có ưu điểm gì so với các phương pháp trước đây?
   Quy trình không cần bước xử lý DNase, giảm thời gian và bảo toàn chất lượng RNA, đồng thời có độ nhạy và đặc hiệu cao, phù hợp cho ứng dụng lâm sàng.

3. Tải lượng HBV RNA thay đổi như thế nào trong quá trình điều trị?
   Tải lượng HBV RNA giảm dần theo thời gian điều trị, nhưng giảm chậm hơn so với HBV DNA, phản ánh sự tồn tại dai dẳng của cccDNA và hoạt động phiên mã virus.

4. Liệu HBV RNA có thể thay thế hoàn toàn HBV DNA trong theo dõi điều trị không?
   HBV RNA không thay thế hoàn toàn HBV DNA mà nên được sử dụng bổ sung để cung cấp thông tin toàn diện hơn về hoạt động virus và hiệu quả điều trị.

5. Có thể áp dụng quy trình này ở các phòng xét nghiệm thông thường không?
   Với thiết bị RT-qPCR phổ biến và quy trình tối ưu, kỹ thuật có thể được triển khai rộng rãi sau đào tạo và chuẩn hóa, phù hợp với các phòng xét nghiệm y học phân tử hiện đại.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA trong mẫu huyết tương, không cần bước xử lý DNase, với độ nhạy và đặc hiệu cao.
• Tải lượng HBV RNA giảm dần trong quá trình điều trị VGBMT, tỷ lệ dương tính giảm từ 80% xuống còn 45% sau 6 tháng điều trị.
• Biến động HBV RNA liên quan mật thiết đến trạng thái HBeAg, phản ánh hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan.
• HBV RNA giảm chậm hơn HBV DNA, cho thấy vai trò quan trọng trong theo dõi hiệu quả điều trị và dự đoán tái phát.
• Đề xuất áp dụng kỹ thuật này trong lâm sàng, phát triển bộ kit xét nghiệm và đào tạo nhân lực để nâng cao chất lượng quản lý bệnh viêm gan B mạn tính.

Tiếp theo, cần mở rộng nghiên cứu đa trung tâm và đa dạng nhóm bệnh nhân để hoàn thiện hướng dẫn sử dụng HBV RNA trong điều trị. Các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm được khuyến khích triển khai kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu quả quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính.