MỞ ĐẦU Giống Keo lai tự nhiên giữa Keo tai tƣợng và Keo lá tràm (thƣờng đƣợc gọi tắt là Keo lai) đã đƣợc ghi nhận là có nhiều đặc điểm ƣu việt hơn so với 2 loài bố mẹ nhƣ: sinh trƣởng nhanh, thích ứng đƣợc trên nhiều dạng lập địa và kháng sâu bệnh. Từ năm 1991, các dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát hiện, nghiên cứu chọn lọc và đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất. Ở nƣớc ta đến nay đã có trên 600.000 ha rừng Keo lai đã đƣợc trồng, trong đó nhu cầu diện tích trồng rừng hàng năm của Keo lai đƣợc dự đoán từ 20. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân mà cho đến nay mới chỉ có khoảng 10 dòng Keo lai tự nhiên đã đƣợc phát triển rộng rãi trong sản xuất.
Mặt khác, rừng trồng các loài Keo nhiệt đới (bao gồm Keo lai và Keo tai tƣợng) gần đây đƣợc ghi nhận là bị ảnh hƣởng nặng nề bởi nấm bệnh cũng nhƣ điều kiện bất lợi của môi trƣờng và biến đổi khí hậu. Vì vậy, công tác chọn giống Keo lai cần đƣợc liên tục tiến hành để vừa chọn tạo đƣợc các giống mới có năng suất, chất lƣợng cao vừa đảm bảo đƣợc tính an toàn sinh học cho rừng trồng. Kết quả khảo nghiệm dòng vô tính Keo lai gần đây đã chọn đƣợc các dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 là những dòng triển vọng và đã đƣợc công nhận là giống Tiến bộ kỹ thuật nhằm đƣa các giống này vào sản xuất. Để phát triển các giống này vào sản xuất thì việc nghiên cứu nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là hƣớng đi hiệu quả nhất.
Mặc dù vậy, quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho Keo lai trƣớc đây mặc dù đã đƣợc áp dụng rộng rãi, nhƣng lại không thể áp dụng hoàn toàn cho các giống mới chọn lọc này do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng của các kiểu gen rất khác nhau đối với cùng một điều kiện môi trƣờng nên trong cùng một loài, với các dòng khác nhau thì hiệu quả nhân giống cũng rất khác nhau cho dù là cùng loài (do đặc điểm về mặt di truyền không đồng nhất), mặt khác các công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào cho các dòng Keo lai mới chọn tạo chƣa có. Do đó, xác định và tối ƣu hóa phƣơng pháp nhân giống cho 3 dòng Keo lai BV376, BV586 và BB055 bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô là cần thiết và có ý nghĩa trong việc phát triển nhanh các giống có năng suất cao này vào trồng rừng sản xuất. Luan van 5 Trên cở sở đó đề tài: ―Nghiên cứu nhân giống các dòng Keo lai năng suất cao BV376, BV586 và BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào‖ đã đƣợc tiến hành nhằm đáp ứng yêu cầu thiết yếu của thực tiễn sản xuất. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY RỪNG 1. Trên thế giới Nuôi cấy mô tế bào là phƣơng pháp nhân giống đƣợc thực hiện bằng nuôi cấy cơ quan, mô (thậm chí là tế bào) trong môi trƣờng dinh dƣỡng đặc biệt hoàn toàn vô trùng và đƣợc kiểm soát. Vì vật liệu nuôi cấy thƣờng rất nhỏ và thực hiện trong môi trƣờng nhân tạo nên phƣơng pháp nhân giống này còn đƣợc gọi là vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm: nuôi cấy callus, nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy phôi, nuôi cấy các cơ quan (đỉnh sinh trƣởng, rễ, lá, bao phấn,.
Nuôi cấy in vitro đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thƣơng mại ở nhiều nƣớc trên thế giới (Thụy Điển, Braxin, Australia,Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan, Ấn Độ, .) và đã thu đƣợc những thành công đáng kể, đây là khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea abies), Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P. Ở Thụy Điển vào cuối năm 1980 công ty Hilleshoge đã nhân giống cây Vân sam (Picea abies) với số lƣợng 3 triệu cây/năm. Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy thành công.
Các nhà khoa học ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. Cây mô có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ [3]. Luan van 7 Tại Australia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn lọc cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài Bạch đàn trắng (E. Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E.
Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc sản xuất với quy mô lớn cho loài E. Trung Quốc là nƣớc có nhiều thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ đƣợc nuôi cấy nhƣ Dƣơng, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (Hông). Đến năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, ngƣời ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai của một số loài cây trồng rừng chủ yếu đã đƣợc chọn lọc qua khảo nghiệm.
Những cây mô này đƣợc dùng nhƣ là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vƣờn ƣơm địa phƣơng hoặc dùng thẳng vào trồng rừng [3]. Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành công cho 55 loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Tre mạnh tông Dendrocalamus asper với số lƣợng khoảng 1 triệu cây mỗi năm đáp ứng đƣợc nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng (dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn, 2011) [4]. Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng dòng vô tính.
Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là: Pinus nigra, P. pinaster… Có tới 30 loài cây lá kim đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô và đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh… Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có 4 loài đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp, Thông ra-đi-a-ta (P. radiate) ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. seudotsuga menziesii ở Mỹ [3].
Luan van 8 Gupta và các cộng sự đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây Tếch 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo đƣợc 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trƣởng thành và 3.000 cây từ 1 cây non trong một năm. Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm [5]. Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu đã đƣợc thử nghiệm nhân giống thành công bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô nhƣ: Acer, Beluta, Fagus, Quercus, Carpinus. Các cây mô đã đƣợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy chúng có kiểu hình tƣơng đối giống nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây đƣợc huấn luyện là khá cao có thể đạt 90% đến 100% cho một số loài (Dẫn theo Đoàn Thị Mai và Lê Sơn) [4].
Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đƣợc áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chƣơng trình trồng rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã đƣợc nuôi cấy thành công đó là Pinus nigra, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim đƣợc nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt đƣợc những thành công bƣớc đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria) Liễu sam (Cryptomeria japonica) Bách xanh. Trong số 30 loài cây lá kim đã đƣợc nuôi cấy mô, có bốn loài đƣợc đƣa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempevirens) ở Pháp; Thông P.
radiate ở Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New Dilân; Thông P. taeda và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ [3]. Ngƣời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang đƣợc áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trƣởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng [3].
Số lƣợng các loài Bạch đàn đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ngày càng tăng, báo cáo của McComb và Bennett (1986) cho biết đã có trên 38 loài Bạch đàn khác nhau đƣợc nuôi cấy mô thành công từ năm 1963, tiêu biểu là các công trình của Cresswell và Fossard (1974), Cresswell và Nitsch (1975), Durnad – Cresswell và Nitsch (1977), Furze và Cresswell (1985), Rao và Venkateswara (1985), Lakshmi Sita (1986), Warrag Luan van 9 và cộng sự (1987), (Warrag, và cộng sự, 1990). Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cây mô từ các cây trội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. torelliana và cả từ các cây trội có hàm lƣợng tinh dầu cao của bạch đàn chanh E. Cây mô có nguồn gốc từ cây ƣu việt sinh trƣởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ.
Tại Autralia, nhân giống in vitro đã đƣợc áp dụng để nhân nhanh cho các cây đƣợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đƣợc đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn cho loài E. Năm 1983, Gupta và cộng sự đã báo cáo rằng các chồi E. camaldulensis đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung Kn, BAP, Cal.Pan và Biotin. NAA ảnh hƣởng đến khả năng ra rễ của E.
torelliana trong khi, với E. camaldulensis, IAA, IBA, IPA và NAA đều cho hiệu quả ra rễ. Tác giả cũng đề cập đến vai trò thúc đẩy quá trình ra rễ in vitro của than hoạt tính đối với 2 loài cây này. Kết quả là từ 1 đoạn chồi của cây trƣởng thành, sau 1 năm đã tạo ra đƣợc 50.000 cây con in vitro E.000 cây con đối với E.