Đặt vấn đề Giảo cổ lam hay còn gọi là Thất diệp đảm, có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum thuộc họ bầu bí (cucurbitaceae). Có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Hà Thanh Bình, 2002) [3]. Ở Việt Nam, Giảo cổ lam được tìm thấy ở một số địa phương thuộc vùng đồi núi phía bắc như Hòa Bình, Sa Pa,… Các nhà khoa học đã chứng minh được công dụng thần kỳ của Giảo cổ lam đối với sức khỏe con người và nó đã trở thành cây thuốc quý có giá trị. Giảo cổ lam làm hạ cholesterol toàn phần trong máu, làm tăng miễn dịch và nâng cao sức đề kháng của cơ thể, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u một cách rõ rệt, giúp bình ổn huyết áp.
Sử dụng Giảo cổ lam giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, giảm béo phì, nhuận tràng, giúp tăng cường máu não mạnh, giảm các cơn đau tim (Phạm Thanh Kỳ, 2007) [18]. Trong tự nhiên Giảo cổ lam thường mọc ở các sườn vách đá có độ ẩm cao, nhưng hệ số nhân giống thấp, tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiều yếu tố ngoại cảnh. Do nhu cầu sử dụng dược liệu này tăng mạnh trong thời gian gần đây dẫn đến nguồn nguyên liệu không thể đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống Giảo cổ lam đã trở nên có ý nghĩa.
Vì vậy nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ cung cấp những cơ sở khoa học thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này. Xuất phát từ cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro”. Mục đích của đề tài Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro. Yêu cầu của đề tài Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùngmẫu Giảo cổ lam.
Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam. Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học. + Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng, học tập nghiên cứu khoa học.
Xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học. + Bổ sung nguồn tài liệu cho việc sản xuất Giảo cổ lam. + Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô. Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân và chất lượng giống.
- Ý nghĩa thực tiễn: Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cung cấp giống ra thị trường. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam 2. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma Gynostemma Blume bao gồm những cây thân thảo, hoa đơn tính khác gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc hơi có lông mịn.
Có từ 3 đến 5 lá chét, có tua cuốn. Cụm hoa đực thành chùy mảnh rất dài, nhiều hoa. Hoa nhỏ, hình sao, ống bao hoa ngắn, cánh hoa rời nhau. Cụm hoa cái tương tự hoa đực nhưng dài hơn.
Chứa 2 noãn, vòi nhụy 3, đầu nhụy 2-3. Quả mọng chứa 2-3 hạt, hình tròn, không mở, đường kính 5-9mm, hạt hình tim, hơi dẹt và sần sùi. Gồm 4-5 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á (Võ Văn Chi, 2004) [24]. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino: Giảo cổ lam 5 lá, Cổ yếm, thư tràng hay còn gọi là “Ngũ diệp sâm” (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16].
Thuộc loài cây thân thảo mọc leo yếu. Không có lông, vòi đơn, lá kép có cuống chung dài 3-4cm, 5-7 lá chét, mép có răng cưa, dài 3-9cm, rộng 1,5- 3cm. Cây khác gốc, hoa nhỏ hình sao. Ống bao phấn rất ngắn (cao 2,5mm) bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy.
Quả khô, trong đường kính 5- 7mm. Màu đen, có từ 2-3 hạt, treo, to 4mm có vân lăn tăn. Ra hoa tháng 7 đến tháng 8, cho quả vào tháng 9 đến tháng 10 (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16]. Hoa đực mọc thành chùm, hình nón dài 10 – 15 (có khi dài tới 30cm).
Tràng hoa năm cánh màu xanh nhạt hoặc trắng. Hoa cái có hình dạng như hoa đực nhưng nhỏ hơn nhiều. Bầu nhuỵ có 2 – 3 khoang hình cầu. Vòi nhuỵ có 3 núm nhuỵ ngắn và chẻ ra 2 phần.
Quả nhẵn, hình cầu, dạng quả mọng nhỏ, đường kính 5 – 6mm và đen khi chín. Hai hạt bên trong màu nâu xám hoặc n 4 nâu sẫm, đường kính 4mm. Đỉnh của hạt tù, có đáy hình tim. Mùa ra hoa ở vùng phía Bắc bán cầu là từ tháng 3 đến tháng 11; kết quả từ tháng 4 đến tháng 12 (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [15].
Nguồn gốc và phân bố Gynostemma pentaphyllum có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Lê Đình Bích, 2005) [4]. Gynostemma pentaphyllum phân bố ở độ cao từ 300 – 3000m so với mực nước biển ở các vùng đồng bằng, sườn dốc và dưới tán cây trên núi của Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Nê – Pan, Sri Lanka, Thái Lan và Việt Nam (Hà Thanh Bình, 2002) [3]. Gynostemma pentaphyllum phân bố tự nhiên ở vùng rừng núi, thung lũng núi, rừng cây gỗ, rừng cây bụi, những dải đất ven suối, ven đường, những nơi tối, ẩm, có độ cao từ 300 – 3200m (Nguyễn Thị Hòa, 2001) [13]. Ở Việt Nam đã phát hiện được hai loài Giảo cổ lam là loài có 5 lá chét và loài có 7 lá chét.
Cả hai loài này đều phân bố khắp các vùng núi thuộc miền bắc và miền trung, cây chủ yếu phát triển trên các vùng có núi đá vôi (Viện Dược liệu, 1996) [21]. Gynostemma laxum (Wall) Cogn: Cổ yếm lá bóng, thư tràng thưa. Cây mọc ở Ba Vì, Lạng Sơn, SaPa, Ninh Bình, Hoà Bình (Lê Đình Bích, 2005) [4]. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam - Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại saponin rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất tốt cho sức khỏe về phòng ngừa và chữa bệnh.
Khi so sánh hàm lượng saponin giữa một số loài cùng chi, loài G.pentaphyllum được biết đến với hàm lượng saponin cao nhất trong chi này, kế đến là G. pubescens và thấp nhất là G. n 5 - Có chứa nhiều Flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và chống lão hóa mạnh. - Chứa nhiều acid amin tan trong nước, nhiều vitamin các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se.
Số Saponin của Giảo cổ lam nhiều gấp 3 đến 4 lần so với nhân sâm. Trong đó một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc trong nhân sâm (ginsenozit). Ngoài ra Giảo cổ lam còn chứa các vitamin, các chất khoáng như selen, kẽm, sắt, mangan, phospho,… (Võ Văn Chi, 1997) [23]. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam Giảo cổ lam được dùng trong các bệnh tăng lipid máu, đánh trống ngực, chứng chóng mặt, đau đầu, ù tai, chứng tự ra mồ hôi, cơ thể suy nhược; các chứng bệnh tâm tỳ khí kém, đàm huyết ứ trệ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17].
Giảo cổ lam được đưa vào hầu hết các từ điển thảo dược Trung Quốc, dùng để giải độc, làm thuốc ho, chữa trống ngực, các triệu chứng mệt mỏi, viêm phế quản cấp và mãn tính và làm thuốc giảm ho (Phạm Thanh Hương 2003) [17]. Ở Nhật Bản Giảo cổ lam được dùng để lợi tiểu, điều trị đi tiểu ra máu, chống viêm và làm thuốc bổ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17]. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ và Võ Văn Chi Giảo cổ lam có vị đắng tính hàn; có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm. Ở Trung Quốc được dùng làm thuốc tu bổ cường tráng.
Có nơi như ở Quảng Tây, người ta dùng để trị ỉa chảy và dùng ngoài trị rắn cắn; còn ở vùng Vân Nam, cây được sử dụng như cây Cỏ Yếm lá bóng: Chữa viêm khí quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành tá tràng, phong thấp đau nhức khớp, bệnh về tim. Theo tài liệu Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, dược liệu Giảo cổ lam có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu, tăng sức khoẻ, chống lão suy, kháng ung thư, trị ung thư, viêm phế quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, n 6 viêm bể thận, viêm dạ dầy ruột, cao huyết áp, lipid máu cao, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dầy, tiểu đường (Dược điển Việt Nam IV, 2009) [21]. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nƣớc và trên thế giới 2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới Năm 2006, Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad và cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào và đưa ra một số kết quả sau: Môi trường nhân nhanh thích hợp là: MS bổ sung 0,1mg/l BAP, 5mg/l GA3 , 150mg/l axit citric cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 4,3 lần, chiều cao 2,4cm.
Môi trường ra rễ thích hợp: MS bổ sung 1mg/l IAA sau 30-45 ngày có số rễ đạt 7,4 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 4,2cm, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 92,8%. Tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm sau 1 tháng theo dõi là 94,25%, cây sinh trưởng phát triển tốt (Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad, 2006) [26]. Năm 2012, Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, NAA và 2.4-D trong vi nhân giống cây Giảo cổ lam và đưa ra một số kết quả như sau: Sử dụng môi trường nền MS có bổ sung 1,0mg BAP/l, sau 12 tuần hệ số nhân chồi cao nhất đạt 7,28 lần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,22cm. Tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo từ lá bổ sung 2,4-D với nồng độ 1,0mg/l, kết quả mô sẹo hình thành với đường kính là 0,9375cm.
Khi bổ sung kết hợp giữa 1,0mg/lBAP và 0,1mg/l NAA cho hệ số nhân chồi đạt 6,8 lần (Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, 2012) [27].