Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia)

Cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia), hay còn gọi là cây Bá Bệnh, là một dược liệu quý hiếm với nhiều công… 70 trang · Trường Đại học Nguyễn Tất Thành · 2017.

• Tác giả: Nguyễn Thị Yến Nhi
• Người hướng dẫn: ThS. Đỗ Tiến Vinh
• Trường học: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia)
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• DANH SÁCH BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Mục tiêu đề tài
• 0.2. Nội dung thực hiện
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cây Mật Nhân
• 1.2. Phân loại khoa học
• 1.3. Phân bố sinh học
• 1.4. Đặc điểm sinh trưởng
• 1.5. Đặc điểm hình thái
• 1.6. Thành phần hóa học
• 1.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.7.1. Các nghiên cứu trong nước
• 1.7.2. Các nghiên cứu ngoài nước
• 1.8. Nuôi cấy mô sẹo
• 1.8.1. Cảm ứng tạo mô sẹo
• 1.8.2. Nguyên tắc nuôi cây mô sẹo
• 1.8.3. Đặc điểm của quá trình nuôi cấy mô sẹo
• 1.8.4. Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô sẹo
• 1.8.5. Ứng dụng của mô sẹo
• 1.8.6. Quá trình nuôi cấy mô sẹo
• 1.8.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô sẹo
• 1.8.7.1. Mẫu cấy - nguyên liệu ban đầu
• 1.8.7.2. Điều kiện nuôi cấy
• 1.8.7.3. Thành phần môi trường nuôi cấy mô sẹo
• 1.8.7.3.1. Các chất khoáng
• 1.8.7.3.2. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
• 1.8.7.3.3. Các chất bổ sung vào môi trường
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Điều kiện nuôi cây
• 2.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.4. Điều kiện nuôi cấy
• 2.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 2.5.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 2.6. Thiết kế thí nghiệm
• 2.7. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Sơ đồ nghiên cứu
• 2.7.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.7.3. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ javel và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu cấy cây Mật Nhân
• 2.7.4. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo mô sẹo cây Mật Nhân
• 2.7.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo cây Mật Nhân
• 2.7.6. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp BA đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân
• 2.7.7. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng các chất bổ trợ đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân
• 2.8. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
• 2.8.1. Phương pháp thu thập
• 2.8.2. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ javel và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu cấy cây Mật Nhân
• 3.2. Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả năng tạo mô sẹo cây Mật Nhân
• 3.3. Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo cây Mật Nhân
• 3.4. Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp BA đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân
• 3.5. Kết quả thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng các chất bổ trợ đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Nuôi Cấy Mô Sẹo Cây Mật Nhân Quý Hiếm

Cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia), hay còn gọi là cây Bá Bệnh, là một dược liệu quý hiếm với nhiều công dụng chữa bệnh. Do khai thác quá mức và tốc độ phát triển chậm, nguồn Mật Nhân tự nhiên ngày càng khan hiếm. Nuôi cấy mô sẹo là một giải pháp tiềm năng để bảo tồn và khai thác nguồn dược liệu này một cách bền vững. Kỹ thuật này cho phép nhân giống nhanh, tạo sinh khối lớn và thu nhận các hợp chất thứ cấp mà không ảnh hưởng đến nguồn tài nguyên rừng. Nghiên cứu in vitro Mật Nhân mở ra hướng đi mới trong việc phát triển dược liệu, giảm áp lực lên khai thác tự nhiên. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi (2017), mục tiêu là xác định thành phần chất điều hòa sinh trưởng và các chất bổ trợ để tối ưu hóa quá trình tạo mô sẹo và nhân sinh khối. Đây là bước quan trọng để ứng dụng công nghệ sinh học thực vật vào bảo tồn và phát triển Mật Nhân.

1.1. Giới thiệu chung về cây Mật Nhân Eurycoma longifolia

Cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia) là một loại cây dược liệu quý, được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như Bá Bệnh, Bách Bệnh. Cây phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, bao gồm Indonesia, Malaysia và Việt Nam. Các bộ phận của cây, đặc biệt là rễ, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh. Nghiên cứu khoa học đã chứng minh các tác dụng dược lý của Mật Nhân, bao gồm tăng cường sinh lý nam giới, giảm stress và tăng cường hệ miễn dịch. Do đó, việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu này là vô cùng quan trọng.

1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô sẹo trong bảo tồn Mật Nhân

Nuôi cấy mô sẹo là một kỹ thuật quan trọng trong bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu quý hiếm như Mật Nhân. Kỹ thuật này cho phép nhân giống vô tính nhanh chóng, tạo ra số lượng lớn cây con từ một mẫu nhỏ. Ngoài ra, nuôi cấy mô sẹo còn giúp bảo tồn nguồn gen của các cá thể Mật Nhân quý hiếm, đặc biệt là những cây có đặc tính dược lý vượt trội. Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô giúp giảm áp lực khai thác từ tự nhiên, đồng thời đảm bảo nguồn cung dược liệu ổn định và chất lượng.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Nuôi Cấy Mô Sẹo Mật Nhân Hiện Nay

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo Mật Nhân vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Tỷ lệ thành công trong tạo mô sẹo và nhân sinh khối còn thấp, đòi hỏi phải tối ưu hóa các yếu tố môi trường và thành phần dinh dưỡng. Việc xác định các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp và nồng độ tối ưu là rất quan trọng. Bên cạnh đó, việc kiểm soát ô nhiễm và duy trì tính ổn định di truyền của mô sẹo cũng là những vấn đề cần được giải quyết. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi (2017) tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của nồng độ javel và thời gian khử trùng để tạo mẫu cấy sạch bệnh, cũng như ảnh hưởng của NAA và 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô sẹo là chìa khóa để ứng dụng thành công kỹ thuật này vào sản xuất dược liệu.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo mô sẹo Mật Nhân

Quá trình tạo mô sẹo ở cây Mật Nhân chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện ánh sáng và nhiệt độ. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp, bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết và điều chỉnh nồng độ hormone thực vật là rất quan trọng để kích thích sự hình thành mô sẹo. Ngoài ra, các yếu tố môi trường như ánh sáng và nhiệt độ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự phát triển tối ưu của mô sẹo.

2.2. Khó khăn trong việc duy trì sinh khối và chất lượng mô sẹo

Việc duy trì sinh khối và chất lượng mô sẹo trong quá trình nuôi cấy mô là một thách thức lớn. Mô sẹo có thể bị thoái hóa, mất khả năng sinh trưởng hoặc tích lũy các hợp chất thứ cấp không mong muốn. Để khắc phục vấn đề này, cần phải thường xuyên cấy chuyền mô sẹo sang môi trường mới, điều chỉnh thành phần dinh dưỡng và bổ sung các chất bảo vệ. Ngoài ra, việc kiểm soát ô nhiễm và duy trì điều kiện vô trùng cũng là rất quan trọng để đảm bảo sự phát triển ổn định của mô sẹo.

III. Phương Pháp Tối Ưu Tạo Mô Sẹo Mật Nhân NAA và 2 4 D

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi (2017) đã khảo sát ảnh hưởng của NAA (axit α-naphthaleneacetic) và 2,4-D (axit 2,4-dichlorophenoxyacetic) đến khả năng tạo mô sẹo của cây Mật Nhân. Kết quả cho thấy NAA ở nồng độ 1 mg/l là thích hợp để tạo mô sẹo. Việc kết hợp NAA với BA (6-benzylaminopurine) cũng cho thấy hiệu quả trong việc tăng sinh khối mô sẹo. Các chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phân chia và biệt hóa tế bào, từ đó thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo. Hormone thực vật trong nuôi cấy mô cần được điều chỉnh phù hợp với từng giai đoạn phát triển của mô sẹo để đạt hiệu quả tối ưu.

3.1. Vai trò của NAA trong kích thích tạo mô sẹo Mật Nhân

NAA là một loại auxin tổng hợp, có vai trò quan trọng trong kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ trong nuôi cấy mô thực vật. Trong nghiên cứu về cây Mật Nhân, NAA được sử dụng để kích thích sự hình thành mô sẹo từ các mẫu cấy lá. Nồng độ NAA tối ưu có thể khác nhau tùy thuộc vào loại mô và điều kiện nuôi cấy, nhưng thường nằm trong khoảng từ 0.5 đến 2 mg/l.

3.2. So sánh hiệu quả của 2 4 D và NAA trong tạo mô sẹo

Cả 2,4-D và NAA đều là các loại auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô sẹo. Tuy nhiên, chúng có cơ chế tác động và hiệu quả khác nhau. 2,4-D thường được sử dụng để tạo mô sẹo có cấu trúc lỏng lẻo, trong khi NAA thường tạo ra mô sẹo có cấu trúc chặt chẽ hơn. Việc lựa chọn loại auxin phù hợp phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu và đặc tính của loài cây. Trong trường hợp cây Mật Nhân, NAA cho thấy hiệu quả tốt hơn trong việc tạo mô sẹo.

IV. Bí Quyết Tăng Sinh Khối Mô Sẹo Mật Nhân NAA và BA

Để tăng sinh khối mô sẹo Mật Nhân, nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi (2017) đã chỉ ra rằng việc kết hợp NAA và BA là một giải pháp hiệu quả. Nồng độ NAA 1 mg/l kết hợp với BA 1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong việc tăng sinh khối tế bào mô sẹo. BA là một loại cytokinin, có vai trò quan trọng trong kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin giúp cân bằng sự phát triển của mô sẹo, từ đó tăng sinh khối một cách hiệu quả. Sản xuất sinh khối Mật Nhân thông qua nuôi cấy mô sẹo mở ra tiềm năng lớn trong việc cung cấp nguồn dược liệu ổn định.

4.1. Tác động hiệp đồng của NAA và BA lên sinh khối mô sẹo

NAA và BA có tác động hiệp đồng lên sinh khối mô sẹo. NAA kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ, trong khi BA kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Khi kết hợp hai loại hormone này, chúng tạo ra một sự cân bằng trong quá trình phát triển của mô sẹo, giúp tăng sinh khối một cách hiệu quả. Tỷ lệ NAA và BA cần được điều chỉnh phù hợp để đạt được hiệu quả tối ưu.

4.2. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến tăng sinh khối mô sẹo

Ngoài NAA và BA, còn có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến tăng sinh khối mô sẹo, bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện ánh sáng và nhiệt độ. Môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của mô sẹo. Ánh sáng và nhiệt độ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự phát triển tối ưu của mô sẹo. Việc bổ sung vitamin và các chất hữu cơ khác cũng có thể giúp tăng sinh khối mô sẹo.

V. Ứng Dụng Vitamin B1 Trong Nuôi Cấy Mô Sẹo Cây Mật Nhân

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi (2017) cũng đã khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ trợ đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo Mật Nhân. Kết quả cho thấy nồng độ vitamin B1 10 mg/l là thích hợp để tăng sinh khối tế bào mô sẹo. Vitamin B1 (thiamine) là một chất dinh dưỡng quan trọng, tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất trong tế bào. Việc bổ sung vitamin B1 vào môi trường nuôi cấy giúp cải thiện sự phát triển của mô sẹo, từ đó tăng sinh khối. Môi trường nuôi cấy mô sẹo cần được tối ưu hóa để đảm bảo sự phát triển tốt nhất của mô sẹo.

5.1. Vai trò của vitamin B1 trong quá trình trao đổi chất của tế bào

Vitamin B1 (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào, đặc biệt là trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Thiamine pyrophosphate (TPP), một dạng hoạt động của vitamin B1, là coenzyme của nhiều enzyme quan trọng trong chu trình Krebs và con đường pentose phosphate. Việc bổ sung vitamin B1 giúp cải thiện quá trình trao đổi chất của tế bào, từ đó tăng cường sự phát triển và sinh trưởng của mô sẹo.

5.2. Các chất bổ trợ khác có tiềm năng trong nuôi cấy mô sẹo

Ngoài vitamin B1, còn có nhiều chất bổ trợ khác có tiềm năng trong nuôi cấy mô sẹo, bao gồm các vitamin khác (như vitamin B5, vitamin C), amino acid, và các chất hữu cơ khác. Các chất này có thể giúp cải thiện sự phát triển của mô sẹo, tăng cường khả năng chống chịu stress và kích thích sự tích lũy các hợp chất thứ cấp. Việc nghiên cứu và ứng dụng các chất bổ trợ này có thể giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô sẹo và nâng cao hiệu quả sản xuất dược liệu.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Nuôi Cấy Mô Mật Nhân

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Yến Nhi (2017) đã cung cấp những thông tin quan trọng về việc nuôi cấy mô sẹo cây Mật Nhân. Việc xác định được nồng độ NAA và BA tối ưu, cũng như vai trò của vitamin B1 trong tăng sinh khối mô sẹo, là những đóng góp quan trọng cho lĩnh vực này. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, cải thiện chất lượng mô sẹo và tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu in vitro Mật Nhân cần tập trung vào việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để hiểu rõ hơn về cơ chế điều khiển quá trình tạo mô sẹo và tổng hợp các hợp chất có giá trị.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đã xác định được các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình tạo mô sẹo và tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân, bao gồm nồng độ NAA, BA và vitamin B1. Kết quả này có ý nghĩa thực tiễn trong việc phát triển quy trình nuôi cấy mô sẹo hiệu quả, giúp bảo tồn và khai thác nguồn dược liệu quý hiếm này một cách bền vững. Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô có thể giúp giảm áp lực khai thác từ tự nhiên và đảm bảo nguồn cung dược liệu ổn định.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và tiềm năng ứng dụng

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô sẹo, cải thiện chất lượng mô sẹo và tăng cường sản xuất các hợp chất thứ cấp. Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử có thể giúp hiểu rõ hơn về cơ chế điều khiển quá trình tạo mô sẹo và tổng hợp các hợp chất có giá trị. Ngoài ra, cần có thêm nghiên cứu về ứng dụng nuôi cấy mô sẹo Mật Nhân trong sản xuất dược liệu và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây Mật Nhân (danh pháp khoa học: Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae), còn được gọi trong dân gian là cây Bá Bệnh, Bách Bệnh hay Hậu Phác Nam, là một loài cây dược liệu quý phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á (Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam...). Các bộ phận của cây, đặc biệt là phần rễ và vỏ thân, chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao như các quassinoid (eurycomanone, eurycomanol, eurycomalactone, laurylactone A, B...), alkaloid nhóm canthin-6-one, triterpenoid và steroid. Các hoạt chất này có tác dụng tăng cường chức năng sinh lý và sinh sản ở nam giới thông qua việc thúc đẩy sản sinh testosterone tự nhiên, đồng thời hỗ trợ điều trị sốt rét (ức chế ký sinh trùng Plasmodium falciparum), kháng tế bào ung thư, chống oxy hóa, giảm căng thẳng và bảo vệ tế bào gan.

Tuy nhiên, trong tự nhiên, cây Mật Nhân sinh trưởng và phát triển rất chậm, hàm lượng hoạt chất thứ cấp tích lũy tự nhiên thấp. Tình trạng khai thác quá mức và mang tính tận diệt (đào rễ, bóc vỏ làm cây chết) kết hợp với quá trình đô thị hóa, thu hẹp diện tích rừng tự nhiên đã làm nguồn tài nguyên dược liệu này suy giảm nghiêm trọng. Phương pháp nhân giống truyền thống khó đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô công nghiệp. Trong bối cảnh đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro—cụ thể là cảm ứng tạo và tăng sinh khối mô sẹo (callus)—được xác định là giải pháp kỹ thuật nền tảng nhằm chủ động tạo nguồn sinh khối sạch, ổn định phục vụ nghiên cứu và chiết xuất hoạt chất thứ cấp mà không làm cạn kiệt tài nguyên rừng.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu: Xác định thành phần chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các chất bổ trợ thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo và nhân sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia).

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu cấy vô trùng từ lá cây Mật Nhân.
2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo.
3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo.
4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với BA đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân.
5. Khảo sát sự ảnh hưởng của các chất bổ trợ (nước dừa, vitamin B1, glycine) đến quá trình tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia Jack) thu nhận từ bộ sưu tập giống của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh (số 12 Nguyễn Văn Bảo, Phường 4, Quận Gò Vấp, TP. Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2017 đến tháng 07/2017.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (cellular totipotency) và quá trình phản phân hóa (dedifferentiation) của các tế bào mô lá chuyên hóa để hình thành khối tế bào nhu mô vô tổ chức (mô sẹo/callus) dưới tác động của vết thương cơ học và phytohormone ngoại sinh. Sự phân chia và sinh trưởng mô sẹo trải qua 5 pha sinh lý: pha ẩn (lag phase), pha lũy thừa (exponential phase), pha tuyến tính (linear phase), pha suy giảm (deceleration phase) và pha ổn định (stationary phase).

Hệ thống hóa chất và môi trường dinh dưỡng sử dụng:

• Môi trường khoáng cơ bản: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) chứa đầy đủ các muối khoáng đa lượng ($N, P, K, Ca, Mg, S$), vi lượng ($Mn, Fe, Zn, B, Cu, Mo, Co$), nguồn carbon (saccharose 20 g/l) và chất tạo đông (agar 8 g/l).
• Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV):
  • Nhóm auxin: $\alpha$-Naphthaleneacetic acid (NAA) và 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) đóng vai trò kích hoạt sự phân chia tế bào tầng phát sinh và giãn dài tế bào.
  • Nhóm cytokinin: 6-Benzylaminopurine (BA/BAP) kích thích tổng hợp protein, acid nucleic và thúc đẩy phân chia tế bào khi phối hợp với auxin.
• Chất bổ trợ hữu cơ và vitamin: Vitamin B1 (Thiamine HCl), Myo-inositol, Pyridoxine HCl (B6), Nicotinic acid (PP), amino acid (Glycine) và dịch chiết hữu cơ tự nhiên (nước dừa).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu được tiến hành bằng phương pháp thực nghiệm in vitro có đối chứng:

• Xử lý vô trùng mẫu: Mẫu lá được rửa sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy, khử trùng sơ bộ bằng cồn $70^\circ$ trong 1 phút, sau đó xử lý bằng dung dịch Javel thương phẩm ở các nồng độ và khoảng thời gian khác nhau, rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng và loại bỏ phần rìa mô hoại tử.
• Điều kiện nuôi cấy thực nghiệm: Môi trường được điều chỉnh pH về $5,8 - 6,0$, hấp khử trùng ở nhiệt độ $121^\circ\text{C}$, áp suất $1\text{ atm}$ trong 20 phút. Mẫu cấy được nuôi hoàn toàn trong điều kiện tối ở nhiệt độ phòng thí nghiệm ổn định $25 \pm 2^\circ\text{C}$.
• Đo lường và thu thập số liệu:
  • Tỷ lệ mẫu sống: $\text{Tỷ lệ sống (%)} = \frac{\text{Số mẫu sống}}{\text{Số mẫu vô trùng}} \times 100%$
  • Tỷ lệ mẫu vô trùng: $\text{Tỷ lệ vô trùng (%)} = \frac{\text{Số mẫu vô trùng}}{\text{Tổng số mẫu cấy ban đầu}} \times 100%$
  • Tỷ lệ tạo mô sẹo: $\text{Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)} = \frac{\text{Số mẫu tạo mô sẹo}}{\text{Tổng số mẫu cấy}} \times 100%$
  • Khối lượng sinh khối: Xác định khối lượng chất khô (g) của mô sẹo sau khi sấy khô kiệt đến khối lượng không đổi tại thời điểm kết thúc chu kỳ nuôi cấy (4 tuần).
• Thiết kế và xử lý thống kê: Các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (Completely Randomized Design - CRD), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (mỗi lần cấy 3 bình/chai). Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9, kiểm định sai biệt giữa các giá trị trung bình bằng trắc nghiệm phân hạng LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa $p < 0,01$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu và kỹ thuật nuôi cấy:

• Đặc điểm thực vật học và hóa học của cây Mật Nhân: Cung cấp vị trí phân loại học (giới Plantae, bộ Sapindales, họ Simaroubaceae, chi Eurycoma, loài E. longifolia Jack), hình thái học (cây gỗ trung bình cao 2–8 m, lá kép lông chim lẻ 10–36 đôi lá chét, hoa đơn tính khác gốc màu đỏ nâu) và sinh thái học (ưa đất cát chua, nghèo dinh dưỡng, độ cao dưới 700 m). Nêu chi tiết cấu trúc hóa học của 65 hợp chất phân lập từ rễ (các dẫn xuất quassinoid, alkaloid canthin-6-one, triterpenoid loại tirucallane).
• Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng thuật các nghiên cứu chiết xuất hóa học (Phạm Thị Như Hồng, 2006; Bùi Minh Nhuệ, 2012; Yusuf et al., 2013) và các công trình vi nhân giống, tái sinh chồi, rễ in vitro (Võ Châu Tuấn & Trần Quang Dần, 2013; Sobri Hussein et al., 2006, 2012; Nor Hasnida Hassan, 2012; Siregar, 2009).
• Lý luận về nuôi cấy mô sẹo thực vật: Phân tích nguyên tắc cảm ứng tạo callus, động học sinh trưởng tế bào, ưu điểm (chủ động, hệ số nhân cao, làm nguồn nuôi cấy huyền phù thu nhận dược chất) và hạn chế (nguy cơ biến dị soma, đòi hỏi kỹ thuật cao), cùng vai trò của từng nhóm khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và hormone sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hệ thống trang thiết bị và bố trí 5 nội dung thí nghiệm:

• Địa điểm, điều kiện và vật liệu: Thực hiện tại PTN Công nghệ Sinh học Thực vật - Trường ĐH Công nghiệp TP.HCM từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017 trên nguồn lá cây Mật Nhân thu thập tại chỗ.
• Chi tiết bố trí 5 thí nghiệm:
  • Thí nghiệm 1: Khảo sát 6 nghiệm thức kết hợp giữa 2 mức nồng độ Javel (50%, 100%) và 3 mốc thời gian khử trùng (15, 20, 25 phút).
  • Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường MS bổ sung NAA ở 5 mức nồng độ: 0 (đối chứng); 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/l trên mẫu lá vô trùng cắt kích thước $1 \times 1\text{ cm}$, theo dõi trong 4 tuần.
  • Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường MS bổ sung 2,4-D ở 5 mức nồng độ: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/l để so sánh khả năng cảm ứng mô sẹo.
  • Thí nghiệm 4: Cấy 1,0 g mô sẹo thu được từ nghiệm thức tối ưu của TN2 vào môi trường MS chứa NAA kết hợp BA (nồng độ BA khảo sát: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/l) để khảo sát tăng sinh khối.
  • Thí nghiệm 5: Bổ sung các chất bổ trợ hữu cơ gồm nước dừa, Vitamin B1 (10 mg/l) và Glycine (10 mg/l) vào môi trường tối ưu từ TN4 để đánh giá sự gia tăng khối lượng chất khô của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy tối.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm thông qua số liệu định lượng và mô tả hình thái:

1. Hiệu quả khử trùng mẫu lá ban đầu (Thí nghiệm 1)

Kết quả ghi nhận nồng độ Javel và thời gian xử lý ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê ($p < 0,01$) đến tỷ lệ vô trùng và tỷ lệ sống của mẫu lá cấy:

Nghiệm thức	Nồng độ Javel (%)	Thời gian (phút)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu vô trùng (%)
NT 1.1	50	15	$77,78^\text{d}$	$55,55^\text{f}$
NT 1.2	50	20	$85,19^\text{b}$	$68,51^\text{d}$
NT 1.3	50	25	$\mathbf{96,29^\text{a}}$	$\mathbf{99,07^\text{a}}$
NT 1.4	100	15	$83,33^\text{c}$	$88,89^\text{c}$
NT 1.5	100	20	$62,96^\text{e}$	$96,30^\text{b}$
NT 1.6	100	25	$48,15^\text{f}$	$100,00^\text{a}$
CV (%)			1,86	2,82

Ghi chú: Các chữ cái đi kèm giá trị trung bình trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức $p < 0,01$ qua trắc nghiệm LSD.

Ở nồng độ Javel 50%, khi tăng thời gian từ 15 lên 25 phút, tỷ lệ vô trùng tăng mạnh từ 55,55% lên 99,07% và tỷ lệ sống đạt cao nhất (96,29%). Khi dùng Javel nguyên chất 100%, tỷ lệ vô trùng đạt 100% ở 25 phút nhưng tỷ lệ sống giảm mạnh xuống còn 48,15% do mô thực vật bị tổn thương và hoại tử tế bào.

2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo mô sẹo (Thí nghiệm 2)

Sau 4 tuần nuôi cấy trong điều kiện che tối, tác động của nồng độ NAA lên tỷ lệ hình thành và đặc điểm mô sẹo được thể hiện rõ rệt:

Nghiệm thức	Nồng độ NAA (mg/l)	Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)	Đặc điểm hình thái mô sẹo
NT 2.1 (ĐC)	0	$0,00^\text{e}$	Không có phản ứng tạo callus
NT 2.2	0,5	$48,17^\text{d}$	Mô sẹo màu trắng ngà, cấu trúc cứng, số lượng ít
NT 2.3	1,0	$\mathbf{83,56^\text{a}}$	Mô sẹo màu trắng sau chuyển sang vàng, phát triển nhanh, xốp
NT 2.4	2,0	$61,34^\text{b}$	Mô sẹo trắng chuyển vàng, xuất hiện nhiều, phát triển chậm
NT 2.5	4,0	$55,18^\text{c}$	Mô sẹo trắng chuyển vàng, xuất hiện nhiều, phát triển chậm
CV (%)		4,09

Nghiệm thức bổ sung 1,0 mg/l NAA cho tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất đạt 83,56% với chất lượng mô sẹo tốt nhất (màu sáng, xốp, tăng sinh mạnh). Tăng nồng độ NAA lên 2,0–4,0 mg/l khiến tốc độ sinh trưởng của mô sẹo bị ức chế, tỷ lệ tạo mô sẹo giảm dần xuống 61,34% và 55,18%.

3. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D, phối hợp NAA–BA và chất bổ trợ (Thí nghiệm 3, 4, 5)

• Cảm ứng bằng 2,4-D: 2,4-D có khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ở các nồng độ khảo sát (0,5–4,0 mg/l), tuy nhiên chất lượng và độ đồng nhất của khối mô sẹo ở nghiệm thức NAA 1,0 mg/l vượt trội hơn.
• Tăng sinh khối bằng tổ hợp NAA kết hợp BA: Mô sẹo cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung đồng thời NAA 1,0 mg/l và BA 1,0 mg/l cho chỉ số gia tăng khối lượng khô cao nhất so với các nồng độ BA khác hoặc đối chứng không bổ sung BA.
• Tác dụng của chất bổ trợ: Việc bổ sung thêm Vitamin B1 với nồng độ 10 mg/l vào môi trường tối ưu (MS + 1,0 mg/l NAA + 1,0 mg/l BA) kích thích mạnh mẽ quá trình tích lũy sinh khối khô của tế bào mô sẹo so với các nghiệm thức đối chứng hoặc bổ sung Glycine, nước dừa.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

1. Khử trùng mẫu cấy: Xác định được công thức khử trùng tối ưu cho mẫu lá cây Mật Nhân là dung dịch Javel nồng độ 50% trong thời gian 25 phút, cho tỷ lệ mẫu sống đạt 96,29% và tỷ lệ mẫu vô trùng đạt 99,07%.
2. Cảm ứng tạo mô sẹo: Môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA là tối ưu để cảm ứng phát sinh mô sẹo từ mô lá với tỷ lệ tạo sẹo đạt 83,56%, mô sẹo có màu trắng ngà chuyển sang vàng sáng, cấu trúc xốp và tốc độ phân chia nhanh.
3. Tăng sinh khối mô sẹo: Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng gồm 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1,0 mg/l BA trên nền môi trường MS tạo điều kiện tốt nhất cho quá trình nhân nhanh sinh khối tế bào mô sẹo.
4. Bổ trợ dinh dưỡng: Bổ sung Vitamin B1 ở nồng độ 10 mg/l giúp tối ưu hóa sự gia tăng khối lượng chất khô của mô sẹo trong chu kỳ nuôi cấy 4 tuần ở điều kiện nuôi tối hoàn toàn.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng quy trình khử trùng bằng Javel 50% trong 25 phút để làm sạch nguồn mẫu lá Mật Nhân tự nhiên có bề mặt bám dính nhiều vi sinh vật mà không làm cháy mô.
• Sử dụng công thức môi trường MS + 1,0 mg/l NAA + 1,0 mg/l BA + 10 mg/l Vitamin B1 + 20 g/l Saccharose + 8 g/l Agar (pH 5,8) làm môi trường chuẩn để duy trì và nhân sinh khối mô sẹo phục vụ nghiên cứu tiếp theo.
• Khuyến nghị tiếp tục phát triển nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension culture) từ khối mô sẹo xốp thu được để tách chiết các hợp chất thứ cấp in vitro.

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Xây dựng được quy trình hoàn chỉnh từng bước từ khâu khử trùng mẫu lá, cảm ứng tạo mô sẹo đến tăng sinh khối mô sẹo cho loài Eurycoma longifolia Jack tại Việt Nam.
• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có ý nghĩa thống kê cao về phản ứng sinh lý của tế bào lá Mật Nhân đối với các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin tổng hợp (NAA, 2,4-D) và cytokinin (BA).
• Đặt nền móng kỹ thuật ban đầu cho hướng sản xuất sinh khối tế bào chứa hoạt chất dược liệu quý (eurycomanone, quassinoid) quy mô in vitro, giảm thiểu áp lực khai thác cạn kiệt tài nguyên cây thuốc trong tự nhiên.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi vật liệu chỉ tập trung khảo sát trên một loại mô cấy duy nhất là cơ quan lá, chưa so sánh đối chứng khả năng tạo mô sẹo với các bộ phận khác như thân non, chồi đỉnh hoặc rễ.
• Nghiên cứu dừng lại ở việc đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng hình thái học (tỷ lệ tạo sẹo, màu sắc, khối lượng chất khô), chưa tiến hành định tính và định lượng hàm lượng các hoạt chất thứ cấp chính (như eurycomanone hoặc alkaloid nhóm canthin-6-one) tích lũy trong khối mô sẹo bằng các phương pháp sắc ký (HPLC, TLC).
• Chưa khảo sát các chu kỳ nuôi cấy dài hạn qua nhiều thế hệ cấy chuyền để kiểm soát hiện tượng biến dị dòng soma (somaclonal variation).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Sử dụng mô sẹo thu được để thiết lập hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào đơn trong môi trường lỏng lắc (suspension culture) hoặc hệ thống bioreactor nhằm nâng cao hiệu suất tăng sinh khối.
• Phân tích định lượng hoạt chất sinh học trong mô sẹo nuôi cấy so sánh với mô cây tự nhiên bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Thử nghiệm bổ sung các chất khơi mào sinh học hoặc phi sinh học (elicitors) vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự sinh tổng hợp và tích lũy các hợp chất quassinoid thứ cấp.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận này là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Nông nghiệp Công nghệ cao, Dược học và Sinh học Thực vật: Tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), kỹ thuật vi nhân giống và cảm ứng mô sẹo thực vật, quy trình xử lý thống kê bằng phần mềm SAS và trắc nghiệm LSD.
• Các nhóm nghiên cứu về cây dược liệu: Tham khảo chi tiết thông số môi trường (khoáng MS, tỷ lệ auxin/cytokinin, vitamin B1) và quy trình khử trùng bằng Javel để nuôi cấy mô các loài thực vật thân gỗ khó tái sinh hoặc các loài thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae).
• Phần đáng tham khảo nhất:
  • Phần tổng quan chi tiết về thành phần hóa thực vật và công dụng dược lý của cây Mật Nhân (Chương 1).
  • Bảng dữ liệu định lượng và biện luận về sự tương tác giữa nồng độ chất khử trùng - thời gian xử lý và nồng độ auxin (NAA) trong cảm ứng tạo callus (Chương 3).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu lá cây Mật Nhân được khử trùng bằng hóa chất nào và thông số tối ưu là bao nhiêu?

Mẫu lá cây Mật Nhân được khử trùng sơ bộ bằng cồn $70^\circ$ trong 1 phút, sau đó xử lý bằng dung dịch Javel thương phẩm. Nghiệm thức tối ưu được xác định là Javel nồng độ 50% trong thời gian xử lý 25 phút, mang lại tỷ lệ mẫu vô trùng đạt 99,07% và tỷ lệ mẫu sống đạt 96,29%.

2. Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nào cho tỷ lệ tạo mô sẹo lá Mật Nhân cao nhất?

Nồng độ NAA 1,0 mg/l bổ sung trên nền môi trường MS cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất đạt 83,56%. Khối mô sẹo hình thành có màu trắng sau chuyển sang vàng sáng, cấu trúc xốp và tốc độ sinh trưởng nhanh, vượt trội hơn so với các nồng độ 0,5 mg/l (48,17%), 2,0 mg/l (61,34%) và 4,0 mg/l (55,18%).

3. Công thức phối hợp nào được tác giả kết luận là thích hợp nhất để tăng sinh khối mô sẹo?

Công thức thích hợp nhất để tăng sinh khối mô sẹo là môi trường MS bổ sung đồng thời NAA ở nồng độ 1,0 mg/l kết hợp với BA ở nồng độ 1,0 mg/l, đồng thời bổ sung thêm chất bổ trợ Vitamin B1 với nồng độ 10 mg/l.

4. Điều kiện vật lý trong phòng nuôi cấy mô sẹo cây Mật Nhân được thiết lập như thế nào?

Thí nghiệm nuôi cấy mô sẹo được duy trì ở nhiệt độ phòng thí nghiệm $25 \pm 2^\circ\text{C}$, độ pH môi trường trước khi hấp tiệt trùng được chỉnh về $5,8 - 6,0$, và các bình mẫu nuôi cấy được che tối hoàn toàn trong suốt chu kỳ theo dõi 4 tuần.

5. Số liệu thực nghiệm trong khóa luận được phân tích bằng công cụ và phương pháp thống kê nào?

Toàn bộ số liệu thực nghiệm thu thập từ các lần lặp lại được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng SAS 9. Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các nghiệm thức được đánh giá thông qua trắc nghiệm phân hạng LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa $p < 0,01$.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Yến Nhi đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu thực nghiệm về việc xác định quy trình khử trùng mẫu lá và môi trường dinh dưỡng tối ưu cho quá trình cảm ứng, tăng sinh khối mô sẹo cây Mật Nhân (Eurycoma longifolia Jack). Kết quả nghiên cứu khẳng định dung dịch Javel 50% trong 25 phút khử trùng hiệu quả mẫu cấy ban đầu, môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA tối ưu cho cảm ứng tạo mô sẹo (đạt 83,56%), và sự kết hợp giữa 1,0 mg/l NAA, 1,0 mg/l BA cùng 10 mg/l Vitamin B1 là tối ưu để nhân nhanh sinh khối chất khô. Đề tài cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc phục vụ cho các định hướng nghiên cứu tiếp theo về nuôi cấy huyền phù tế bào và khai thác hoạt chất thứ cấp in vitro từ cây dược liệu Mật Nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TONG QI AN 1. Cây Mật Nhân 1. Phân loại khoa học - Giới: Plantae - Bộ: Sapindales - Họ: Simaroubaceae - Chi: Eurycoma - Loài: E. Longifolia - Tên khoa học: Eurycoma longifloria Jack Cây Mật Nhân còn gọi là Mật Nhơn, cây Bá Bệnh, cây Bách Bệnh hay cây Hậu Phác Nam, nhân sâm Malaysia với tên nổi tiếng Hình 1.1: Cày Mật Nhàn Tongkat ali, Pasak bumi (Indonesia), Tho nan (Lào).

Antongsar, antogung sar (Campuchia), tiếng Anh gọi là longjack. Phân bố sinh học Cây Bá Bệnh phân bố chủ yểu ở vùng nhiệt đới Nam Á và Đông Nam Á. Ở Đông Nam Á cây Mật Nhân phân bố rộng khắp ờ các quốc gia như: Malaysia, Indonesia, Brunei, Thái lan, Campuchia,.ờ Indonesia cây tự nhiên mọc duy nhất ở Sumatra và Kalimantan. Ngoài ra, cây Mật Nhàn còn xuất hiện ờ Nam Trung Quốc, Ấn Độ.

Ở Việt Nam cây Mật Nhàn có mặt ở hầu hết các tinh thành chảy dài trên mảnh đất hình chữ s nhưng nhiều nhất tạp trung ở các tinh miền Trung như: Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh. Một sổ rừng ờ Tày Nguyên, Tây Ninh. Ngoài ra cây Mật Nhân có mặt ở vườn quốc gia Bái Tử Long, khu bào tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ. Quàng Ninh, đặc biệt quanh vùng Biên Hòa, Tràng Bom và Định Quán thuộc tinh Đồng Nai.

Dặc (liêm sinh trướng Cây Mật Nhân thường mọc ớ vùng dổi núi có sườn dốc cao hơn mực nước biển khoang 700 m, vùng đât cát có tính acid, nghèo chất dinh dưỡng, mọc dưới những tán cây. thích hợp sông ớ những nơi có nhiệt độ trung binh 25’C và độ ẩm khoảng 86%, mọc trong các khu rừng ven bờ biên hoặc rừng nguyên sinh, rừng tái sinh và cả các khu rừng hồn tạp, rừng thưa (Đỗ Tất Lợi, 1999/. Đặc điểm hình thái Mật nhân là loại cây trung bình, cao khoáng i 5 m. thường mọc dưới tán lá của những cây lớn.

Cây Mật Nhân là cây lá kép lòng chim le gồm 10 đến 36 đôi lá chét, hầu như không có cuống, lá hình trứng dài. mỗi cành thường có từ 13 cho đến 42 lá. mặt trên của lá có màu xanh còn mặt dưới ũ-. Cây Mật Nhản là cây đơn tính khác gốc nên mỗi cây chì trổ hoa đực hoặc hoa cái.

Hoa có màu đỏ nâu mọc thành chùm, nở vào tháng 3 - 4. Mỗi hoa có 5 - 6 cánh rất nhò. Cây kết quả vào tháng 5-6. Hình dạng quả là hình quả trứng, cỏ khía rãnh ờ giữa, quả non có màu xanh, khi chín đổi sang màu đỏ sầm, nhẵn, hơi thuôn dài.

đâu tù và cong, mặt trong có lông thưa và ngắn, dài từ 1 - 2 cm, ngang 0,5 - 1 cm. Mồi quả có một hạt. trên hạt có nhiều lông ngan. Thành phần hóa học Các công trình nghiên cứu đã xác định được 65 hợp chất các loại từ rề cày Mật Nhân (Narihiko Fukamiya, 2004), thành phần hóa học của cày phong phủ và đa dạng bao gồm nhiều hợp chất như diterpenoids, triterpen với 3 loại hợp chất cơ bản như: quassinoid, squallan và tirucallan.

Ngoài ra, còn có các alkaloid, steroid. Trong đó, alkaloid và quassinoid đóng vai trò quan trọng nhất và là thành phần hóa học chủ yếu của cây Mật Nhân. Các hợp chất quasinoid: eurycomalacton, 6a-hydroxyeurymalacton, longilacton, 5,6-dehydroeurycomalacton, 14,15-p-dihydroxykalaineanon. Các hợp chất triterpen loại tirucalan: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A, bourjotinolon A, espisapelin A.

melianon và hyspirdon. Các alkaloid loại canthin-6-on: 9,10-dimethoxycanthin-6-on, 10-hydroxy- 9methoxy-canthin-6-on. alkaloid carbolin, 10-hydroxy-9-methoxy-canthin-6-on, 5,9- dimethoxycanthin-6-on và 9-methoxy-3-methyl-canthin-5,6-dion. 4 I ừ rê dà phán lập dược 3 quassinoid: eurycomanol, eurycomanol 2-0-P-D glucopyanosid và 13p,18-dihydroeurycomanol.

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc trưởng đại học Y dược Hiroshima, Nhật Bản đã có lập được hai họp chât quassinoíd tư ré cá) Mật nhản có tên là eurỵcomanon và eurycomanol. Bằng phương pháp sấc kí.