Nghiên Cứu Quy Trình Định Lượng Flavonoid Trong Cây Nhân Trần Tía

• Tác giả: Nguyễn Nhựt Minh
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Ngọc Quỳnh
• Trường học: Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Định Lượng Flavonoid Trong Cây Nhân Trần Tía
• Loại tài liệu: luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Cần Thơ

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TỔNG QUAN VỀ NHÂN TRẦN TÍA
• 2.1.1. Thực vật học
• 2.1.1.1. Tên khoa học và phân loại
• 2.1.1.2. Đặc điểm thực vật
• 2.1.1.3. Phân bố sinh thái
• 2.1.1.4. Bộ phận dùng và chế biến
• 2.1.2. Thành phần hóa học
• 2.1.2.1. Tinh dầu
• 2.1.2.2. Flavonoid
• 2.1.2.3. Các thành phần khác
• 2.1.3. Tác dụng sinh học
• 2.1.3.1. Tính chống oxy hóa
• 2.1.3.2. Tác dụng tăng tiết mật và bảo vệ gan
• 2.1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm
• 2.1.3.4. Độc tính
• 2.1.3.5. Công dụng
• 2.2. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID
• 3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG BẰNG HPLC
• 3.1. Tính tƣơng thích hệ thống
• 3.2. Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc
• 3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị
• 3.4. Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lƣợng (LOQ)
• 4. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
• 4.2. Mẫu nguyên liệu. Chất chuẩn đối chiếu
• 4.3. Dung môi, hóa chất
• 4.4. Trang thiết bị
• 4.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.5.1. Tinh khiết hóa các flavonoid làm chất đối chiếu
• 4.5.2. Khảo sát quy trình chiết xuất các flavonoid từ Nhân trần tía
• 4.5.3. Khảo sát các điều kiện để định lƣợng đồng thời các flavonoid bằng HPLC
• 4.5.4. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời các flavonoid bằng HPLC
• 4.5.5. Ứng dụng quy trình đã thẩm định để định lƣợng các flavonoid trong Nhân trần tía đƣợc thu hái ở 3 tỉnh ở các thời kỳ sinh trƣởng khác nhau
• 5. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU
• 5.1.1. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
• 5.1.2. Phƣơng pháp HPLC
• 5.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC FLAVONOID TỪ NHÂN TRẦN TÍA
• 5.2.1. Dung môi chiết
• 5.2.2. Thời gian chiết
• 5.2.3. Thể tích dung môi chiết
• 5.2.4. Số lần chiết
• 5.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC
• 5.3.1. Chuẩn bị mẫu thử
• 5.3.2. Thăm dò điều kiện sắc ký
• 5.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC
• 5.4.1. Tính tƣơng thích hệ thống
• 5.4.2. Tính đặc hiệu
• 5.4.3. Tính tuyến tính, LOD và LOQ
• 5.5. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG MỘT VÀI MẪU THU HÁI Ở CÁC TỈNH, Ở CÁC THỜI ĐIỂM SINH TRƢỞNG KHÁC NHAU
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Giới Thiệu Nghiên Cứu Định Lượng Flavonoid Nhân Trần Tía

Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) là một dược liệu quý, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Việt Nam. Flavonoid là một trong những thành phần hóa học quan trọng, đóng vai trò quyết định trong các tác dụng dược lý của cây, đặc biệt là khả năng bảo vệ gan và chống oxy hóa. Việc định lượng flavonoid trong Nhân trần tía là vô cùng cần thiết để đảm bảo chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu này. Hiện nay, việc kiểm soát chất lượng và hàm lượng các hoạt chất trong Nhân trần tía còn nhiều hạn chế, gây khó khăn trong việc chuẩn hóa quy trình sản xuất và đảm bảo hiệu quả điều trị. Theo Nguyễn Nhựt Minh (2015), việc xây dựng quy trình định lượng là cần thiết để góp phần đảm bảo chất lượng dược liệu.

1.1. Tầm quan trọng của Flavonoid trong Nhân Trần Tía

Flavonoid là nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên các tác dụng dược lý của Nhân trần tía. Định lượng flavonoid giúp xác định hàm lượng chính xác của các hoạt chất này trong dược liệu, từ đó đánh giá được chất lượng và hiệu quả sử dụng của Nhân trần tía. Hơn nữa, Flavonoid còn được biết đến với nhiều tác dụng dược lý quan trọng như chống oxy hóa, kháng viêm, bảo vệ gan và tăng cường hệ miễn dịch. Nghiên cứu của Lê Tùng Châu và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng Nhân trần tía chứa nhiều loại flavonoid khác nhau, góp phần vào tác dụng dược lý đa dạng của cây.

1.2. Mục tiêu và Ý nghĩa của Nghiên cứu Định lượng

Nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng và thẩm định quy trình định lượng flavonoid trong Nhân trần tía bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mục tiêu chính là phát triển một phương pháp chính xác, tin cậy và có thể áp dụng rộng rãi để kiểm soát chất lượng dược liệu Nhân trần tía. Ý nghĩa của đề tài nằm ở việc cung cấp một công cụ hữu ích cho việc chuẩn hóa quy trình sản xuất các chế phẩm từ Nhân trần tía, đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị cho người sử dụng. Kết quả nghiên cứu cũng sẽ đóng góp vào việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu Nhân trần tía trong Dược điển Việt Nam.

II. Thách Thức Trong Định Lượng Flavonoid Nhân Trần Tía

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc định lượng flavonoid trong Nhân trần tía gặp phải không ít thách thức. Sự phức tạp về thành phần hóa học, đặc biệt là sự đa dạng của các flavonoid và các hợp chất khác, đòi hỏi phải có phương pháp phân tích chọn lọc và chính xác. Hơn nữa, sự thay đổi về hàm lượng flavonoid do ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (thời vụ, địa điểm thu hái) cũng gây khó khăn trong việc chuẩn hóa quy trình. Các phương pháp chiết xuất và phân tích truyền thống có thể không đủ độ nhạy và độ đặc hiệu để định lượng chính xác các flavonoid trong Nhân trần tía. Việc thiếu các chất chuẩn đối chiếu cũng là một trở ngại lớn trong quá trình nghiên cứu và kiểm nghiệm.

2.1. Sự Phức Tạp của Thành Phần Hóa Học Nhân Trần Tía

Nhân trần tía chứa một hỗn hợp phức tạp các hợp chất hóa học, bao gồm flavonoid, tinh dầu, acid phenolic và các hợp chất khác. Sự hiện diện của nhiều hợp chất có cấu trúc tương tự có thể gây nhiễu trong quá trình định lượng flavonoid, đòi hỏi phải có phương pháp phân tích chọn lọc và độ phân giải cao. Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự (1999), việc phân lập và xác định các flavonoid trong Nhân trần tía đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp và tốn kém.

2.2. Ảnh Hưởng của Điều Kiện Môi Trường Đến Hàm Lượng Flavonoid

Hàm lượng flavonoid trong Nhân trần tía có thể thay đổi đáng kể tùy thuộc vào điều kiện môi trường, bao gồm thời vụ, địa điểm thu hái, điều kiện đất đai và khí hậu. Điều này gây khó khăn trong việc chuẩn hóa quy trình sản xuất và đảm bảo chất lượng ổn định của dược liệu. Do đó, cần phải tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hàm lượng flavonoid để lựa chọn thời điểm và địa điểm thu hái phù hợp.

2.3. Thiếu Chất Chuẩn Đối Chiếu Trong Định Lượng Flavonoid

Việc thiếu các chất chuẩn đối chiếu là một trở ngại lớn trong quá trình định lượng flavonoid trong Nhân trần tía. Chất chuẩn đối chiếu là các hợp chất tinh khiết đã được xác định cấu trúc và hàm lượng, được sử dụng để so sánh và định lượng các chất phân tích trong mẫu thử. Việc tự tổng hợp hoặc nhập khẩu chất chuẩn đối chiếu có thể tốn kém và mất thời gian. Vì vậy, cần phải tìm kiếm các nguồn cung cấp chất chuẩn đối chiếu đáng tin cậy hoặc phát triển quy trình phân lập và tinh chế chất chuẩn từ Nhân trần tía.

III. Phương Pháp HPLC Định Lượng Flavonoid Nhân Trần Tía

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích mạnh mẽ, được sử dụng rộng rãi để định lượng flavonoid trong nhiều loại dược liệu, bao gồm cả Nhân trần tía. Phương pháp HPLC có ưu điểm là độ nhạy cao, độ phân giải tốt, khả năng định lượng chính xác và có thể tự động hóa. Để định lượng flavonoid bằng HPLC, cần phải lựa chọn pha động, cột sắc ký, bước sóng phát hiện phù hợp và tối ưu hóa các điều kiện sắc ký để đạt được độ phân giải tốt và thời gian phân tích ngắn. Thẩm định quy trình HPLC là bước quan trọng để đảm bảo tính chính xác, tin cậy và phù hợp của phương pháp.

3.1. Nguyên Tắc và Ưu Điểm của Phương Pháp HPLC

Phương pháp HPLC dựa trên nguyên tắc phân tách các chất phân tích dựa trên ái lực khác nhau của chúng với pha tĩnh và pha động. Mẫu thử được hòa tan trong pha động và bơm qua cột sắc ký chứa pha tĩnh. Các chất phân tích sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào ái lực của chúng với pha tĩnh. Các chất phân tích được phát hiện bằng đầu dò (ví dụ, đầu dò UV-Vis, PDA) và được định lượng dựa trên diện tích pic trên sắc ký đồ. HPLC có nhiều ưu điểm so với các phương pháp phân tích khác, bao gồm độ nhạy cao, độ phân giải tốt, khả năng định lượng chính xác và có thể tự động hóa.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Sắc Ký HPLC cho Flavonoid

Để đạt được độ phân giải tốt và thời gian phân tích ngắn trong HPLC, cần phải tối ưu hóa các điều kiện sắc ký, bao gồm pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện. Pha động thường là hỗn hợp của dung môi hữu cơ (ví dụ, acetonitrile, methanol) và dung môi nước, có thể chứa các chất điều chỉnh pH (ví dụ, acid formic, acid acetic). Cột sắc ký thường là cột pha đảo (ví dụ, cột C18), có kích thước hạt nhỏ (ví dụ, 3-5 μm) để tăng hiệu quả phân tách. Bước sóng phát hiện được lựa chọn dựa trên phổ hấp thụ UV-Vis của các flavonoid cần phân tích.

IV. Quy Trình Chiết Xuất Flavonoid Từ Nhân Trần Tía Hiệu Quả

Quá trình chiết xuất đóng vai trò quan trọng trong việc thu nhận flavonoid từ Nhân trần tía trước khi tiến hành định lượng. Lựa chọn dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ chiết và tỉ lệ dược liệu/dung môi ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết xuất. Các phương pháp chiết xuất hiện đại như chiết xuất có hỗ trợ siêu âm hoặc chiết xuất bằng lò vi sóng có thể giúp tăng hiệu suất chiết và giảm thời gian chiết so với phương pháp chiết xuất truyền thống. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất là cần thiết để đảm bảo thu được lượng flavonoid tối đa từ dược liệu.

4.1. Lựa Chọn Dung Môi Chiết Xuất Flavonoid Tối Ưu

Dung môi chiết xuất đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất flavonoid từ Nhân trần tía. Các dung môi thường được sử dụng bao gồm methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate và nước. Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào độ phân cực của flavonoid cần chiết xuất và khả năng hòa tan của dung môi. Methanol và ethanol thường được sử dụng để chiết xuất các flavonoid phân cực, trong khi ethyl acetate được sử dụng để chiết xuất các flavonoid ít phân cực hơn. Việc sử dụng hỗn hợp dung môi có thể giúp tăng hiệu suất chiết xuất.

4.2. Tối Ưu Hóa Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Chiết Xuất Flavonoid

Ngoài dung môi, các yếu tố khác như thời gian chiết, nhiệt độ chiết, tỉ lệ dược liệu/dung môi và phương pháp chiết xuất cũng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất flavonoid từ Nhân trần tía. Thời gian chiết quá ngắn có thể không đủ để chiết xuất hết flavonoid, trong khi thời gian chiết quá dài có thể dẫn đến sự phân hủy của flavonoid. Nhiệt độ chiết cao có thể tăng hiệu suất chiết xuất, nhưng cũng có thể gây phân hủy flavonoid. Tỉ lệ dược liệu/dung môi tối ưu cần được xác định bằng thực nghiệm. Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm hoặc chiết xuất bằng lò vi sóng có thể giúp tăng hiệu suất chiết và giảm thời gian chiết.

V. Ứng Dụng Định Lượng Flavonoid Trong Kiểm Định Chất Lượng

Định lượng flavonoid trong Nhân trần tía có vai trò quan trọng trong việc kiểm định chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ Nhân trần tía. Hàm lượng flavonoid có thể được sử dụng làm chỉ số chất lượng để đánh giá độ tinh khiết, độ ổn định và hiệu quả điều trị của dược liệu. Kết quả định lượng cũng có thể được sử dụng để so sánh chất lượng của Nhân trần tía từ các nguồn khác nhau hoặc các lô sản xuất khác nhau. Việc kiểm định chất lượng bằng phương pháp định lượng flavonoid giúp đảm bảo an toàn và hiệu quả cho người sử dụng.

5.1. Tiêu Chuẩn Hóa Dược Liệu Nhân Trần Tía Dựa Trên Hàm Lượng Flavonoid

Hàm lượng flavonoid có thể được sử dụng để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu Nhân trần tía. Tiêu chuẩn này có thể bao gồm các chỉ tiêu về hàm lượng tổng flavonoid, hàm lượng các flavonoid cụ thể (ví dụ, isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid, isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid) và các chỉ tiêu khác về độ tinh khiết, độ ẩm và tạp chất. Tiêu chuẩn chất lượng giúp đảm bảo rằng dược liệu Nhân trần tía đáp ứng các yêu cầu về an toàn và hiệu quả.

5.2. Đảm Bảo An Toàn và Hiệu Quả của Chế Phẩm Nhân Trần Tía

Định lượng flavonoid giúp đảm bảo an toàn và hiệu quả của các chế phẩm từ Nhân trần tía, bao gồm viên nang, cao lỏng, trà và các sản phẩm khác. Hàm lượng flavonoid trong chế phẩm cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo rằng liều dùng đáp ứng yêu cầu về hiệu quả điều trị. Ngoài ra, cần phải kiểm tra sự ổn định của flavonoid trong chế phẩm trong quá trình bảo quản để đảm bảo rằng hàm lượng flavonoid không bị giảm sút theo thời gian.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Định Lượng Flavonoid

Nghiên cứu định lượng flavonoid trong Nhân trần tía bằng HPLC đã đạt được những kết quả đáng khích lệ, cung cấp một phương pháp phân tích chính xác và tin cậy để kiểm soát chất lượng dược liệu. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều hướng nghiên cứu có thể được tiếp tục để hoàn thiện quy trình định lượng, bao gồm việc phát triển các phương pháp chiết xuất xanh, sử dụng các cột sắc ký hiệu quả cao hơn và kết hợp với các kỹ thuật phân tích khối phổ để xác định chính xác các flavonoid trong Nhân trần tía. Các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý của từng flavonoid cụ thể cũng sẽ giúp nâng cao giá trị của Nhân trần tía trong y học.

6.1. Phát Triển Phương Pháp Chiết Xuất Xanh Flavonoid

Các phương pháp chiết xuất xanh sử dụng các dung môi ít độc hại và thân thiện với môi trường, như nước, ethanol hoặc CO2 siêu tới hạn. Các phương pháp này có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Chiết xuất có hỗ trợ enzym hoặc chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao là những ví dụ về các phương pháp chiết xuất xanh tiềm năng.

6.2. Nghiên Cứu Tác Dụng Dược Lý của Từng Flavonoid Cụ Thể

Mỗi flavonoid trong Nhân trần tía có thể có tác dụng dược lý khác nhau. Nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý của từng flavonoid cụ thể sẽ giúp xác định các hoạt chất chính chịu trách nhiệm cho tác dụng điều trị của Nhân trần tía và phát triển các chế phẩm có hiệu quả cao hơn. Các nghiên cứu này có thể sử dụng các mô hình in vitro, in vivo và thử nghiệm lâm sàng.

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh gan là một trong những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng toàn cầu với khoảng 800 triệu người mắc bệnh gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó viêm gan do virus chiếm tỷ lệ cao nhất. Tại Việt Nam, việc sử dụng dược liệu trong điều trị viêm gan ngày càng được quan tâm nhằm giảm chi phí và tác dụng phụ của thuốc tân dược. Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) là một dược liệu quý, được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền để hỗ trợ điều trị các bệnh về gan. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào tác dụng dược lý mà chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hàm lượng các hoạt chất chính trong cây, đặc biệt là flavonoid – nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh mẽ.

Mục tiêu của luận văn là xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid chính là isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid trong cây Nhân trần tía bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò dãy diod quang (PDA). Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu dược liệu thu hái từ ba tỉnh phía Nam Việt Nam ở các thời kỳ sinh trưởng khác nhau nhằm đánh giá sự biến động hàm lượng flavonoid theo điều kiện sinh trưởng.

Ý nghĩa của đề tài không chỉ bổ sung dữ liệu khoa học cho chuyên luận dược liệu trong Dược điển Việt Nam mà còn góp phần nâng cao chất lượng kiểm định dược liệu, đảm bảo an toàn và hiệu quả cho các chế phẩm từ Nhân trần tía, từ đó hỗ trợ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên hai lý thuyết chính: lý thuyết về flavonoid và lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

1. Lý thuyết về flavonoid: Flavonoid là nhóm hợp chất phenol thực vật có cấu trúc cơ bản diphenylpropan (C6-C3-C6), gồm các nhóm flavon, flavonol, flavanon, và flavanonol. Flavonoid có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng viêm và kháng khuẩn. Hai flavonoid chính nghiên cứu là isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid, có đặc điểm phổ UV-Vis đặc trưng với đỉnh hấp thu ở khoảng 328-330 nm và 273 nm.

2. Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): HPLC là phương pháp phân tích dựa trên sự phân bố chất phân tích giữa pha tĩnh (cột sắc ký) và pha động (dung môi). Đầu dò PDA cho phép thu phổ UV-Vis của các chất phân tích, giúp xác định tính đặc hiệu và độ tinh khiết của các pic sắc ký. Các thông số quan trọng gồm thời gian lưu (tR), hệ số dung lượng (k’), hệ số chọn lọc (α), độ phân giải (Rs), và hệ số bất đối (As).

Các khái niệm chuyên ngành được áp dụng gồm: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác (RSD), và độ đúng (tỷ lệ hồi phục).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu dược liệu Nhân trần tía được thu hái tại ba tỉnh Tây Ninh, Bình Dương và An Giang ở các thời kỳ sinh trưởng khác nhau (trước ra hoa, đang ra hoa, ra hoa đầy đủ). Chất chuẩn flavonoid được phân lập và tinh khiết hóa từ cây Nhân trần tía, xác định độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và HPLC.

• Phương pháp phân tích: Quy trình chiết xuất flavonoid sử dụng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm với dung môi methanol 100 ml, chiết 3 lần, mỗi lần 40 phút ở 60°C. Mẫu chiết được xử lý hóa học để tách flavonoid, sau đó phân tích bằng HPLC với cột LiChroCart RP C18, pha động acetonitril – acid phosphoric pH 2,5 (30:70), tốc độ dòng 1,4 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 254 nm.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2015, bao gồm các bước: thu thập mẫu, phân lập chất chuẩn, khảo sát điều kiện chiết xuất, xây dựng và thẩm định quy trình HPLC, ứng dụng quy trình định lượng trên mẫu thực địa.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Tổng cộng 9 mẫu dược liệu từ 3 tỉnh, mỗi mẫu phân tích 2 lần để đảm bảo độ tin cậy. Phương pháp chọn mẫu dựa trên đại diện các thời kỳ sinh trưởng và vùng phân bố chính của cây Nhân trần tía.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Độ tinh khiết của chất chuẩn: Hai flavonoid isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AD6) và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AD4) được xác định có độ tinh khiết lần lượt là 97,51% và 99,17% bằng phương pháp HPLC, đảm bảo chất lượng làm chuẩn đối chiếu.

2. Khảo sát quy trình chiết xuất: Methanol được chọn làm dung môi chiết tối ưu với hàm lượng chất chiết đạt 9,43%. Nhiệt độ chiết 60°C, thời gian 40 phút, thể tích dung môi 100 ml và số lần chiết 3 lần là điều kiện tối ưu cho hiệu suất chiết flavonoid cao nhất. Hàm lượng chất chiết tăng từ 6,99% (ethanol 75%) lên đến 15,05% khi tăng thể tích dung môi, thể hiện hiệu quả chiết xuất được cải thiện rõ rệt.

3. Thẩm định quy trình HPLC: Quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid đạt các tiêu chuẩn về tính tương thích hệ thống với RSD các thông số sắc ký dưới 2%, độ phân giải Rs ≥ 1,5, hệ số bất đối As trong khoảng 0,8 – 1,5. Tính đặc hiệu được chứng minh qua sắc ký đồ mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng và mẫu thử thêm chuẩn với độ tinh khiết pic trên 99%.

4. Tính tuyến tính và giới hạn phát hiện: Phương trình hồi quy của AD6 và AD4 có hệ số tương quan R² > 0,995 trong khoảng nồng độ 1-80 ppm, đảm bảo tính tuyến tính cao. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định tương ứng với tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) là 3 và 10 lần, phù hợp với yêu cầu phân tích.

5. Ứng dụng quy trình định lượng: Hàm lượng flavonoid trong mẫu Nhân trần tía thu hái tại Tây Ninh, Bình Dương và An Giang dao động từ khoảng 0,3 đến 1,5 mg/100g dược liệu tùy theo thời kỳ sinh trưởng. Mẫu thu hái khi cây ra hoa đầy đủ có hàm lượng flavonoid cao hơn 15-20% so với trước ra hoa, cho thấy thời điểm thu hái ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng dược liệu.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm với methanol là hiệu quả nhất trong việc thu nhận flavonoid từ Nhân trần tía, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về chiết xuất flavonoid từ dược liệu. Điều kiện chiết xuất được tối ưu giúp tăng hàm lượng flavonoid thu được, đồng thời đảm bảo tính kinh tế và khả năng áp dụng thực tế.

Quy trình HPLC xây dựng và thẩm định đạt các tiêu chuẩn quốc tế về độ chính xác, độ đúng và tính đặc hiệu, cho phép định lượng đồng thời hai flavonoid chính trong mẫu dược liệu. Việc sử dụng đầu dò PDA giúp kiểm soát độ tinh khiết của pic sắc ký, giảm thiểu sai số do tạp chất.

So sánh với các nghiên cứu flavonoid trong dược liệu khác, hàm lượng flavonoid trong Nhân trần tía tương đối ổn định và có sự biến động theo thời kỳ sinh trưởng, điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn thời điểm thu hái để đảm bảo chất lượng dược liệu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hàm lượng flavonoid theo thời kỳ sinh trưởng và địa điểm thu hái, cũng như bảng thống kê các thông số thẩm định quy trình HPLC để minh họa tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình chiết xuất và định lượng flavonoid trong kiểm định chất lượng dược liệu Nhân trần tía: Các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm dược liệu nên áp dụng quy trình chiết xuất bằng methanol 3 lần, mỗi lần 40 phút ở 60°C và phân tích bằng HPLC với điều kiện đã thẩm định để đảm bảo hàm lượng flavonoid đạt chuẩn. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng.

2. Khuyến khích thu hái Nhân trần tía vào thời kỳ ra hoa đầy đủ: Do hàm lượng flavonoid cao hơn 15-20% so với các thời kỳ khác, việc thu hái đúng thời điểm sẽ nâng cao hiệu quả điều trị và giá trị dược liệu. Chủ thể thực hiện: nông dân và doanh nghiệp thu mua dược liệu.

3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng flavonoid cho Nhân trần tía trong Dược điển Việt Nam: Dựa trên kết quả nghiên cứu, đề xuất bổ sung tiêu chuẩn định lượng flavonoid nhằm kiểm soát chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ Nhân trần tía. Thời gian thực hiện: 1-2 năm, chủ thể: cơ quan quản lý dược liệu.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ phân tích HPLC cho các phòng kiểm nghiệm dược liệu: Đảm bảo kỹ thuật viên có đủ năng lực vận hành và thẩm định quy trình phân tích flavonoid, nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng dược liệu. Chủ thể thực hiện: các trường đại học, viện nghiên cứu, phòng kiểm nghiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu dược liệu và hóa dược: Luận văn cung cấp quy trình phân tích flavonoid chuẩn xác, giúp nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Nhân trần tía cũng như các dược liệu tương tự.

2. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh dược liệu, thực phẩm chức năng: Tham khảo để áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng flavonoid trong nguyên liệu và sản phẩm, đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người tiêu dùng.

3. Cơ quan quản lý nhà nước về dược liệu và y dược cổ truyền: Sử dụng làm cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, quy định kiểm định dược liệu Nhân trần tía trong các văn bản pháp lý.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành Dược, Hóa phân tích: Tài liệu tham khảo thực tiễn về phương pháp phân tích HPLC, quy trình thẩm định và ứng dụng trong nghiên cứu dược liệu, giúp nâng cao kỹ năng nghiên cứu và phân tích.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn hai flavonoid isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid để định lượng?
   Hai flavonoid này là thành phần chính có hoạt tính sinh học nổi bật trong Nhân trần tía, có phổ UV đặc trưng và được phân lập tinh khiết, phù hợp làm chuẩn đối chiếu để đánh giá chất lượng dược liệu.

2. Phương pháp chiết xuất flavonoid có hỗ trợ siêu âm có ưu điểm gì?
   Phương pháp này giúp tăng hiệu suất chiết, rút ngắn thời gian, giảm lượng dung môi sử dụng và giữ được hoạt tính của flavonoid so với chiết truyền thống.

3. Làm thế nào để đảm bảo tính đặc hiệu của quy trình HPLC?
   Sử dụng đầu dò PDA để thu phổ UV-Vis của các pic sắc ký, so sánh với chuẩn, kiểm tra mẫu trắng và mẫu thử thêm chuẩn để loại trừ sự ảnh hưởng của tạp chất và xác nhận pic phân tích là duy nhất.

4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu?
   LOD được xác định tại nồng độ có tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) từ 2-3 lần, LOQ tại S/N bằng 10 lần, đảm bảo phát hiện và định lượng chính xác flavonoid trong mẫu dược liệu.

5. Tại sao thời điểm thu hái ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid?
   Flavonoid là hợp chất sinh tổng hợp trong cây, hàm lượng thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng do điều kiện môi trường và quá trình phát triển sinh học, thu hái đúng thời điểm giúp tối ưu hàm lượng hoạt chất.

Kết luận

• Đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid trong Nhân trần tía bằng HPLC với đầu dò PDA, đạt các tiêu chuẩn về tính đặc hiệu, tuyến tính, độ chính xác và độ đúng.
• Phương pháp chiết xuất flavonoid tối ưu là chiết có hỗ trợ siêu âm với methanol, 3 lần, mỗi lần 40 phút ở 60°C, thể tích dung môi 100 ml.
• Hàm lượng flavonoid trong Nhân trần tía biến động theo thời kỳ sinh trưởng và địa điểm thu hái, cao nhất khi cây ra hoa đầy đủ.
• Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung dữ liệu khoa học cho Dược điển Việt Nam và nâng cao chất lượng kiểm định dược liệu Nhân trần tía.
• Đề xuất áp dụng quy trình trong kiểm nghiệm dược liệu, xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và đào tạo kỹ thuật phân tích HPLC cho các phòng kiểm nghiệm.

Next steps: Triển khai áp dụng quy trình tại các phòng kiểm nghiệm, mở rộng nghiên cứu đánh giá các hoạt chất khác trong Nhân trần tía và phát triển sản phẩm dược liệu chất lượng cao.

Call to action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực dược liệu nên phối hợp để ứng dụng quy trình này nhằm nâng cao giá trị và hiệu quả của Nhân trần tía trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng.