Nghiên Cứu Phân Lập và Nuôi Cấy Hệ Sợi Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Ký Sinh Trên Cơ Thể Bọ Xít

Tài liệu nghiên cứu Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy hệ sợi nấm đông trùng hạ thảo kí sinh trên cơ thể bọ xít thu thập, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Vũ Thành Trung
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Văn Thắng
• Trường học: Trường Đại Học Lâm Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập và Nuôi Cấy Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Ký Sinh Trên Bọ Xít
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Giới Thiệu Chi Tiết

Đông trùng hạ thảo là một dạng cộng sinh độc đáo giữa nấm túi Cordyceps và ấu trùng của côn trùng thuộc chi Hepialus. Tên gọi 'Đông trùng hạ thảo' xuất phát từ vòng đời đặc biệt của chúng: mùa đông là sâu non, mùa hè phát triển thành thảo dược. Nấm sử dụng chất hữu cơ từ côn trùng làm nguồn dinh dưỡng, dẫn đến cái chết của vật chủ. Vào mùa hè, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả. Theo Gi-Ho Sung et al. (2007), Cordyceps nutans thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps. Loài này mọc chủ yếu ở phần đầu và ngực của bọ xít, có hình dạng thuôn nhọn khi còn non và chia thành hai phần rõ rệt khi trưởng thành: cuống nấm màu nâu đen và đầu nấm màu đỏ da cam đặc trưng.

1.1. Đặc Điểm Hình Thái Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Cordyceps

Nấm Cordyceps nutans ký sinh trên bọ xít thường có số lượng từ 1-5 cây trên một ký chủ. Nấm trưởng thành có chiều dài từ 6-180 mm và chiều ngang phần thân nấm từ 2-2.5mm. Phần đầu nấm, hay cơ quan sinh sản, chiếm 1/6 đến 1/4 chiều dài tổng thể, với chiều ngang từ 2.5-4 mm. Loài nấm này thường được tìm thấy ở độ cao 400-1400m gần khe suối ven đường mòn, dưới tán rừng hỗn giao cây gỗ lá rộng, nơi có độ ẩm cao và ánh sáng yếu. Theo nghiên cứu, nấm có vị hơi chát ban đầu, sau đó chuyển sang ngọt, có lợi cho việc tăng cường hệ miễn dịch và chống suy giảm miễn dịch.

1.2. Phân Loại Khoa Học Chi Tiết Nấm Cordyceps Nutans

Theo hệ thống phân loại của Gi-Ho Sung et al. (2007), Cordyceps nutans thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps. Nấm mọc ở phần đầu ngực và phần cuối bụng bọ xít, chủ yếu là phần đầu và ngực. Nấm khi còn non hình thuôn nhọn hoặc hình lưỡi liềm, khi già chia làm 2 phần rõ rệt: phần cuống nấm có màu nâu hơi đen và phần đầu nấm hình chùy có màu đỏ da cam đặc trưng.

II. Phân Bố Địa Lý và Môi Trường Sống Của Đông Trùng Hạ Thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu được tìm thấy vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam. Chi Cordyceps có khoảng 400 loài khác nhau, trong đó Trung Quốc có khoảng 60 loài. Tuy nhiên, chỉ có Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris được nghiên cứu kỹ lưỡng về giá trị dược liệu. Năm 2009, Cordyceps nutans được phát hiện tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang, đánh dấu sự phân bố của loài này tại Việt Nam. Cordyceps nutans cũng xuất hiện ở Đà Lạt – Lâm Đồng, được sử dụng để bào chế thuốc Cordyceps.

2.1. Môi Trường Sống Lý Tưởng Cho Nấm Đông Trùng Hạ Thảo

Nấm Cordyceps thường được tìm thấy ở vùng núi cao, nơi có khí hậu lạnh và ẩm ướt. Chúng ký sinh trên ấu trùng của các loài bướm thuộc chi Thitarodes. Môi trường sống lý tưởng là các khu vực có độ cao trên 4.000m, với thảm thực vật phong phú và độ ẩm cao. Điều kiện này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm và sự lây nhiễm vào cơ thể côn trùng.

2.2. Phát Hiện Cordyceps Nutans Tại Việt Nam Ý Nghĩa Khoa Học

Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện được loài nấm Đông trùng hạ thảo và được giám định là loài Cordyceps nutans. Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam.

III. Quy Trình Lây Nhiễm Nấm Cordyceps Vào Côn Trùng Chi Tiết

Quá trình lây nhiễm của nấm Cordyceps vào cơ thể côn trùng vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn. Côn trùng có thể ăn phải bào tử nấm hoặc bị nhiễm bệnh từ các lỗ thở. Khi sợi nấm phát triển, chúng xâm nhập vào mô của vật chủ, sử dụng chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu. Nấm phát triển thành dạng cây và phát tán bào tử. Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua ba giai đoạn: xâm nhập, phát triển và sinh trưởng sau khi vật chủ chết. Các enzyme như protease và chitinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập.

3.1. Giai Đoạn Xâm Nhập Của Nấm Cordyceps Vào Vật Chủ

Giai đoạn xâm nhập bắt đầu khi bào tử nấm mọc mầm và hoàn thành việc xâm nhập vào xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm giải phóng các enzyme ngoại bào như protease, chitinase, lipase để phân hủy lớp vỏ cuticun của côn trùng. Enzyme protease và chitinase tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein).

3.2. Phát Triển Của Nấm Cordyceps Bên Trong Cơ Thể Côn Trùng

Trong xoang cơ thể côn trùng, nấm tiếp tục phát triển và hình thành nhiều sợi nấm ngắn. Hệ sợi nấm phân tán khắp nơi theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập. Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp. Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài.

IV. Phân Loại và Hoạt Chất Sinh Học Trong Nấm Đông Trùng Hạ Thảo

Giống Cordyceps có hai loài được nghiên cứu nhiều là Ophiocordyceps sinensis và Cordyceps militaris. Ophiocordyceps sinensis có phân bố hạn chế và chưa được nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo. Cordyceps militaris chứa các hợp chất tương tự như O.sinensis và dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo. Thành phần hóa học của nấm Đông trùng hạ thảo bao gồm protein, vitamin, khoáng chất và các hợp chất quan trọng như cordycepin, adenosine, polysaccharide và ergosterol.

4.1. Cordyceps Militaris Tiềm Năng Thay Thế Ophiocordyceps Sinensis

Loài đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (thường được gọi nấm cam sâu bướm), chứa các hợp chất hóa học tương tự như của O.sinensis, nhưng có thể dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nuôi trồng nấm C. militaris nhằm thay thế cho loài O. Sinensis và có nhiều nghiên cứu quan trọng về gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi cấy, các đặc tính sinh hóa và dược lý của nấm C.

4.2. Hoạt Chất Cordycepin Tác Dụng Ức Chế Ung Thư Mạnh Mẽ

Hợp chất cordycepin trong nấm ĐTHT có khả năng ức chế sự phát triển của khối u, kéo dài thời gian sống cho những con chuột được cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự phát triển, di căn của tế bào ung thư ở những con chuột. Dịch chiết từ nấm ĐTHT ức chế sự phát triển của tế bào máu từ cuống rốn, dòng tế bào mô mềm Sarcoma gây ung thư ác tính HT1080.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Đông trùng Hạ thảo là tên gọi của một dạng cộng sinh giữa một loài nấm túi thuộc chi Cordyceps với ấu trùng (sâu non) của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus. Nấm Đông trùng trong tự nhiên chủ yếu tìm thấy vào mùa hè tại vùng núi cao trên 4.000m ở cao nguyên Thanh Tạng (Thanh Hải - Tây Tạng) và Tứ Xuyên (Trung Quốc). Cùng với sự phát triển của Y học nói chung và Y học cổ truyền nói riêng thì xu hƣớng hiện nay là quay về các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lại hiệu quả cao, vừa ít tác dụng phụ. Vì vậy, nấm dƣợc liệu ngày càng đƣợc nhiều ngƣời dân tin dùng nhƣ một loại thảo dƣợc vừa có tác dụng chữa trị bệnh mà ít gây hại đến sức khỏe của ngƣời sử dụng.

Trong đó nấm Đông trùng hạ thảo đƣợc xem là một nguồn dƣợc liệu quý hiếm. Theo các tài liệu ghi chép về đông dƣợc cổ, Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với các bệnh nhƣ rối loạn tình dục, thận hƣ, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng, mỏi gối, ho hen, và có tác dụng tốt đối với trẻ em còi xƣơng chậm lớn. Một số nghiên cứu hiện đại gần đây đã chỉ ra rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cƣờng công năng của tuyến thƣợng thận, cải thiện đƣợc chức năng thận, nâng cao năng lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thƣ và chất phóng xạ [10,11]. Hiện nay, trong tự nhiên nấm Đông trùng bị khai thác kiệt quệ, trữ lƣợng không đủ đáp ứng nhu cầu của ngƣời sử dụng.

Vì vậy đã có nhiều nƣớc tiến hành nghiên cứu để tìm ra kỹ thuật nuôi trồng loài nấm này một cách hiệu quả. Ví dụ, Công ty Aloha Medicinals của Mỹ, đã nuôi trồng thành công Đông trùng Hạ thảo nhân tạo trong môi trƣờng hoàn toàn tự nhiên (với điều kiện nhiệt độ và lƣợng oxy thấp). Công ty Biofact life (Malaysia) đã kết hợp công nghệ tiên tiến của Nhật và các nƣớc khác nuôi cấy thành công nấm Cordyceps trên môi trƣờng nhân tạo để tạo ra hai hoạt chất chính là Cordycepin và Adenosine đƣợc tạo ra từ hệ sợi nấm. Các nƣớc nhƣ Trung 1 Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản, … sản xuất đƣợc nấm Đông trùng trên quy mô công nghiệp từ những năm 1995 Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và trƣờng Đại học Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang.

Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện đƣợc loài nấm Đông trùng hạ thảo và đƣợc giám định là loài Cordyceps nutans. Đây là loài nấm đầu tiên đƣợc mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam Xuất phát từ nhu cầu sử dụng sản phẩm, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, tìm công thức nuôi cấy nhân tạo nhân giống cho loài Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans, tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo ký sinh trên cơ thể Bọ xít thu thập từ tự nhiên” , nhằm xây dựng đƣợc kỹ thuật phân lập và nuôi trồng trên giá thể nhân tạo phù hợp với điều kiện nuôi cấy tại Việt Nam 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo là tên chung chỉ một nhóm các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc sâu trƣởng thành của một số loại côn trùng. Nấm đƣợc đặt tên Đông trùng hạ thảo dựa vào quá trình phát sinh, phát triển và vòng đời của chúng.

Sâu non, nhộng, sâu trƣởng thành của một số loài côn trùng nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh. Các loài nấm này sử dụng các chất hữu cơ trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng bị chết. Mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả.

Nhƣ vậy, mùa đông nấm ký sinh trên sâu, tồn tại ở giai đoạn hệ sợi, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là Đông trùng hạ thảo. Theo tài liệu tham khảo về hệ thống phân loại của Gi-Ho Sung et al. (2007), về việc phân loại các loài nấm Đông trùng hạ thảo thì Nấm Cordyceps nutans thuộc:  Giới (King dom): Fungi  Ngành phụ (Division) : Ascomycota  Lớp (Class): Sordariomycetes  Họ (Family): Cordycipitaceae  Chi (Genus): Cordyceps Loài Cordyceps nutans: Nấm mọc ở phần đầu ngực và phần cuối bụng bọ xít nhƣng chủ yếu là phần đầu và ngực. Nấm khi còn non hình thuôn nhọn hoặc hình lƣỡi liềm, khi già chia làm 2 phần rõ rệt: phần cuống nấm có màu nâu hơi đen và phần đầu nấm hình chùy có màu đỏ da cam đặc trƣng.

Số lƣợng nấm trên một ký chủ từ 1-5 cây nấm, nấm trƣởng thành thu đƣợc có chiều dài từ 6 -180 mm, chiều ngang phần thân nấm 2-2,5mm. Phần đầu nấm hay còn gọi là cơ quan sinh sản của nấm chiếm từ 1/6 đến 1/4 chiều dài của cả cây nấm, chiều ngang từ 2,5 – 4 mm 3 Nấm ký sinh trên bọ xít và con ong đƣợc tìm thấy trong rừng tự nhiên; ở độ cao từ 400 – 1.400 m gần khe suối ven đƣờng mòn; tìm đƣợc nhiều mẫu nấm dƣới tán rừng hỗn giao cây gỗ lá rộng xen nhiều nứa, vầu, giang; độ ẩm cao, độ tán che lớn từ 0,7 trở lên ánh sáng tán xạ yếu. Nấm mọc nhô lên khỏi lớp thảm mục rừng, phần thể quả có màu đỏ da cam nổi lên khỏi lớp thảm mục. Ký chủ của nấm là bọ xít và con ong vẫn còn nguyên hình dạng hoặc còn một phần nhƣng rất dễ nhận dạng nằm ngay dƣới lớp thảm mục.

Và đƣợc tìm nhiều nhất ở Lâm Đồng Loài Đông trùng hạ thảo này khi ăn mới đầu có vị hơi chát sau đó dần chuyển sang ngọt. Rất hữu ích cho việc tăng cƣờng hệ miễn dịch và chống suy giảm miễn dịch, chống co thắt, chảy máu tử cung và khả năng chống tế bào ung thƣ….đã đƣợc y học công nhận. Cordyceps nutans được ngoài tìm thấy ngoài tự nhiên tại Đà Lạt - Lâm Đồng 1. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy đƣợc vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000m nhƣ cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam,.

Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông 4 trùng hạ thảo. Tuy nhiên cho đến nay ngƣời ta mới chỉ nghiên cứu đƣợc 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dƣợc liệu tốt với con ngƣời. Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên Vị thuốc này thực chất là hiện tƣợng ký sinh trên cơ thể ấu trùng của loài bƣớm có tên khoa học là Thitarodes thuộc chi Cordyceps, chủ yếu là Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus. Loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và Châu Úc.

Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và trƣờng Đại học Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện đƣợc loài nấm Đông trùng hạ thảo và đƣợc giám định là loài Cordyceps nutans. Đây là loài nấm đầu tiên đƣợc mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam. Cordyceps nutan cũng xuất hiện ở Việt Nam khu vực Đà Lạt – Lâm Đông dùng để bào chế ra thuốc Cordyceps một loại thuốc cực quý hiếm.

Có những thành phần hóa học, công dụng làm thuốc cũng đâu có kém gì Đông trùng Hạ thảo của Tây Tạng là mấy. Sự lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng Theo Bách khoa toàn thƣ thì loài nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể sâu hại đến nay vẫn chƣa rõ nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng 5 hoàn toàn các chất dinh dƣỡng trong cơ thể sâu.

Đến một giai đọan nhất định, nấm phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm Đông trùng hạ thảo khi còn sống, ngƣời ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh nhƣ cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành.

Đầu sâu non giống nhƣ con tằm, dài chừng 3-5 cm, đƣờng kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng xẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống nhƣ đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhƣng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút.

Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà. Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính: (1) Giai đoạn xâm nhập Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tƣơng ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ dày nhƣ Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, Naxetylglucosaminidase, cenlulase. Các enzyme này đƣợc tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài.

Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kém phần quan trọng. Nhƣng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng.

6 (2) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm.