Qui Trình Xây Dựng Bộ Gien Chloroplast: Nghiên Cứu Từ Đại Học Cần Thơ

Tài liệu nghiên cứu Qui trình xây dựng bộ gien chloroplast, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Tác giả: Huỳnh Phước Hải
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Hòa
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Hệ thống thông tin
• Đề tài: Qui Trình Xây Dựng Bộ Gien Chloroplast
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Tin sinh học
• 1.2. Cơ sở xây dựng các chương trình Tin sinh học
• 1.3. Đặc điểm của gien Chloroplast
• 1.4. Dự án Metabarcoding
• 1.5. Phạm vi và mục đích nghiên cứu
• 1.6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
• 1.7. Bố cục luận văn
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ BỘ GIEN
• 2.1. Lịch sử kỹ thuật giải trình tự gien
• 2.2. Các phương pháp giải trình tự gien
• 2.2.1. Giải trình tự gien bằng phương pháp hóa học
• 2.2.2. Phương pháp Enzyme
• 2.2.3. Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)
• 2.3. Dữ liệu giải trình tự
• 2.3.1. Định dạng FASTA
• 2.3.2. Định dạng FASTQ
• 2.4. Qui trình xác định trình tự một bộ gien
• 2.4.1. Xây dựng Scaffold
• 2.4.2. Ánh xạ vào gien mẫu và mở rộng contig
• 2.5. Lắp ráp De novo với dữ liệu NGS
• 2.5.1. Overlap Layout Consensus
• 2.5.2. Đồ thị De – Bruijn
• 2.6. Lắp ráp contig với chương trình Minia
• 3. CHƯƠNG 3: QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ BỘ GIEN CHLOROPLAST CỦA CÁC LOÀI CÂY
• 3.1. Qui trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast hiện tại
• 3.2. Yêu cầu bài toán cho qui trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast của các loài cây
• 3.3. Qui trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast của các loài cây
• 3.3.1. Giai đoạn Chọn Read (Select) và Lắp ráp Contig (Assembly)
• 3.3.2. Giai đoạn lọc contig (Filter Contig)
• 3.3.3. Giai đoạn sắp xếp contig (Ordering Contig)
• 3.3.4. Giai đoạn mở rộng contig (Extending Contigs)
• 3.4. Phương pháp thực hiện
• 3.4.1. Giai đoạn 1: Chọn các read (Select) và lắp ráp contig (Assembly). Lọc các contig của Chloroplast (Filter Contig). Sắp xếp Contig (Ordering Contigs). Mở rộng Contig (Extend Contig)
• 4. CHƯƠNG 4: THỰC NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
• 4.1. Mô tả thực nghiệm
• 4.2. Phương pháp tiến hành thực nghiệm
• 4.3. Đánh giá kết quả thực nghiệm
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN
• 5.1. Kết luận
• 5.2. Hướng phát triển
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Qui Trình Xây Dựng Bộ Gien Chloroplast

Nghiên cứu qui trình xây dựng bộ gien Chloroplast trong công nghệ thông tin là một lĩnh vực đang thu hút sự chú ý lớn. Bộ gien Chloroplast đóng vai trò quan trọng trong việc xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài thực vật. Việc hiểu rõ qui trình này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu mà còn mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn trong sinh học và công nghệ sinh học.

1.1. Định Nghĩa và Vai Trò Của Gien Chloroplast

Gien Chloroplast là thành phần di truyền quan trọng trong tế bào thực vật, chịu trách nhiệm cho quá trình quang hợp và nhiều chức năng sinh hóa khác. Việc nghiên cứu gien này giúp hiểu rõ hơn về sự phát triển và tiến hóa của thực vật.

1.2. Lịch Sử Nghiên Cứu Về Gien Chloroplast

Lịch sử nghiên cứu gien Chloroplast bắt đầu từ những năm 1970, với sự phát triển của công nghệ giải trình tự ADN. Những tiến bộ này đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phân tích và xác định các loài thực vật.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Bộ Gien Chloroplast

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu gien Chloroplast, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống thường yêu cầu mẫu gien gốc, điều này gây khó khăn trong việc xác định các loài từ mẫu dữ liệu thô. Việc thiếu dữ liệu tham chiếu cũng là một vấn đề lớn trong nghiên cứu này.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Truyền Thống

Phương pháp truyền thống yêu cầu mẫu gien gốc để xác định, điều này không khả thi trong nhiều trường hợp. Việc này làm giảm tính chính xác và hiệu quả của nghiên cứu.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Thu Thập Dữ Liệu

Việc thu thập dữ liệu gien từ các loài thực vật khác nhau gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của hệ sinh thái. Điều này ảnh hưởng đến khả năng phân tích và so sánh giữa các loài.

III. Phương Pháp Mới Trong Xác Định Trình Tự Bộ Gien Chloroplast

Để giải quyết các thách thức hiện tại, một phương pháp mới đã được đề xuất. Phương pháp này cho phép xác định bộ gien Chloroplast từ các mẫu dữ liệu thô mà không cần sử dụng các gien tham chiếu. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong công nghệ sinh học.

3.1. Qui Trình Xác Định Trình Tự Mới

Qui trình mới này bao gồm các bước chọn lọc, lắp ráp và phân tích dữ liệu gien từ các mẫu thô. Điều này giúp tăng cường độ chính xác và hiệu quả trong việc xác định bộ gien Chloroplast.

3.2. Công Cụ Hỗ Trợ Nghiên Cứu

Các công cụ phân tích và lắp ráp dữ liệu gien đã được phát triển để hỗ trợ qui trình mới. Những công cụ này giúp tối ưu hóa quá trình nghiên cứu và giảm thiểu sai sót.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Bộ Gien Chloroplast

Nghiên cứu bộ gien Chloroplast không chỉ có giá trị trong lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Việc xây dựng mã vạch ADN từ bộ gien này có thể hỗ trợ trong việc xác định các loài thực vật và nghiên cứu đa dạng sinh học.

4.1. Ứng Dụng Trong Đa Dạng Sinh Học

Nghiên cứu bộ gien Chloroplast giúp xác định và phân loại các loài thực vật, từ đó hỗ trợ trong việc bảo tồn và phát triển bền vững các hệ sinh thái.

4.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp

Việc hiểu rõ bộ gien Chloroplast có thể giúp cải thiện giống cây trồng, tăng năng suất và khả năng chống chịu với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

V. Kết Luận và Hướng Phát Triển Tương Lai

Nghiên cứu qui trình xây dựng bộ gien Chloroplast trong công nghệ thông tin mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu và ứng dụng. Hướng phát triển tương lai cần tập trung vào việc cải thiện các phương pháp xác định và phân tích dữ liệu gien, từ đó nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Gien Chloroplast

Nghiên cứu gien Chloroplast sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ mới, giúp mở rộng hiểu biết về di truyền học và sinh học thực vật.

5.2. Đề Xuất Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá tính chính xác và hiệu quả của phương pháp mới, đồng thời mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Công nghệ giải trình tự gien thế hệ tiếp theo (Next Generation Sequencing - NGS) đã tạo ra một lượng dữ liệu di truyền khổng lồ với chi phí ngày càng giảm, mở ra nhiều cơ hội đột phá trong nghiên cứu sinh học, đặc biệt là đa dạng sinh học. Trong đó, dự án Metabarcoding DNA sử dụng dữ liệu giải trình tự để xác định và phân loại các loài dựa trên mã vạch ADN từ mẫu dữ liệu phức tạp. Bộ gien Chloroplast đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng mã vạch và thiết lập mối quan hệ di truyền giữa các loài thực vật, với kích thước từ 115 kb đến 165 kb và cấu trúc gồm ba vùng chính: IRa, IRb, LSC và SSC.

Tuy nhiên, các phương pháp xác định trình tự bộ gien Chloroplast truyền thống phụ thuộc vào việc sử dụng gien tham chiếu đã biết, gây hạn chế khi áp dụng cho dữ liệu thô phức tạp trong dự án Metabarcoding. Mục tiêu nghiên cứu là đề xuất một quy trình mới có khả năng xác định trình tự bộ gien Chloroplast trực tiếp từ dữ liệu thô NGS mà không cần gien tham chiếu, đồng thời phát triển các công cụ hỗ trợ thực hiện quy trình này. Nghiên cứu được thực hiện trên bốn tập dữ liệu thực nghiệm, đánh giá tính chính xác và hiệu quả của quy trình mới so với các bộ gien Chloroplast đã được công bố.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các loài cây, với dữ liệu thu thập và xử lý trong giai đoạn từ năm 2014 trở về trước, tại các cơ sở nghiên cứu trong nước. Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp một công cụ tin sinh học hiệu quả, giúp nâng cao độ chính xác và tiết kiệm thời gian trong việc xây dựng mã vạch ADN phục vụ nghiên cứu đa dạng sinh học và các ứng dụng sinh học phân tử khác.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Tin sinh học (Bioinformatics): Ứng dụng công nghệ thông tin, toán học và thống kê để xử lý và phân tích dữ liệu sinh học, đặc biệt là dữ liệu trình tự ADN.
• Kỹ thuật giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS): Phương pháp tạo ra hàng triệu đoạn read ngắn từ mẫu ADN, với chi phí thấp và tốc độ cao, tạo điều kiện cho việc phân tích bộ gien quy mô lớn.
• Lắp ráp De novo với đồ thị De Bruijn: Thuật toán lắp ráp trình tự dựa trên việc xây dựng đồ thị De Bruijn từ các k-mer (chuỗi con độ dài k) để ghép nối các read thành các contig dài hơn.
• Bộ lọc Bloom (Bloom Filter): Cấu trúc dữ liệu xác suất giúp lưu trữ và truy vấn hiệu quả các k-mer trong quá trình lắp ráp, giảm thiểu bộ nhớ sử dụng.
• Phương pháp lọc và sắp xếp contig dựa trên so sánh trình tự (BLAST): So sánh các contig với cơ sở dữ liệu gien Chloroplast đã biết để lọc và xác định các contig thuộc bộ gien Chloroplast.

Các khái niệm chính bao gồm: read, contig, scaffold, k-mer, coverage (độ phủ), bộ gien Chloroplast, đồ thị De Bruijn, bộ lọc Bloom, và thuật toán lắp ráp De novo.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu sử dụng là bốn tập dữ liệu gien thực nghiệm định dạng FASTA và FASTQ, thu thập từ các thiết bị giải trình tự NGS, bao gồm các mẫu thực vật có bộ gien Chloroplast đã được công bố. Cỡ mẫu gồm hàng triệu read ngắn với độ dài từ 25 đến 250 bp.

Phương pháp phân tích gồm các bước chính:

1. Phân tích k-mer và lọc read: Sử dụng chương trình DSK để đếm tần suất xuất hiện của các k-mer trong dữ liệu thô, từ đó xác định ngưỡng độ phủ (coverage threshold) đặc trưng cho gien Chloroplast. Công cụ ReadFilter được phát triển để lọc ra các read chứa k-mer có độ phủ vượt ngưỡng, giảm thiểu dữ liệu không liên quan.

2. Lắp ráp contig: Áp dụng phần mềm Minia, sử dụng thuật toán đồ thị De Bruijn kết hợp bộ lọc Bloom để lắp ráp các read đã lọc thành các contig, tối ưu bộ nhớ và thời gian xử lý trên máy tính cá nhân với RAM tối thiểu 4GB.

3. Lọc contig Chloroplast: So sánh các contig với cơ sở dữ liệu Plastid chứa hơn 603 bộ gien Chloroplast đã được công bố, sử dụng BLAST để chọn các contig có độ chính xác ≥ 85% và độ phủ ≥ 80%.

4. Sắp xếp và mở rộng contig: Xây dựng đồ thị sắp xếp contig dựa trên các đoạn chồng lắp k-mer giữa các contig, tìm chu trình dài nhất đại diện cho trình tự bộ gien Chloroplast. Các contig cô lập hoặc treo được mở rộng bằng các công cụ Scaffolding như Mapsembler2 hoặc SSPACE để lấp đầy khoảng trống.

Timeline nghiên cứu kéo dài trong năm 2014, bao gồm giai đoạn thu thập dữ liệu, phát triển thuật toán, thực nghiệm và đánh giá kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xác định ngưỡng độ phủ đặc trưng cho gien Chloroplast: Qua phân tích histogram k-mer của tập dữ liệu Arabidopsis Thaliana, ngưỡng độ phủ được xác định khoảng 550, phản ánh đặc điểm lặp lại cao của gien Chloroplast với khoảng 1000 bản sao trong tế bào.

2. Hiệu quả lọc read bằng ReadFilter: Sau khi áp dụng ReadFilter, số lượng read giảm đáng kể, chỉ giữ lại các read có khả năng chứa gien Chloroplast, giúp giảm tải cho bước lắp ráp contig. Tỷ lệ read giữ lại dao động khoảng 20-30% so với dữ liệu thô ban đầu.

3. Lắp ráp contig với Minia: Các contig được lắp ráp có độ dài và số lượng phù hợp, với bộ nhớ sử dụng chỉ khoảng 5.7 GB RAM, thời gian xử lý trong vòng 24 giờ trên máy tính cá nhân. Kết quả cho thấy các contig có độ dài trung bình đạt từ vài kb đến hàng chục kb, phù hợp với kích thước bộ gien Chloroplast.

4. Lọc và sắp xếp contig: Qua so sánh với cơ sở dữ liệu Plastid, khoảng 85% contig được xác định thuộc bộ gien Chloroplast với độ chính xác ≥ 85% và độ phủ ≥ 80%. Đồ thị sắp xếp contig cho phép xây dựng chu trình trình tự liên tục, giảm thiểu gap và các đoạn lặp lại. So sánh với bộ gien Chloroplast tham chiếu cho thấy độ tương đồng trên 95%.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân thành công của quy trình là do việc kết hợp hiệu quả giữa phân tích k-mer để lọc dữ liệu thô, thuật toán lắp ráp De novo sử dụng đồ thị De Bruijn và bộ lọc Bloom giúp giảm bộ nhớ, cùng với việc sử dụng cơ sở dữ liệu Plastid để lọc và xác định contig Chloroplast. So với phương pháp truyền thống phụ thuộc vào gien tham chiếu, quy trình mới không cần dữ liệu mẫu trước, phù hợp với dữ liệu phức tạp trong dự án Metabarcoding.

Kết quả có thể được trình bày qua biểu đồ histogram k-mer, bảng thống kê số lượng và độ dài contig, biểu đồ so sánh độ chính xác giữa bộ gien xác định và bộ gien tham chiếu. So với các nghiên cứu trước đây, quy trình này cải thiện đáng kể khả năng xử lý dữ liệu thô phức tạp và giảm chi phí tính toán.

Ý nghĩa của kết quả là mở rộng khả năng ứng dụng công nghệ NGS trong nghiên cứu đa dạng sinh học, giúp xây dựng mã vạch ADN chính xác hơn, hỗ trợ các nghiên cứu sinh thái và bảo tồn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai quy trình trên quy mô lớn: Áp dụng quy trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast cho các bộ dữ liệu NGS đa dạng hơn, nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN phong phú phục vụ nghiên cứu đa dạng sinh học. Thời gian thực hiện dự kiến 1-2 năm, chủ thể là các viện nghiên cứu sinh học và công nghệ thông tin.

2. Phát triển phần mềm tích hợp: Hoàn thiện và phát triển phần mềm tích hợp các bước xử lý từ lọc read, lắp ráp contig đến sắp xếp và mở rộng, với giao diện thân thiện, hỗ trợ chạy trên máy tính cá nhân cấu hình thấp. Mục tiêu giảm thời gian xử lý và tăng tính tự động, hoàn thành trong 6-12 tháng.

3. Mở rộng cơ sở dữ liệu tham chiếu: Cập nhật và mở rộng cơ sở dữ liệu Plastid với các bộ gien Chloroplast mới được giải trình tự, tăng độ bao phủ và độ chính xác trong việc lọc contig. Chủ thể thực hiện là các tổ chức lưu trữ dữ liệu sinh học, thời gian liên tục cập nhật.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo về quy trình và phần mềm cho các nhà nghiên cứu sinh học phân tử và tin sinh học, nhằm nâng cao năng lực ứng dụng công nghệ NGS trong nghiên cứu thực tiễn. Thời gian triển khai 6 tháng đến 1 năm, chủ thể là các trường đại học và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và đa dạng sinh học: Có thể áp dụng quy trình để xác định trình tự bộ gien Chloroplast từ dữ liệu NGS, phục vụ nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loài.

2. Chuyên gia tin sinh học: Sử dụng các thuật toán và công cụ phát triển trong luận văn để cải tiến hoặc xây dựng các phần mềm xử lý dữ liệu giải trình tự thế hệ tiếp theo.

3. Các tổ chức bảo tồn và quản lý tài nguyên sinh vật: Áp dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng mã vạch ADN phục vụ giám sát đa dạng sinh học và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ thông tin và sinh học: Tham khảo để hiểu rõ quy trình xử lý dữ liệu NGS, thuật toán lắp ráp De novo và ứng dụng trong nghiên cứu thực tiễn.

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình mới có thể áp dụng cho các loài thực vật khác ngoài mẫu nghiên cứu không?
   Quy trình được thiết kế linh hoạt và đã được thử nghiệm trên bốn tập dữ liệu khác nhau, do đó có thể áp dụng rộng rãi cho nhiều loài thực vật khác nhau với điều kiện dữ liệu đầu vào phù hợp.

2. Phần mềm Minia có yêu cầu cấu hình máy tính như thế nào?
   Minia sử dụng bộ lọc Bloom giúp giảm bộ nhớ, có thể chạy hiệu quả trên máy tính cá nhân với RAM tối thiểu 4GB, phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm có nguồn lực hạn chế.

3. Làm thế nào để xác định ngưỡng độ phủ (coverage threshold) phù hợp?
   Ngưỡng được xác định dựa trên biểu đồ histogram tần suất xuất hiện của k-mer trong dữ liệu thô, vị trí biến thiên đặc trưng cho gien Chloroplast được chọn làm ngưỡng.

4. Quy trình có thể xử lý dữ liệu chứa nhiều loại gien khác nhau không?
   Có, quy trình sử dụng bước lọc read và lọc contig dựa trên đặc trưng k-mer và so sánh với cơ sở dữ liệu Plastid để tách riêng các thành phần gien Chloroplast từ dữ liệu phức tạp.

5. Kết quả xác định trình tự có độ chính xác như thế nào so với phương pháp truyền thống?
   Kết quả thực nghiệm cho thấy độ tương đồng trên 95% so với bộ gien Chloroplast tham chiếu, chứng tỏ quy trình mới có độ chính xác cao và phù hợp với yêu cầu nghiên cứu.

Kết luận

• Đã đề xuất và phát triển thành công quy trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast từ dữ liệu NGS thô mà không cần gien tham chiếu.
• Quy trình kết hợp hiệu quả các thuật toán phân tích k-mer, lắp ráp De novo với đồ thị De Bruijn và bộ lọc Bloom, cùng với phương pháp lọc và sắp xếp contig dựa trên cơ sở dữ liệu Plastid.
• Thực nghiệm trên bốn tập dữ liệu cho kết quả chính xác, tương đồng cao với bộ gien Chloroplast đã công bố, đồng thời tiết kiệm bộ nhớ và thời gian xử lý.
• Quy trình có thể triển khai trên máy tính cá nhân với RAM tối thiểu 4GB, phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm và dự án nghiên cứu.
• Hướng phát triển tiếp theo bao gồm mở rộng cơ sở dữ liệu tham chiếu, hoàn thiện phần mềm tích hợp và đào tạo chuyển giao công nghệ.

Để tiếp tục phát triển và ứng dụng quy trình, các nhà nghiên cứu và tổ chức có thể liên hệ để nhận hỗ trợ phần mềm và tài liệu hướng dẫn chi tiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1.6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài Qui trình thực hiện sẽ đƣợc sử dụng tích hợp trong dự án Metabarcoding để xây dựng barcoding ADN cho các loài cây. Đây là một ứng dụng phục vụ cho rất nhiều nghiên cứu trong đa dạng sinh học, phân tích các loài cây, sinh vật phù du và phân tích cộng đồng sinh vật đáy, xây dựng lại hệ sinh thái trong quá khứ.7 Bố cục luận văn Nội dung luận văn đƣợc chia làm năm chƣơng. Các chƣơng này đƣợc tổ chức nội dung nhƣ sau: Chƣơng 1: Giới thiệu Nội dung chƣơng này chúng tôi giới thiệu tổng quan các nội dung cơ sở lý thuyết liên quan đến đề tài. Sau cùng chúng tôi trình bày phạm vi nghiên cứu của đề tài và ứng dụng của đề tài.

Chƣơng 2: Tổng quan về qui trình xác định trình tự bộ gien Nội dung chƣơng này chúng tôi trình bày chi tiết về các giai đoạn trong qui trình xác định trình tự một bộ gien gồm: giải trình tự gien (Sequencing DNA), lắp ráp trình tự gien ( Assembly) , ánh xạ gien mẫu (Mapping). Chƣơng 3: Xây dựng qui trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast của các loài cây Trong chƣơng này chúng tôi đề xuất một qui trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast mới dựa trên qui trình truyền thống. Trong mỗi giai đoạn chúng tôi trình bày chi tiết giải thuật, cách cài đặt và xây dựng các công cụ. Thực nghiệm và đánh giá kết quả.

Nội dung chƣơng này trình bày cách thức thực hiện quá trình thực nghiệm để đánh giá qui trình. Chúng tôi trình bày cụ thể cách xử lý dữ liệu trong từng giai đoạn của qui trình và cách thức sử dụng các công cụ đã đƣợc xây dựng trong qui trình. Tiếp theo chúng tôi cách đánh giá qui trình trên bốn tập dữ liệu khác nhau. Kết luận và hƣớng phát triển Nội dung chƣơng này chúng tôi nêu ra các kết luận và hƣớng phát triển của đề tài nhƣ cải tiến qui trình xác định trình tự bộ gien Chloroplast.

Trang 6 Chương 2. Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ BỘ GIEN 2.1 Lịch sử kỹ thuật giải trình tự gien Kỹ thuật giải trình tự ADN (DNA Sequencing) là dùng phƣơng pháp hay công nghệ để xác định thứ tự của các axít này trong một đoạn ADN ngắn (đoạn này đƣợc gọi là short read). Kỹ thuật này xuất hiện lần đầu tiên vào những năm 1970 và ảnh hƣởng sâu rộng đến nhiều lĩnh vực khoa học nhƣ: di truyền học, công nghệ sinh học, sinh học phân tử, khoa học pháp y và nhiều lĩnh vực khác. Trải qua hơn ba thập niên, các kỹ thuật giải trình tự đã có sự phát triển nhanh chóng, có thể phân thành ba nhóm chính nhƣ sau: giải trình tự dựa vào chất xúc tác sinh học enzyme với điển hình là kỹ thuật Sanger [Sanger et al., 1975], giải trình tự theo phƣơng pháp hóa học với công trình của hai nhà khoa học Maxam và Gilbert [Maxam và Gilbert, 1977] và kỹ thuật giải trình tự ADN thế hệ tiếp theo (Next generation ADN sequencing technology - NGS).2 Các phƣơng pháp giải trình tự gien 2.1 Giải trình tự gien bằng phƣơng pháp hóa học.

Giải trình tự gien bằng phƣơng pháp hóa học đƣợc hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert đã phát minh vào năm 1977 [Allan Maxam và Walter Gilbert, 1977]. Đây là phƣơng pháp sử dụng các phản ứng hóa học để xác định đƣợc trình tự các nucleotide trong chuỗi ADN. Trong phƣơng pháp này gồm các giai đoạn cơ bản sau: (1) ADN sợi kép đƣợc tách thành sợi đơn. (3) Sử dụng 4 loại hóa chất khác nhau, mỗi loại hóa chất chỉ phá hủy một loại nucleotide nhất định và tiến hành 4 phản ứng hóa học độc lập, kết quả tạo ra các đoạn ADN có kích thƣớc khác nhau.

(4) Sản phẩm của 4 phản ứng đƣợc tiến hành điện di. Trình tự nucleotide đƣợc đọc từ dƣới lên theo chiều từ 5‟ đến 3‟. Trang 7 Chương 2. Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien Hình 2.1 Mô hình phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert 4 Phƣơng pháp hóa học xác định trình tự ADN của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ƣu cho thí nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác định đƣợc nồng độ giới hạn của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu ADN thì trên mỗi đoạn ADN chỉ có một base bị biến đổi.

Chính vì sự phức tạp này, phƣơng pháp Maxam-Gilber hiện nay gần nhƣ không còn sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phƣơng pháp enzyme với nhiều ƣu điểm vƣợt trội hơn.2 Phƣơng pháp Enzyme Phƣơng pháp Enzyme đƣợc Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977 [Sanger et al. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa vào sự hoạt động của enzyme DNA-polymerase để tổng hợp mạch bổ sung của trình tự cần xác định. 4 http://universe-review.htm Trang 8 Chương 2. Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien Hình 2.2 Phương pháp Enzyme giải trình tự ADN5 Phản ứng có sự tham gia của các dideoxynucletide (ddNTP).

Để thực hiện phƣơng pháp này, trƣớc hết, các đoạn ADN cần xác định trình tự phải đƣợc tạo dòng vào một vector để nhân thành nhiều bản sao trong tế bào đƣợc chuyển vào sau đó tách chiết để thành các vector tự do. Lƣợng ADN sau khi đƣợc tách chiết sẽ đƣợc phân vào bốn ống nghiệm khác nhau để thực hiện phản ứng giải trình tự. Kết quả sẽ tạo những mạch ADN có chiều dài khác nhau 1 nucleotide tƣơng ứng với trình tự nucleotide trên đoạn ADN gốc. Sau khi điện di giống nhƣ phƣơng pháp Maxam- Gilbert, các vạch điện di này đƣợc hiển thị bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.

Từ các vạch này có thể xác định đƣợc trình tự ADN.vn/ Trang 9 Chương 2. Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien 2.3 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) Trong các giải trình tự thế hệ tiếp theo, tất cả các ADN từ một nguồn (thƣờng là một cá thể) đƣợc cắt nhỏ thành hàng triệu các mẩu nhỏ. Các mẩu ADN nhỏ này đƣợc “đọc” một cách tự động bằng các thiết bị giải trình tự, gọi là read. Kỹ thuật này bắt đầu xuất hiện từ năm 2000 với chi phí giảm đáng kể và chiều dài của read sinh ra cũng ngắn hơn (từ 25→75 bp, ngoại trừ kỹ thuật 454 pyrosequencing tạo ra read có chiều dài 250 bp) so với phƣơng pháp giải trình tự của Sanger.

Giai đoạn này có nhiều phƣơng pháp lập trình tự đƣợc giới thiệu nhƣ: 454 pyrosequencing (Roche Applied Science; Basel), Solexa (Illumina; San Diego, CA, USA), ABI SOLiD (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), HeliScope (Helicos; Cambridge, MA, USA)…Trong đó tiêu biểu là hai kỹ thuật 454 pyrosequencing và ABI SOLiD a. Kỹ thuật 454 pyrosequencing Kỹ thuật pyrosequencing 454 [Pål Nyrén, Mostafa Ronaghi, 1996] đề xuất bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996 và đƣợc phát triển bởi công ty 454 Life Science. Kỹ thuật này gồm các giai đoạn đƣợc thể hiện trong Hình 2.3 Đầu tiên, sợi khuôn, một sản phẩm PCR sợi đơn, đƣợc lai với một primer giải trình tự và sau đó đƣợc ủ với các enzyme. Khi dNTP đầu tiên đƣợc bắt cặp bổ sung, nó đƣợc gắn với sợi ADN khuôn nhờ các enzyme và thực hiện phản ứng để tạo ra ánh sánh nhìn thấy, có độ sáng tƣơng ứng.

Ánh sáng này đƣợc nhận viết bởi một camera và phân tích bởi một chƣơng trình phần mềm. Sau đó các enzyme làm suy biến các nucleotide không bắt cặp và ATP. Sau quá trình làm suy biến, phản ứng bắt đầu lại với nucleotide khác đƣợc gắn vào. Sau một quá trình liên tục, sợi ADN bổ sung đƣợc tổng hợp xong và việc giải trình tự nucleotide đƣợc xác định.

Công ty 454 đã phát triển mới kỹ thuật pyrosequencing trở thành kỹ thuật nền tảng hữu hiệu cho việc giải trình ADN dữ lƣợng lớn. Nó trở nên nổi bật với ứng dụng vào giải trình tự genome và ngành metagenomics. Nền tảng kỹ thuật pyrosequencing GS FLX của công ty 454 Life Science có thể tạo ra 400 triệu nucleotide trong 10 giờ bởi một máy, và giá thành khoảng 5,000 – 7,000 USD cho mỗi lần chạy [Lorato Lekgari, 2010]. Trang 10 Chương 2.

Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien Hình 2.3 Kỹ thuật 4546 a) Kỹ thuật SOLiD Cuối năm 2007, công ty Applied Biosystems (ABI) đã giới thiệu kỹ thuật SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) dựa trên nền tảng thế hệ lập trình tự ADN thế hệ tiếp theo (Next-generation ADN sequencing). Kỹ thuật này chủ yếu dựa trên phƣơng pháp buộc thắt (ligation) để xác định trình tự của các mảnh ADN. Thƣ viện các mảnh ADN dùng để lập trình tự có thể là mảnh đơn hoặc mảnh đôi (mate-paired). Các mảnh này đƣợc nhân bản vô tính thông qua phƣơng pháp emulsion PCR, tạo ra các hạt (bead) đƣợc gắn vô số các mảnh ADN trên bề mặt.

Sau đó, các hạt này đƣợc đặt trên bề mặt của một tấm kính để thực hiện quá trình lập trình tự nhƣ hình Hình 2.4 6 The Journal of Experimental Biology 209, 1518-1525. Published by The Company of Biologists 2007 Trang 11 Chương 2. Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien Hình 2.4 Nhân bản vô tính các mảnh ADN (Jay và Hanlee, 2008)7 Trình tự đƣợc thiết lập bằng cách tổng hợp nhiều chu trình buộc thắt nhƣ Hình 2. Đầu mồi (primer) đƣợc gắn với bộ điều hợp P1 (P1 adaptor) của các mẫu, đầu dò (probes) có chứa nhãn huỳnh quang (bốn màu khác nhau) từng bƣớc buộc thắt với đầu mồi.

Quá trình này sẽ thực hiện tổng cộng năm chu kỳ trên toàn bộ chiều dài của mẫu. Do các đầu dò đƣợc mã hóa theo 2 base (vị trí 1 và 2) nên mỗi vị trí của mỗi base trong mẫu sẽ đƣợc xác định hai lần nhƣ Hình 2. Dựa theo màu của nhãn huỳnh quang, chúng ta có thể tìm thấy base tƣơng ứng với màu đó và toàn bộ trình tự của read đƣợc xác định. Kỹ thuật này sinh ra read có chiều dài là 35 bp với độ chính xác khoảng 99.

(a) 7 The Journal of Experimental Biology 209, 1518-1525. Published by The Company of Biologists 2007 Trang 12 Chương 2. Tổng quan về xác định trình tự một bộ gien (b) Hình 2.5 Chu trình buộc thắt một mẫu8 Các kỹ thuật lập trình tự thế hệ đầu tiên nhƣ kỹ thuật Sanger và kỹ thuật Maxam - Gilbert có chi phí tƣơng đối cao (khoảng 500 USD cho mỗi Megabase) và chiều dài read từ vài trăm đến 1000 bp.