Tổng quan luận án
Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc họ Cà (Solanaceae) là một trong những loại cây gia vị nhiệt đới có giá trị kinh tế cao, được tiêu thụ rộng rãi trên toàn cầu. Tại Việt Nam cũng như nhiều quốc gia trồng ớt lớn trên thế giới (như Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc), dịch bệnh do nấm gây hại là trở ngại nghiêm trọng nhất đối với sản xuất nông nghiệp, gây thất thoát năng suất từ 10% đến 80%. Trong số các bệnh hại chính trên cây ớt (bao gồm héo cây con do Rhizoctonia solani, mốc xám do Botrytis cinerea, héo vàng do Fusarium oxysporum, sương mai do Phytophthora capsici), bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là đối tượng phổ biến và nguy hiểm nhất, có khả năng xâm nhiễm trên cả thân, cành, lá, hoa và trái, làm suy giảm từ 70% đến 80% năng suất thu hoạch.
Thực tế canh tác hiện nay phụ thuộc chủ yếu vào các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học tổng hợp. Việc sử dụng hóa chất liều cao trong thời gian dài đã gây ra nhiều hệ lụy tiêu cực: làm mất cân bằng hệ vi sinh vật có ích trong đất, kích thích sự hình thành các chủng nấm bệnh và côn trùng kháng thuốc, đồng thời tích tụ dư lượng độc hại làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, đất đai và đe dọa trực tiếp đến sức khỏe con người cũng như vật nuôi. Mặt khác, biện pháp chọn tạo và gieo trồng các giống chống chịu bệnh còn bộc lộ nhiều hạn chế về năng suất và độ ổn định di truyền. Trong bối cảnh đó, hướng tiếp cận sinh học sử dụng các chất kích hoạt tính kháng tự nhiên của thực vật (elicitor) được xem là giải pháp phù hợp với xu thế nông nghiệp bền vững.
Chitin/chitosan (dẫn xuất từ vỏ giáp xác) và silic/nano silica (tận dụng từ phế phụ phẩm nông nghiệp như vỏ trấu) là hai nguồn vật liệu tự nhiên dồi dào, thân thiện với môi trường và đã được chứng minh có hoạt tính kích kháng bệnh cây trồng. Tuy nhiên, công nghệ chế tạo oligochitosan truyền thống thường tạo ra các phân đoạn có khối lượng phân tử lớn (từ 30 kDa đến 100 kDa), gây khó khăn cho việc điều chỉnh và kiểm soát khối lượng phân tử ở quy mô sản xuất công nghiệp. Xuất phát từ thực tế đó, luận án tiến sĩ với đề tài “Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)” đã được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống công nghệ và thực tiễn nêu trên.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên;
- Tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân tử thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt;
- Xác định được khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm Colletotrichum truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L., giống thương mại TN 278 do Công ty Trang Nông phân phối); nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư phân lập từ cây ớt; nguyên liệu chitosan từ vỏ tôm (khối lượng phân tử ban đầu $M_w \approx 110,4$ kDa, độ deacetyl hóa 93,2%); nguồn vỏ trấu thu thập từ nhà máy chế biến lúa gạo tại Cần Thơ; phức hệ vật liệu oligochitosan, hạt nano silica và nano composite oligochitosan-silica nano.
- Phạm vi không gian: Nghiên cứu được triển khai tại Thành phố Hồ Chí Minh và các vùng phụ cận:
- Thu thập mẫu bệnh: Các ruộng chuyên canh ớt tại Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh), Tân Châu (Tây Ninh) và Thanh Bình (Đồng Tháp).
- Phân lập, khảo nghiệm và định danh nấm: Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
- Chế tạo vật liệu bức xạ: Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ (VINAGAMMA).
- Khảo sát kích kháng: Phòng thí nghiệm, hệ thống nhà màng công nghệ cao (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM) và ruộng thực nghiệm trên nền đất xám phù sa tại Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh.
- Phạm vi thời gian: Luận án được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2014 đến năm 2018.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước đã điểm luận
Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu liên quan đến ba nhóm nội dung chính:
-
Về phân loại học và tính đa dạng của chi nấm Colletotrichum spp. hại ớt:
- Theo Tạp chí Bệnh học thực vật phân tử (2012), nấm Colletotrichum spp. đứng thứ 8 trong số 10 loại nấm gây bệnh thực vật nguy hiểm nhất.
- Cannon và cộng sự (2012) chỉ ra rằng C. gloeosporioides và C. acutatum là các phức hợp loài phức tạp (species complex), trong đó phức hợp C. gloeosporioides chứa ít nhất 22 loài và C. acutatum chứa ít nhất 31 loài.
- Gardes và Bruns (1993) ứng dụng phân tích trình tự vùng ITS1 của rDNA để phân loại cấp loài trong chi Colletotrichum.
- Weir và cộng sự (2012) phân tích 156 mẫu phân lập toàn cầu qua 5 vùng gen (GPDH, ACT, TUB2, ITS, CAL), phân chia thành 9 phức hợp loài với 119 loài.
- Liu và cộng sự (2016) phát hiện loài mới C. sichuanensis từ 88 mẫu ớt thối tại Tứ Xuyên (Trung Quốc) qua phân tích đa gen GPDH, ACT, TUB2, ITS2, CAL.
- De Silva (2016) xác định 45 loài Colletotrichum spp. hại ớt tại Úc dựa trên tổ hợp các chỉ thị phân tử ITS, GAPDH, ACT, CHS1, TUB2, HIS3, ApMat và GS.
- Tại Việt Nam, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự (2018) giải trình tự vùng ITS và vùng liên gen ApMat của các mẫu nấm thán thư ớt tại Đồng bằng sông Hồng, xác định ít nhất 5 loài bao gồm C. gloeosporioides sensu stricto và C. siamense.
- Damm và cộng sự (2009, 2012a, 2012b), Ranathunge và cộng sự (2012), Saxena và cộng sự (2014), Voorrips và cộng sự (2004), Than và cộng sự (2008), Phoulivong và cộng sự (2012) đã thống kê sự phân bố của các loài C. capsici, C. acutatum, C. gloeosporioides, C. scovillei, C. asianum, C. brisbanense, C. nymphaeae trên ớt tại nhiều quốc gia (Ấn Độ, Sri Lanka, Thái Lan, Indonesia, Brazil, New Zealand, Hoa Kỳ...).
-
Về các biện pháp sinh học phòng trừ nấm Colletotrichum spp. tại Việt Nam:
- Trần Thị Thu Thủy và cộng sự (2010) nghiên cứu khả năng kích kháng bệnh thán thư bằng calcium chlorid, chitosan và acid salicylic (SA) trên ớt, cà chua và dưa leo; xác định chitosan làm giảm kích thước vết bệnh, giảm sinh bào tử và gia tăng tích lũy polyphenol, còn SA ức chế nảy mầm bào tử và đĩa áp, tăng tích tụ callose.
- Nguyễn Thụy Đan Huyền và cộng sự (2013) xử lý nấm C. gloeosporioides hại ớt bằng oligochitosan 0,05%, ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của bào tử sau 20 giờ và hạn chế mở rộng đường kính vết bệnh sau thu hoạch.
- Lê Thanh Long và cộng sự (2015) khảo sát nano chitosan kháng C. acutatum L2 hại cà chua; nồng độ 1,6 g/L ức chế 100% sinh trưởng tơ nấm in vitro, và 4 g/L ức chế 76% đường kính vết bệnh in vivo sau 10 ngày.
- Trần Ngọc Hùng và Nguyễn Thị Liên Thương (2016) phân lập 16 loài Trichoderma spp. tại Bình Dương, tuyển chọn 3 chủng có hoạt tính đối kháng tốt, làm giảm 58,4% bệnh thán thư trên trái ớt so với đối chứng.
-
Về chế tạo và ứng dụng oligochitosan, nano silica và vật liệu nano:
- Allan và Hadwiger (1979) lần đầu chứng minh hoạt tính kháng nấm của chitosan.
- Vellingiri và cộng sự (2013) tổng hợp nano chitosan (5–180 nm) kháng khuẩn Staphylococcus aureus.
- Trần Xuân Mậu (2015) cắt mạch chitosan bằng $H_2O_2$ tạo oligochitosan (3–30,4 kDa) kích thích nảy mầm hạt lúa.
- Lê Văn Hai và cộng sự (2013) tổng hợp nano silica vô định hình kích thước 15 nm từ tro vỏ trấu qua phản ứng sol-gel; Nguyễn Trí Tuấn và cộng sự (2014) kết tủa nano silica 15 nm từ tro trấu bằng NaOH 3N và HCl ở pH 6.
- Witoon và Chareonpanich (2012), Al-Mulla và Al-Sagheer (2013), Budnyak và cộng sự (2015), Sun và cộng sự (2016) phân tích tương tác cấu trúc giữa chitosan và silica (TEOS, $SiO_x$) ở các dải pH khác nhau.
- Nhóm nghiên cứu VINAGAMMA phối hợp Viện Nghiên cứu Mía đường và Viện Lúa ĐBSCL chứng minh oligochitosan 30 ppm giảm chỉ số bệnh than trên mía (Ustilago scitaminea) xuống 44,5% và bệnh thối đỏ (Colletotrichum falcatum) xuống 72,3%, nâng năng suất mía từ 63,24 lên 71,38 tấn/ha.
- Meng và cộng sự (2010) trên cây lê; Asgar Ali trên đu đủ sau thu hoạch; Võ Thị Mai Hương và Trần Thị Kim Cúc (2012) dùng COS 100–150 ppm tăng năng suất lạc 20,70%; Lê Quang Luân (2014) dùng nano bạc–chitosan (5–15 nm) trừ Phytophthora capsici trên hồ tiêu; Domiciano và cộng sự (2015) chứng minh bổ sung 2 mM Si giúp lúa kháng bệnh đạo ôn (Pyricularia oryzae) và giảm 34% bệnh thán thư (C. lindemuthianum) trên đậu.
Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu riêng rẽ về chitosan hoặc silica, việc kết hợp phương pháp chiếu xạ gamma với xử lý hóa chất nồng độ thấp ($H_2O_2$) nhằm cắt mạch chitosan có kiểm soát để thu nhận các phân đoạn oligochitosan có trọng lượng phân tử nhỏ xác định (< 10 kDa) vẫn chưa được hoàn thiện đồng bộ. Đồng thời, việc phối trộn oligochitosan trọng lượng phân tử thấp với nano silica có nguồn gốc sinh học từ vỏ trấu để tạo nên một hệ vật liệu lai nano composite bền vững ở môi trường gần trung tính (pH ~ 7,5), có khả năng kích kháng bệnh thán thư do C. truncatum trên cây ớt chỉ thiên từ quy mô phòng thí nghiệm, nhà màng đến ngoài đồng ruộng là khoảng trống nghiên cứu trọng tâm mà luận án giải quyết.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
[Vật liệu Oligochitosan + Nano Silica]
[Kích hoạt cơ chế đề kháng tự nhiên của thực vật]
[Kiểm soát và ức chế nấm Colletotrichum spp. hại ớt]
-
Cơ chế đề kháng ở thực vật:
- Cấu trúc mô học: Hình thành lớp vách tế bào mới bao quanh vết thương; lignin hóa vách tế bào; hình thành cấu trúc papillae (vách dày) ngay bên dưới giác bám (đĩa áp) của nấm nhằm cản trở sự xâm nhập cơ học; tích tụ hợp chất phenol dẫn đến phản ứng siêu mẫn cảm (tự chết tế bào) để cô lập mầm bệnh.
- Sinh hóa học: Tiết các hợp chất kháng sinh thực vật tự nhiên (phytoanticipins và phytoalexins); sản sinh các protein liên quan đến bệnh (Pathogenesis-Related proteins - PR gồm 18 họ, tiêu biểu là PR-1, PR-2 [$\beta$-1,3-glucanase], PR-3 [chitinase], PR-4, PR-5, PR-8, PR-11) giúp thủy phân vách tế bào nấm; kích hoạt các enzyme chuyển hóa quan trọng gồm phenylalanine ammonia lyase (PAL - thúc đẩy tổng hợp polyphenol và lignin) và peroxidase (khử $H_2O_2$ dư thừa, phối hợp với PAL trong quá trình hóa gỗ vách tế bào).
- Mạng lưới truyền tín hiệu: Tín hiệu Salicylic Acid (SA) điều hòa tính kháng thu được mang tính hệ thống (SAR - Systemic Acquired Resistance) qua các phân tử trung gian như NPR1, DIR1, MED15, MED16; tín hiệu Jasmonic Acid (JA) và Ethylene (ET) điều hòa tính kháng cảm ứng hệ thống (ISR - Induced Systemic Resistance) qua phức hệ jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile) và các tiểu đơn vị MED8, MED16, MED25.
-
Cơ chế kích kháng của Chitin/Oligochitosan và Silic:
- Oligochitosan: Hoạt động như một phân tử mẫu nhận diện mầm bệnh (PAMP/MAMP), liên kết với các thụ quan bề mặt màng tế bào gồm CEBiP và CERK1, kích hoạt chuỗi phosphoryl hóa kinase nội bào RLCK185 và MAPKK, mở đường cho phản ứng miễn dịch PTI (PAMP-Triggered Immunity).
- Silic/Nano silica: Vừa đóng vai trò rào cản vật lý (lắng đọng thành lớp màng silica vô định hình dày bên dưới tầng cutin biểu bì và tạo phức hợp Si-cellulose/lignin-carbohydrate ngăn cản enzyme phân giải của nấm), vừa đóng vai trò điều biến sinh hóa (làm gia tăng hoạt tính các enzyme chống oxy hóa SOD, APX, GR, LOX, CAT và enzyme phòng vệ PAL, peroxidase, chitinase, $\beta$-1,3-glucanase).
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
-
Phương pháp phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của nấm:
- Thu thập mẫu bệnh thán thư trên các bộ phận lá, thân và trái ớt tại Củ Chi, Tân Châu và Thanh Bình.
- Phân lập và làm thuần nấm trên môi trường PDA ở $25^\circ\text{C}$.
- Khảo nghiệm độc lực theo nguyên tắc Koch (Koch's postulates):
- Thí nghiệm in vitro: Lây nhiễm trên trái chín đỏ và lá thứ 5 (thu từ cây 40 ngày tuổi) theo phương pháp nhỏ giọt dịch bào tử nồng độ $10^6\text{ bào tử/mL}$ (thể tích $20\ \mu\text{L}$ đối với mẫu có tạo vết thương bằng kim vô trùng và mẫu không tạo vết thương). Bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 3 lần lặp lại, mỗi ô cơ sở gồm 10 lá/trái.
- Thí nghiệm nhà màng: Phun trực tiếp dịch bào tử nồng độ $10^7\text{ bào tử/mL}$ (thể tích $20\text{ mL/cây}$) lên cây con giai đoạn 6–9 lá thật, giữ ẩm và ủ tối 24 giờ. Bố trí kiểu CRD, 3 lần lặp lại, 30 cây/ô cơ sở.
- Mật số bào tử được xác định bằng buồng đếm hồng cầu theo công thức:
$$D = \frac{4000 \times a \times 10^3 \times 10^{-n}}{b}$$
(Trong đó: $D$ là số bào tử/mL; $a$ là số bào tử trong 16 ô lớn; $b$ là số ô con [400 ô]; $n$ là nồng độ pha loãng).
-
Phương pháp xác định tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh:
- Đánh giá theo thang phân cấp bệnh tiêu chuẩn QCVN 01-160:2014/BNNPTNT (Cấp 1: $\le 5%$ diện tích; Cấp 3: $> 5 - 15%$; Cấp 5: $> 15 - 25%$; Cấp 7: $> 25 - 50%$; Cấp 9: $> 50%$ diện tích bị bệnh).
- Tính toán chỉ số theo công thức của Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998):
$$\text{Tỷ lệ bệnh (TLB, %)} = \frac{\text{Số lá (trái) bị bệnh}}{\text{Tổng số lá (trái) theo dõi}} \times 100$$
$$\text{Chỉ số bệnh (CSB, %)} = \frac{\sum (a \times b)}{N \times T} \times 100$$
(Trong đó: $a$ là số lá/trái bị bệnh ở mỗi cấp; $b$ là trị số cấp bệnh tương ứng; $N$ là tổng số lá/trái theo dõi; $T$ là trị số cấp bệnh cao nhất [$T = 9$]).
-
Phương pháp định danh nấm:
- Định danh hình thái: Nuôi cấy lát mỏng trên lame (slide culture technique) trên môi trường PDA ở $25^\circ\text{C}$ trong 7 ngày, quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần để đo đạc kích thước (dài $\times$ rộng) của 30 bào tử phân sinh, 30 giác bám và tỷ lệ nảy mầm của 100 bào tử; đối chiếu khóa phân loại của Sutton (1992).
- Định danh phân tử: Tách chiết DNA của 6 mẫu phân lập có độc lực cao nhất (TN-Tr2, HCM-Tr2, ĐT-TH1, TN-TH1, HCM-L2, TN-L3), khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chuyên biệt và giải trình tự gen, so sánh độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
-
Phương pháp chế tạo và đặc trưng vật liệu:
- Oligochitosan: Cắt mạch chitosan nguyên liệu ($M_w \approx 110,4\text{ kDa}$, độ deacetyl 93,2%) bằng phương pháp chiếu xạ chùm tia gamma Co-60 trên dung dịch chitosan 4% hoặc 2% có bổ sung $0,5%\ H_2O_2$.
- Nano silica: Vỏ trấu được xử lý hóa học sơ bộ bằng dung dịch HCl để loại bỏ tạp chất khoáng, sau đó nung/thiêu kết kiểm soát nhiệt độ để thu hồi silica vô định hình độ tinh khiết cao.
- Oligochitosan-silica nano: Phối trộn oligochitosan khối lượng phân tử thấp và nano silica, sử dụng chất ổn định/chất làm đặc Hydroxyethyl cellulose (HEC) 1% để điều chỉnh và duy trì hệ keo bền vững ở $\text{pH} \approx 7,5$.
- Đặc trưng cấu trúc: Phân tích khối lượng phân tử ($M_w$), hình thái kích thước hạt qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), quét (SEM), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), nhiễu xạ tia X (XRD).
Nội dung chính theo từng chương
Luận án được tổ chức thành 4 nội dung nghiên cứu thực nghiệm tuần tự:
Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lập và định danh bằng hình thái, đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.)
Đề tài đã thu thập và mã hóa thành công 20 mẫu bệnh thán thư từ các vùng canh tác ớt trọng điểm tại Nam Bộ (chi tiết phân bố tại Bảng 1).
| STT |
Mã ký hiệu mẫu |
Bộ phận gây hại thu thập |
Địa điểm thu thập mẫu |
| 1 |
TN-Tr1 |
Trái |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 2 |
TN-Tr2 |
Trái |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 3 |
TN-Tr3 |
Trái |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 4 |
TN-Tr4 |
Trái |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 5 |
TN-L1 |
Lá |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 6 |
TN-L2 |
Lá |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 7 |
TN-L3 |
Lá |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 8 |
TN-Th1 |
Thân |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 9 |
TN-Th2 |
Thân |
Tân Châu – Tây Ninh |
| 10 |
HCM-Tr1 |
Trái |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 11 |
HCM-Tr2 |
Trái |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 12 |
HCM-Tr3 |
Trái |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 13 |
HCM-Tr4 |
Trái |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 14 |
HCM-Tr5 |
Trái |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 15 |
HCM-L1 |
Lá |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 16 |
HCM-L2 |
Lá |
Củ Chi – TP. Hồ Chí Minh |
| 17 |
ĐT-Tr1 |
Trái |
Thanh Bình – Đồng Tháp |
| 18 |
ĐT-Tr2 |
Trái |
Thanh Bình – Đồng Tháp |
| 19 |
ĐT-Tr3 |
Trái |
Thanh Bình – Đồng Tháp |
| 20 |
ĐT-Th1 |
Thân |
Thanh Bình – Đồng Tháp |
Kết quả khảo sát khả năng gây bệnh in vitro và trong nhà màng cho thấy tất cả 20 mẫu phân lập đều có khả năng tái nhiễm và gây triệu chứng hoại tử đặc trưng của bệnh thán thư trên các bộ phận lá, thân và trái ớt. Dựa trên độc lực cao nhất và tính chuyên biệt gây hại trên các mô bào, 6 mẫu phân lập đại diện gồm TN-Tr2, HCM-Tr2, ĐT-TH1, TN-TH1, HCM-L2 và TN-L3 đã được lựa chọn để phân tích sinh học phân tử. Đa số các mẫu phân lập được định danh thuộc về các loài nấm thán thư phổ biến, trong đó chiếm ưu thế là Colletotrichum truncatum (gây hại nghiêm trọng trên trái và thân) và Colletotrichum gloeosporioides.
Nội dung 2: Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano
- Chế tạo oligochitosan: Bằng phương pháp chiếu xạ gamma kết hợp xử lý oxy hóa nhẹ ($0,5%\ H_2O_2$), tác giả đã cắt mạch thành công chitosan nguyên liệu ($M_w \approx 110,4\text{ kDa}$) thành 3 phân đoạn oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ: 7,7 kDa, 4,6 kDa và 2,5 kDa. Quá trình này giúp giảm đáng kể liều chiếu xạ cần thiết, hạn chế sự biến tính phân tử và duy trì độ deacetyl hóa cao.
- Tổng hợp nano silica: Hạt nano silica thu được từ quá trình thiêu kết vỏ trấu đã xử lý acid HCl đạt cấu trúc vô định hình, độ tinh khiết cao với kích thước hạt trung bình đạt 30 nm.
- Chế tạo phức hệ lai nano composite: Hỗn hợp oligochitosan-silica nano được phối chế tối ưu hóa với sự tham gia của chất làm đặc Hydroxyethyl cellulose (HEC) nồng độ 1%, tạo ra dung dịch keo đồng nhất, không bị sa lắng kết tủa và đạt độ bền nhiệt/hóa học cao ở dải pH gần trung tính ($\text{pH} \approx 7,5$).
Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm
- Thử nghiệm so sánh hoạt tính sinh học của các phân đoạn oligochitosan cho thấy phân đoạn có khối lượng phân tử 4,6 kDa ở nồng độ từ 0,5% đến 1% thể hiện hiệu lực kích kháng và ức chế sự phát triển của nấm bệnh thán thư (C. gloeosporioides và C. truncatum) cao nhất.
- Phức hệ oligochitosan-silica nano thể hiện tác động kép: vừa làm giảm tỷ lệ nảy mầm và ức chế kéo dài ống mầm của bào tử nấm, vừa kích hoạt phản ứng tự vệ tế bào trên mô lá và trái ớt in vitro.
Nội dung 4: Đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và ngoài đồng
- Thực nghiệm trong điều kiện nhà màng:
- Được tiến hành từ tháng 03 đến tháng 09/2017 trên giá thể (70% mụn xơ dừa + 20% phân trùn quế + 10% tro trấu) với giống ớt TN 278. Điều kiện vi khí hậu trung bình ghi nhận: nhiệt độ dao động $31,2 - 34,2^\circ\text{C}$, ẩm độ không khí $58,6 - 64,5%$ (chi tiết tại Bảng 2).
| Thời gian (Tháng/Năm) |
Nhiệt độ không khí trung bình ($^\circ\text{C}$) |
Ẩm độ không khí trung bình (%) |
| 3/2017 |
33,5 |
59,1 |
| 4/2017 |
34,2 |
58,6 |
| 5/2017 |
33,4 |
59,2 |
| 6/2017 |
32,1 |
60,3 |
| 7/2017 |
31,7 |
62,6 |
| 8/2017 |
31,5 |
64,5 |
| 9/2017 |
31,2 |
61,8 |
- Thực nghiệm ngoài đồng ruộng:
- Tiến hành từ tháng 10 đến tháng 12/2017 trên nền đất xám phù sa tại TP.HCM (chi tiết thành phần lý hóa đất tại Bảng 3 và thời tiết tại Bảng 4).
| Chỉ tiêu phân tích lý hóa đất |
Giá trị ghi nhận |
Đơn vị đo |
| Thành phần cơ giới: Cát |
62,4 |
% |
| Thành phần cơ giới: Thịt |
28,6 |
% |
| Thành phần cơ giới: Sét |
9,0 |
% |
| $\text{pH}_{\text{H}_2\text{O}}$ |
5,3 |
- |
| Dung tích hấp thu (CEC) |
2,1 |
meq/100g đất |
| Dung tích trao đổi chất hữu cơ (CHC) |
3,3 |
% |
| Đạm tổng số ($N_{ts}$) |
786 |
mg/kg |
| Lân tổng số ($P_{ts}$) |
336 |
mg/kg |
| Kali tổng số ($K_{ts}$) |
772 |
mg/kg |
| Lân dễ tiêu ($P_{dt}$) |
12,6 |
mg/100g đất |
| Kali dễ tiêu ($K_{dt}$) |
8,5 |
mg/100g đất |
| Thời gian (Tháng/Năm) |
Nhiệt độ trung bình ($^\circ\text{C}$) |
Tổng giờ nắng (giờ) |
Tổng lượng mưa (mm) |
Độ ẩm trung bình (%) |
| 10/2017 |
28,0 |
140,8 |
574,6 |
79,0 |
| 11/2017 |
28,0 |
147,0 |
223,3 |
77,0 |
| 12/2017 |
27,4 |
155,2 |
75,6 |
70,0 |
- Kết quả kiểm soát bệnh thán thư in vivo:
Trong cả hai điều kiện canh tác (nhà màng và ngoài đồng ruộng), hiệu lực kích kháng giảm thiểu tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh do nấm C. truncatum gây ra trên cây ớt đạt kết quả tối ưu khi phun định kỳ qua lá với các công thức:
- Oligochitosan đơn lẻ: Nồng độ 25 ppm;
- Nano silica đơn lẻ: Nồng độ 50 – 100 ppm;
- Phức hệ oligochitosan-silica nano: Nồng độ 50 ppm.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận khoa học
- Cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống về sự đa dạng thành phần loài và độc lực của tập đoàn nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh phía Nam Việt Nam (Tây Ninh, Đồng Tháp, TP.HCM).
- Xác lập cơ sở khoa học về tỷ lệ phối trộn tối ưu giữa oligochitosan khối lượng phân tử thấp và nano silica vô định hình; làm sáng tỏ điều kiện môi trường ($\text{pH} \approx 7,5$ kết hợp chất trợ phân tán HEC 1%) để duy trì trạng thái phân tán keo bền vững của phức hệ lai nano sinh học.
- Bổ sung dẫn liệu thực nghiệm về cơ chế kích thích tính kháng hệ thống (kết hợp rào cản vật lý từ silica và kích hoạt tín hiệu phòng vệ sinh hóa từ oligochitosan) khi xử lý qua đường phun lá trên cây ớt.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và công nghệ
- Hoàn thiện quy trình công nghệ tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ xác định (7,7 kDa; 4,6 kDa và 2,5 kDa) bằng kỹ thuật chiếu xạ gamma Co-60 trên nền dung dịch chitosan 2–4% bổ sung $0,5%\ H_2O_2$, có khả năng triển khai ứng dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp.
- Hoàn thiện quy trình điều chế hạt nano silica kích thước 30 nm, độ tinh khiết cao bằng phương pháp xử lý acid HCl và thiêu kết tận dụng nguồn phế phụ phẩm vỏ trấu nông nghiệp, giúp hạ giá thành sản xuất.
- Chế tạo thành công chế phẩm nano composite oligochitosan-silica nano ổn định ở pH trung tính, thuận lợi cho việc bảo quản và phối trộn nông hóa phẩm.
- Xác lập liều lượng sử dụng tối ưu trong thực tế sản xuất: phun chế phẩm oligochitosan-silica nano ở nồng độ 50 ppm (hoặc oligochitosan 25 ppm, nano silica 50–100 ppm) để phòng trừ hiệu quả bệnh thán thư do nấm C. truncatum trên giống ớt chỉ thiên TN 278 tại Thành phố Hồ Chí Minh.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế của nghiên cứu:
- Phạm vi khảo nghiệm sinh học ngoài đồng ruộng và nhà màng mới tập trung chủ yếu trên đối tượng giống ớt chỉ thiên TN 278 tại khu vực Thành phố Hồ Chí Minh và phụ cận.
- Các thử nghiệm kích kháng in vivo chuyên sâu chủ yếu tập trung đánh giá hiệu lực đối kháng đối với loài nấm chiếm ưu thế là Colletotrichum truncatum.
- Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Mở rộng phạm vi khảo nghiệm chế phẩm oligochitosan-silica nano 50 ppm trên nhiều giống ớt thương phẩm khác nhau và trên các loại cây trồng nhiệt đới khác (cây có múi, xoài, thanh long, rau màu).
- Đánh giá phổ tác động kích kháng của chế phẩm đối với các loài nấm thán thư khác trong phức hợp Colletotrichum spp. (C. gloeosporioides, C. acutatum, C. capsici, C. scovillei) cũng như các đối tượng vi nấm gây hại tồn lưu trong đất.
- Thử nghiệm hoàn thiện dạng bào chế thương phẩm quy mô pilot phục vụ chuyển giao công nghệ vào sản xuất nông nghiệp công nghệ cao.
Giá trị tham khảo
-
Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà khoa học:
- Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp định danh hình thái kết hợp chỉ thị sinh học phân tử đối với phức hợp nấm Colletotrichum spp. hại thực vật.
- Tài liệu chuẩn mực về kỹ thuật bức xạ cắt mạch polymer sinh học (chitosan) và quy trình sol-gel/thiêu kết chuyển hóa phụ phẩm vỏ trấu thành vật liệu nano silica.
- Phương pháp luận bố trí thí nghiệm đánh giá độc lực theo nguyên tắc Koch và các mô hình thử nghiệm kích kháng in vitro, nhà màng, ngoài đồng ruộng.
-
Đối với cơ quan quản lý nông nghiệp và doanh nghiệp chế phẩm sinh học:
- Cơ sở khoa học để xây dựng quy trình canh tác ớt an toàn sinh học, giảm thiểu việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học.
- Giải pháp công nghệ tái sử dụng nguồn thải vỏ trấu trong chuỗi giá trị lúa gạo để sản xuất vật liệu nano giá trị cao ứng dụng trong nông nghiệp xanh.
Câu hỏi thường gặp
1. Phân đoạn oligochitosan nào cho hiệu quả kích kháng tốt nhất và được tạo ra bằng phương pháp gì?
Phân đoạn oligochitosan có khối lượng phân tử 4,6 kDa ở nồng độ 0,5% – 1% mang lại hiệu quả kích kháng nấm thán thư cao nhất. Phân đoạn này được tạo ra bằng phương pháp chiếu xạ chùm tia gamma Co-60 trên dung dịch chitosan 2% hoặc 4% có bổ sung chất oxy hóa $H_2O_2$ nồng độ 0,5% từ nguyên liệu chitosan vỏ tôm ($M_w \approx 110,4\text{ kDa}$, độ deacetyl 93,2%).
2. Vật liệu nano silica trong luận án được tổng hợp từ nguồn nào và có đặc tính ra sao?
Nano silica được điều chế từ nguồn phế phẩm vỏ trấu thu thập ngẫu nhiên từ nhà máy chế biến lúa gạo tại Cần Thơ. Quy trình thực hiện gồm bước xử lý hóa học sơ bộ bằng dung dịch acid HCl nhằm loại bỏ tạp chất khoáng vô cơ, sau đó tiến hành thiêu kết nung nhiệt để thu nhận hạt nano silica vô định hình có độ tinh khiết cao với kích thước trung bình đạt 30 nm.
3. Giải pháp nào giúp phức hệ oligochitosan-silica nano duy trì được độ ổn định ở pH gần trung tính?
Thông thường khi phối trộn chitosan và silica ở pH tăng cao hỗn hợp sẽ dễ bị kết tủa nhanh. Tác giả luận án đã giải quyết vấn đề này bằng cách bổ sung chất làm đặc/trợ phân tán Hydroxyethyl cellulose (HEC) nồng độ 1%, giúp hệ keo lai oligochitosan-silica nano đạt trạng thái phân tán đồng nhất và ổn định ở mức $\text{pH} \approx 7,5$.
4. Liều lượng phun tối ưu của các chế phẩm để kích kháng bệnh thán thư do C. truncatum trong nhà màng và ngoài đồng là bao nhiêu?
Hiệu quả kích kháng đạt mức tối ưu khi tiến hành phun định kỳ qua lá với các nồng độ:
- Phức hệ oligochitosan-silica nano: 50 ppm;
- Chế phẩm oligochitosan đơn lẻ: 25 ppm;
- Chế phẩm nano silica đơn lẻ: 50 – 100 ppm.
5. Luận án đã phân lập được bao nhiêu mẫu nấm bệnh và những mẫu nào được chọn để định danh phân tử?
Tác giả đã phân lập được 20 mẫu nấm bệnh thán thư từ các ruộng ớt tại Củ Chi (TP.HCM), Tân Châu (Tây Ninh) và Thanh Bình (Đồng Tháp). Sáu mẫu phân lập có độc lực cao và tính chuyên biệt gây hại mạnh trên các bộ phận lá, thân, trái được chọn để giải trình tự DNA định danh loài là: TN-Tr2, HCM-Tr2, ĐT-TH1, TN-TH1, HCM-L2 và TN-L3.
Kết luận
Luận án đã hoàn thiện thành công quy trình công nghệ điều chế các phân đoạn oligochitosan khối lượng phân tử thấp (tiêu biểu là 4,6 kDa) bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 kết hợp $H_2O_2$ và tổng hợp hạt nano silica vô định hình 30 nm từ vỏ trấu. Phức hệ lai nano composite oligochitosan-silica nano được chế tạo thành công với độ bền vững cao ở pH 7,5 nhờ bổ sung chất làm đặc HEC 1%. Kết quả thử nghiệm trên giống ớt chỉ thiên TN 278 khẳng định việc phun chế phẩm oligochitosan-silica nano ở nồng độ 50 ppm (hoặc oligochitosan 25 ppm, nano silica 50–100 ppm) mang lại hiệu quả cao trong việc kích hoạt tính kháng tự nhiên, kiểm soát bệnh thán thư do nấm Colletotrichum truncatum trong điều kiện nhà màng và ngoài đồng ruộng tại Thành phố Hồ Chí Minh.
