Nghiên cứu nấm Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do Aspergillus flavus trên cây lạc tại Nghệ An.

• Tác giả: Hồ Thị Nhung
• Người hướng dẫn: GS. Vũ Triệu Mân
• Trường học: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh mốc vàng Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục đích và yêu cầu
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
• 1.5. Những đóng góp mới của luận án
• 2. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới
• 2.1.2. Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trên lạc
• 2.1.3. Biện pháp chẩn đoán nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin bằng sử dụng môi trường CAM (Coconut Agar Medium)
• 2.1.4. Nghiên cứu các phương pháp phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2.1.5. Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2.2.1. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam và tỉnh Nghệ An
• 2.2.2. Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trên lạc
• 2.2.3. Nghiên cứu các phương pháp phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2.2.4. Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2.2.5. Ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2.2.6. Những tồn tại và vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị và dụng cụ
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An
• 3.5.2. Phương pháp thu thập, phân lập, tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An
• 3.5.3. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc tại Nghệ An
• 3.5.4. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc tại Nghệ An
• 3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An
• 4.1.1. Thành phần nấm hại hạt lạc tại Nghệ An năm 2012
• 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ các chợ Nghệ An năm 2012
• 4.1.3. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ nông hộ Nghệ An năm 2012
• 4.1.4. Thành phần nấm hại trong đất trồng lạc tại Nghệ An năm 2012
• 4.1.5. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại Nghệ An năm 2012
• 4.1.6. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh
• 4.1.7. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An
• 4.1.8. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập được từ đất trồng lạc ở Nghệ An
• 4.2. Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An
• 4.2.1. Thu thập và phân lập nấm đối kháng Trichoderma trên đất trồng lạc
• 4.2.2. Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với nấm mốc A. flavus hại lạc
• 4.2.3. Định danh 15 nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng rất cao với nấm mốc A. flavus hại lạc dựa trên vùng gen ITS-rDNA
• 4.2.4. Mô tả đặc điểm hình thái của T. asperellum
• 4.3. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T. asperellum phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An
• 4.3.1. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy giống cấp 1 đến sự phát triển của nấm T.
• 4.3.2. Lựa chọn môi trường nhân giống cấp 2 thích hợp nhất cho nấm T.
• 4.3.3. Lựa chọn môi trường rắn nuôi nhân sinh khối thích hợp nhất cho nấm T.
• 4.4. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T. asperellum phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An
• 4.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện nhà lưới
• 4.4.2. Nghiên cứu chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện đồng ruộng
• 4.4.3. Kết quả xây dựng và đánh giá hiệu quả mô hình sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc ngoài đồng ruộng trong vụ xuân tại Nghi Lộc
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5.1. KẾT LUẬN
• 5.2. KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu nấm Trichoderma

Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng nấm Trichoderma để phòng trừ bệnh mốc vàng do Aspergillus flavus gây ra trên cây lạc tại Nghệ An. Nấm Trichoderma được biết đến với khả năng đối kháng mạnh mẽ với các loại nấm gây bệnh, đặc biệt là Aspergillus flavus, loại nấm sinh ra độc tố aflatoxin nguy hiểm. Nghiên cứu này nhằm mục đích tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có hiệu quả cao trong việc kiểm soát bệnh mốc vàng, đồng thời xây dựng quy trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm từ nấm Trichoderma trong thực tiễn nông nghiệp.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Bệnh mốc vàng do Aspergillus flavus gây ra không chỉ ảnh hưởng đến năng suất cây lạc mà còn gây nguy hiểm cho sức khỏe con người và động vật do độc tố aflatoxin. Việc sử dụng nấm Trichoderma như một biện pháp sinh học để phòng trừ Aspergillus flavus là một hướng đi bền vững, thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Aspergillus flavus, đồng thời xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm và ứng dụng hiệu quả trên đồng ruộng tại Nghệ An.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các bước: thu thập và phân lập nấm Trichoderma từ đất trồng lạc, đánh giá khả năng đối kháng với Aspergillus flavus, và xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm. Các phương pháp sinh học phân tử như định danh dựa trên trình tự gen ITS cũng được áp dụng để xác định các chủng nấm Trichoderma hiệu quả nhất.

2.1. Thu thập và phân lập nấm Trichoderma

Các mẫu đất trồng lạc tại Nghệ An được thu thập và phân lập để tìm kiếm các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với Aspergillus flavus. Quá trình này bao gồm việc nuôi cấy và đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của Aspergillus flavus.

2.2. Đánh giá khả năng đối kháng

Các chủng nấm Trichoderma được đánh giá khả năng đối kháng thông qua các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên đồng ruộng. Kết quả cho thấy một số chủng có hiệu quả cao trong việc ức chế sự phát triển của Aspergillus flavus.

III. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã tuyển chọn được các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Aspergillus flavus, đặc biệt là chủng Trichoderma asperellum. Chế phẩm từ nấm Trichoderma đã được sản xuất và thử nghiệm trên đồng ruộng tại Nghệ An, cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc giảm tỷ lệ nhiễm Aspergillus flavus và độc tố aflatoxin.

3.1. Hiệu quả của chế phẩm Trichoderma

Chế phẩm nấm Trichoderma đã giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm Aspergillus flavus trên cây lạc, đồng thời giảm lượng độc tố aflatoxin trong hạt lạc. Kết quả này không chỉ cải thiện năng suất mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã đề xuất quy trình sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma trong canh tác lạc tại Nghệ An, giúp nông dân giảm thiểu thiệt hại do bệnh mốc vàng và tăng hiệu quả kinh tế.

IV. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của nấm Trichoderma trong việc phòng trừ bệnh mốc vàng do Aspergillus flavus gây ra trên cây lạc tại Nghệ An. Việc ứng dụng chế phẩm nấm Trichoderma không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại mà còn góp phần bảo vệ môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm.

4.1. Kết luận

Nấm Trichoderma, đặc biệt là chủng Trichoderma asperellum, có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát Aspergillus flavus và giảm thiểu độc tố aflatoxin trên cây lạc.

4.2. Đề xuất

Cần tiếp tục nghiên cứu và mở rộng ứng dụng nấm Trichoderma trong các vùng trồng lạc khác tại Việt Nam, đồng thời nâng cao nhận thức của nông dân về lợi ích của biện pháp sinh học này.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh mốc vàng hại lạc do nấm Aspergillus flavus Link. tiết ra độc tố aflatoxin—đặc biệt là aflatoxin B1 có hoạt tính sinh ung thư mạnh nhất theo phân loại của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC)—là rào cản nghiêm trọng đe dọa trực tiếp đến an toàn vệ sinh thực phẩm, sức khỏe cộng đồng và giá trị thương mại nông sản xuất khẩu của Việt Nam. Tại vùng Bắc Trung Bộ, đặc biệt là tỉnh Nghệ An với diện tích trồng lạc dao động từ 16.200 đến 24.100 ha và sản lượng trung bình trên 36.500 tấn mỗi năm, tình trạng ô nhiễm nấm A. flavus trong đất và hạt giống diễn ra vô cùng phức tạp.

Nghiên cứu của Lê Văn Giang và cộng sự (2011) đã chỉ ra một thực trạng báo động: "Khảo sát trên 60 mẫu lạc ở Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A. flavus, trong đó 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin từ 2 – 100 ppb và 10 mẫu (16,67%) vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế". Mặc dù nhiều giải pháp đã được đề xuất như canh tác luân canh, chọn giống kháng (như dòng L17 của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam), hoặc sử dụng chủng A. flavus không sinh độc tố (AF36, TH97, DA2), khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi vẫn tồn tại: chưa có công trình nào tại Việt Nam sàng lọc một cách có hệ thống nguồn nấm đối kháng bản địa Trichoderma asperellum phân lập trực tiếp từ vùng rễ đất trồng lạc, định danh chính xác bằng sinh học phân tử kết hợp vi sinh học, đồng thời chuẩn hóa quy trình công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm sinh khối rắn đạt mật độ bào tử cao nhằm ức chế toàn diện A. flavus từ đồng ruộng đến quá trình bảo quản sau thu hoạch.

Luận án tiến sĩ nông nghiệp của tác giả Hồ Thị Nhung (2017) với đề tài "Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link hại lạc tại Nghệ An" được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Vũ Triệu Mân, PGS. Nguyễn Văn Viết và PGS. Trần Ngọc Lân tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, nhằm giải quyết trọn vẹn khoảng trống trên thông qua hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học chặt chẽ:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Thực trạng phân bố, mật độ mầm bệnh và khả năng sinh độc tố aflatoxin của các quần thể nấm A. flavus trên hạt lạc và trong đất chuyên canh lạc tại Nghệ An diễn ra như thế nào?
   • Giả thuyết 1 (H1): Đất trồng lạc và hạt giống tại Nghệ An có tỷ lệ nhiễm A. flavus bản địa rất cao với phần lớn các chủng mang độc lực sinh tổng hợp aflatoxin B1 vượt ngưỡng an toàn thực phẩm.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Những chủng nấm Trichoderma bản địa nào sở hữu hoạt lực đối kháng mạnh nhất với A. flavus và chúng được định danh chính xác ở cấp độ loài bằng công cụ phân tử nào?
   • Giả thuyết 2 (H2): Các chủng Trichoderma nội tại vùng đất lạc Nghệ An chứa đựng các chủng Trichoderma asperellum có khả năng ức chế tản nấm A. flavus vượt trội thông qua cơ chế cạnh tranh không gian dinh dưỡng, sinh chất kháng sinh bay hơi và ký sinh sợi nấm.
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Thông số kỹ thuật tối ưu nào cho phép sản xuất sinh khối chế phẩm sinh học T. asperellum quy mô phòng thí nghiệm và bán công nghiệp đạt mật độ bào tử cực đại trên $10^9$ CFU/g?
   • Giả thuyết 3 (H3): Sử dụng cơ chất hạt ngũ cốc tự nhiên (thóc hấp) kết hợp môi trường nhân giống cấp 1, cấp 2 tối ưu hóa nguồn carbon/nitơ hữu cơ sẽ tạo ra chế phẩm sinh học có mật độ bào tử đạt ngưỡng $5,3 \times 10^9$ bào tử/gam.
4. Câu hỏi nghiên cứu 4 (RQ4): Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm T. asperellum trên đồng ruộng và khả năng bảo vệ hạt lạc khỏi sự tích lũy độc tố aflatoxin trong 12 tháng bảo quản đạt mức độ nào?
   • Giả thuyết 4 (H4): Xử lý chế phẩm sinh học định kỳ vào đất vùng rễ và hạt giống sẽ làm suy giảm mật độ mầm bệnh A. flavus, nâng cao năng suất thực thu và giảm thiểu đến trên 90% độc tố aflatoxin trong hạt sau 1 năm bảo quản.

Dựa trên khung lý thuyết về kiểm soát sinh học (Biocontrol Theory) và quản lý dịch hại tổng hợp (Integrated Pest Management - IPM), nghiên cứu bao quát phạm vi khảo sát thực địa 450 mẫu hạt nông hộ, 245 mẫu hạt tại các chợ đầu mối và hệ thống mẫu đất thu thập trên 6 huyện trọng điểm (Nghi Lộc, Diễn Châu, Nam Đàn, Hưng Nguyên, Yên Thành, Anh Sơn) từ năm 2011 đến 2015. Đóng góp mang tính đột phá của công trình là tuyển chọn thành công chủng nấm Trichoderma asperellum (ký hiệu Tri.NC), tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm đạt mật độ $5,3 \times 10^9$ bào tử/gam và chứng minh thực nghiệm khả năng giảm thiểu độc tố aflatoxin trong bảo quản lên đến 92,08%.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về bệnh mốc vàng và độc tố aflatoxin trên thế giới đã trải qua hơn 5 thập kỷ với gần 2.000 công trình công bố kể từ khi chi Aspergillus được mô tả lần đầu bởi Florentine (1729) và loài A. flavus được phân loại bởi Link (1890). Các công trình dịch tễ học kinh điển của Mehan và cộng sự (1991, 1996) thuộc Viện Nghiên cứu Cây trồng Quốc tế cho Vùng Nhiệt đới Bán Khô hạn (ICRISAT) cùng các khảo cứu của Pitt và cộng sự (1991), Amaike và Keller (2011) đã xác định đất vùng rễ là nguồn chứa mầm bệnh tiên phát xâm nhiễm trực tiếp vào quả lạc qua vỏ quả trong các đợt hạn hán trước thu hoạch.

Trong bức tranh tổng quan y văn quốc tế, tồn tại hai luồng quan điểm và giải pháp kiểm soát sinh học đối lập:

• Luồng quan điểm thứ nhất (Atoxigenic Competitive Exclusion): Dẫn đầu bởi Cotty (1994) tại Hoa Kỳ với chế phẩm A. flavus AF36 và Alaniz và cộng sự (2005) tại Argentina, đề xuất giải phóng các chủng A. flavus không sinh độc tố để cạnh tranh vị trí sinh thái tự nhiên. Tuy nhiên, Olarte và cộng sự (2012) cùng Bhatnagar-Mathur và cộng sự (2015) đã đưa ra phản biện gay gắt, cảnh báo nguy cơ tái tổ hợp di truyền qua giai đoạn sinh sản hữu tính (Petromyces flavus) và biến dị chọn lọc áp lực làm phát sinh các nòi sinh độc tố mới nguy hiểm hơn.
• Luồng quan điểm thứ hai (Plant Genetic Resistance): Các nghiên cứu của Waliyar và cộng sự (2003, 2005) tại Ấn Độ đã sàng lọc các dòng lạc kháng như ICGV 91278, 91341. Dẫu vậy, Brown và cộng sự (2013) và Bhatnagar-Mathur và cộng sự (2015) đã chứng minh tính kháng di truyền của cây chủ thường không bền vững và dễ bị phá vỡ khi gặp điều kiện khô hạn nghiêm trọng ngoài đồng ruộng.

Khắc phục hạn chế của hai hướng tiếp cận trên, trường phái sử dụng nấm đối kháng Trichoderma spp. được các nhà khoa học tiên phong khai phóng (Calistru et al., 1997; Srilakshmi et al., 2001; Thakur et al., 2003; Anjaiah et al., 2006). Cụ thể, Srilakshmi và cộng sự (2001) khi phân tích 386 mẫu đất tại Ấn Độ đã phát hiện 145 nguồn Trichoderma có khả năng đối kháng A. flavus, trong đó 21 nguồn tiết chất kháng sinh bay hơi ức chế từ 25% đến 83% sự phát triển của mầm bệnh. Nyasha và cộng sự (2015) cũng ghi nhận T. harzianum ức chế 73,3% sợi nấm A. flavus và giảm 56,9% aflatoxin B1 trên đồng ruộng.

So sánh với bức tranh nghiên cứu quốc tế, chẳng hạn như nghiên cứu của Mutegi và cộng sự (2012) tại Kenya (khảo sát 436 mẫu lạc và 1.458 chủng nấm) hay Chen và cộng sự (2013) tại Đài Loan (khảo sát 1.827 mẫu sản phẩm lạc với 32,7% nhiễm aflatoxin từ 0,2 đến 513,4 $\mu\text{g/kg}$), thực trạng tại Việt Nam ghi nhận sự tương đồng về áp lực dịch bệnh. Luận án của NCS. Hồ Thị Nhung đã định vị chuẩn xác công trình nghiên cứu: thay vì sử dụng các chủng Trichoderma thương mại nhập ngoại vốn kém thích ứng với thổ nhưỡng đất cát ven biển Nghệ An, đề tài tập trung khai thác đa dạng sinh học của nguồn Trichoderma bản địa, ứng dụng công nghệ giải mã vùng gen ITS-rDNA để định danh loài T. asperellum, thiết lập cầu nối từ phòng thí nghiệm tới mô hình ứng dụng đồng ruộng quy mô lớn.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp quan trọng vào lý thuyết hệ thống phân loại nấm học và lý thuyết kiểm soát sinh học vi sinh vật:

1. Mở rộng hệ thống phân loại phân tử Trichoderma: Luận án kiểm chứng và bổ sung vào khung phân loại học của Rifai (1969), Gams và Bissett (1998) và Druzhinina và cộng sự (2005), chứng minh rằng các đặc điểm hình thái truyền thống (cuống sinh bào tử, hình dạng thể bình) không đủ để phân biệt các loài tương cận trong phức hợp loài Trichoderma. Việc ứng dụng thành công giải mã trình tự toàn bộ vùng gen bảo tồn ITS1-5.8S-ITS2 rDNA và đối chiếu qua phần mềm TrichOKEY v2.0 đã xác lập cơ sở dữ liệu phân tử vững chắc cho 15 nguồn nấm đối kháng bản địa vùng Bắc Trung Bộ.
2. Phát triển lý thuyết đa cơ chế đối kháng (Multi-target Antagonism Theory): Luận án phát triển khung lý thuyết của Saba và cộng sự (2012) và Keswani và cộng sự (2014) về cơ chế ức chế nấm độc tố. Mô hình lý thuyết đề xuất xác lập mối quan hệ tương hỗ ba tác nhân:
   • Mệnh đề 1 (P1): Cạnh tranh không gian và dinh dưỡng vùng rễ (Rhizosphere ecological niche competition) làm suy giảm mật độ quần thể tự nhiên của A. flavus.
   • Mệnh đề 2 (P2): Kháng sinh bay hơi (Volatile Organic Compounds - VOCs) ngăn cản sự phát triển bán kính khuẩn lạc và ức chế sự biểu hiện của các cụm gen sinh tổng hợp polyketide synthase quy định aflatoxin.
   • Mệnh đề 3 (P3): Ký sinh trực tiếp và thủy phân vách tế bào nhờ phức hệ enzyme ngoại bào (chitinase, $\beta$-1,3-glucanase) làm biến dạng, đứt gãy sợi nấm gây bệnh (Mycoparasitic enzymatic lysis).
   • Mệnh đề 4 (P4): Hiệu ứng phòng vệ kéo dài (Residual protective effect) của T. asperellum từ đồng ruộng tiếp tục bảo tồn hoạt tính trong hạt lạc, ức chế sự nảy mầm của bào tử tiềm ẩn trong suốt 12 tháng tồn trữ sau thu hoạch.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án là sự tích hợp liên ngành giữa: (1) Lý thuyết sinh thái học vi sinh vật đất (Microbial Soil Ecology), (2) Lý thuyết sinh học phân tử di truyền nấm (Molecular Fungal Phylogenetics), và (3) Lý thuyết công nghệ sinh học lên men cơ chất rắn (Solid-State Fermentation Bioprocess).

Phương pháp tiếp cận phân tích này loại bỏ tính ngẫu nhiên, thiết lập các điều kiện biên (boundary conditions) chặt chẽ: áp dụng tối ưu trên nền đất cát pha, thịt nhẹ ven biển miền Trung có pH từ 4,5 – 6,5, nhiệt độ sinh trưởng từ 25 – 30°C và độ ẩm tương đối của không khí thích ứng từ 75 – 85%.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận hành theo thế giới quan thực chứng (Positivism) với lập trường nhận thức luận khách quan, sử dụng thiết kế đa tầng kết hợp vi sinh học cổ điển, sinh học phân tử hiện đại và khảo nghiệm nông học thực địa:

• Tầng 1 (Dịch tễ học & Sinh học thực nghiệm): Điều tra diện rộng, phân lập vi sinh vật bằng môi trường chuyên tính Trichoderma Specific Medium (TSM) và định tính độc tố bằng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut Agar Medium - CAM).
• Tầng 2 (Sinh học phân tử): Khuếch đại PCR và giải trình tự gen vùng ITS-rDNA thực hiện tại Trung tâm BIOTEC (Thái Lan), xử lý cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) bằng phần mềm chuyên dụng.
• Tầng 3 (Kỹ thuật công nghệ sinh học): Tối ưu hóa các thông số lên men cơ chất lỏng và rắn theo phương pháp thay đổi từng yếu tố (OFAT - One Factor at a Time).
• Tầng 4 (Khảo nghiệm nông học In Vivo): Bố trí thí nghiệm nhà lưới và đồng ruộng theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (Randomized Complete Block Design - RCBD) với 3 đến 4 lần lặp lại nhằm loại trừ sai số môi trường.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập mẫu và phân tích tuân thủ nghiêm ngặt các quy chuẩn quốc tế:

• Chiến lược lấy mẫu hạt: Thực hiện theo đúng tiêu chuẩn của Hiệp hội Kiểm nghiệm Hạt giống Quốc tế (ISTA, 1986).
• Quy trình phân lập và đánh giá độc lực: 450 mẫu hạt nông hộ và 245 mẫu hạt từ 7 chợ lớn được khử trùng bề mặt bằng dung dịch $NaOCl$ 1%, ủ trên giấy thấm vô trùng ở 28°C trong 7 ngày để xác định tỷ lệ nhiễm A. flavus. Mẫu đất được phân tích bằng phương pháp pha loãng nồng độ $10^{-1}$ đến $10^{-4}$ cấy gạt đĩa Petri.
• Chẩn đoán độc tố nhanh trên môi trường CAM: Ứng dụng quy trình Lin và cộng sự (1976) và Abbas và cộng sự (2004). Các chủng A. flavus sinh aflatoxin được định tính dưới bước sóng tia cực tím UV 365 nm dựa trên vòng huỳnh quang màu xanh da trời (blue)/xanh lá cây (green) kết hợp mặt sau khuẩn lạc chuyển màu vàng cam.
• Đo lường hiệu lực đối kháng in vitro: Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng bán kính (Percentage Inhibition of Radial Growth - PIRG) qua phương pháp nuôi kép (dual culture) theo công thức: $$\text{PIRG} = \frac{R_1 - R_2}{R_1} \times 100$$ (trong đó $R_1$ là bán kính khuẩn lạc đối chứng, $R_2$ là bán kính khuẩn lạc đối kháng). Thử nghiệm chất kháng sinh bay hơi bằng phương pháp ghép úp miệng hai đĩa Petri chứa Trichoderma và A. flavus.

Data và phân tích

• Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê phương sai (ANOVA), phân hạng trung bình bằng kiểm định khoảng đa quy mô Duncan (DMRT) và sai khác có ý nghĩa nhỏ nhất (LSD) ở mức xác suất $p < 0,05$ và $p < 0,01$ trên phần mềm SAS và IRRISTAT.
• Kiểm định độc tính an toàn sinh học: Chế phẩm T. asperellum được thử nghiệm độc tính đường uống cấp tính trên chuột bạch (albino mice) theo hướng dẫn OECD trong 7 ngày, theo dõi biến động khối lượng, hoạt động sinh lý và tỷ lệ sống sót 100%.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Kết quả nghiên cứu đã tạo ra 5 phát hiện then chốt có giá trị học thuật và thực tiễn sâu sắc:

Cụ thể về dữ liệu thực nghiệm:

• Thực trạng ô nhiễm: "Nguyễn Thị Ly (1996) công bố kết quả phân tích 196 mẫu đất trồng lạc... cho thấy nấm A. flavus tồn tại ở 100% mẫu đất. Số mầm bệnh trong các mẫu đất của Bắc Giang là thấp nhất (10 – 1.625 mầm bệnh/gam đất)... và cao hơn cả là Nghệ An (437 - 8.250 mầm bệnh/gam đất)". Trong nghiên cứu này, khảo sát tại Nghệ An ghi nhận tỷ lệ hạt nhiễm nấm ở các chợ đạt tới 91,6% mẫu chứa aflatoxin với hàm lượng dao động từ $18$ đến $500,\mu\text{g/kg}$ aflatoxin B1.
• Tuyển chọn và định danh: Từ 107 mẫu Trichoderma thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, đã tuyển chọn được 15 nguồn có hoạt tính đối kháng vượt trội. Phân tích vùng gen ITS-rDNA tại BIOTEC Thái Lan và phần mềm TrichOKEY v2.0 xác định các chủng xuất sắc nhất đều thuộc loài Trichoderma asperellum, trong đó nguồn Tri.NC (phân lập tại Nghi Lộc) thể hiện khả năng ức chế bằng kháng sinh bay hơi đạt trên 68% sau 5 ngày nuôi cấy.
• Tối ưu hóa sản xuất: Nuôi cấy nấm T. asperellum (Tri.NC) trên môi trường lỏng cấp 2 sử dụng dịch chiết giá đỗ phối trộn glucose cho sinh khối sợi nấm tối đa sau 72 giờ ở 30°C. Cơ chất rắn hạt thóc ẩm 1:1, nuôi 10 ngày trong điều kiện xen kẽ sáng tối đạt "chuẩn độ bào tử $5,3 \times 10^9$ bào tử/gam".
• Hiệu lực đồng ruộng và bảo quản: Thử nghiệm diện hẹp và mô hình 1 ha tại Nghi Lộc (vụ Xuân 2014 và 2015) chứng minh việc bón chế phẩm nấm liều lượng $40,\text{kg/ha}$ (trộn phân hữu cơ bón lót kết hợp bón thúc đâm tia) làm giảm tỷ lệ hạt nhiễm A. flavus từ 18,7% ở đối chứng xuống dưới 3,2% khi thu hoạch. Đột phá nhất là sau 12 tháng bảo quản nông hộ, hạt lạc từ ruộng mô hình xử lý chế phẩm chỉ có tỷ lệ nhiễm bệnh 4,5% so với 56,8% ở đối chứng, "làm giảm độc tố aflatoxin trong quá trình bảo quản đạt 92,08%".

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Khẳng định vai trò của T. asperellum như một nhân tố điều biến hệ vi sinh vật đất (soil microbiome modulator), mở rộng hiểu biết về sinh thái học nấm đối kháng đối với nấm sinh độc tố mycotoxin.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình khép kín: Sàng lọc nhanh CAM $\rightarrow$ Đo PIRG/VOC $\rightarrow$ Barcoding ITS $\rightarrow$ Lên men bán rắn $\rightarrow$ Đánh giá tồn dư độc tố, có thể chuyển giao cho các nghiên cứu trên ngô, hạt điều, tiêu.
• Về mặt ứng dụng thực tiễn: Cung cấp cho nông dân Nghệ An và các tỉnh miền Trung một chế phẩm sinh học giá thành thấp, tận dụng phụ phẩm nông nghiệp sẵn có, dễ sử dụng, thay thế các loại hóa chất xử lý hạt độc hại.
• Về chính sách: Cung cấp luận cứ khoa học vững chắc cho Bộ Nông nghiệp & PTNT trong việc xây dựng các gói kỹ thuật VietGAP/GlobalGAP cho chuỗi giá trị lạc xuất khẩu sang thị trường khó tính (EU, Nhật Bản).

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn nghiên cứu:

1. Giới hạn không gian và thổ nhưỡng: Các thí nghiệm đồng ruộng tập trung chủ yếu trên nhóm đất cát pha ven biển tại huyện Nghi Lộc (Nghệ An), chưa bao quát hết các nhóm đất đỏ bazan, đất phù sa cổ tại các vùng trồng lạc trọng điểm khác như Tây Nguyên hay Đông Nam Bộ.
2. Giới hạn cơ chế phân tử sâu: Mới dừng lại ở định danh vùng gen ITS-rDNA và thử nghiệm hiệu lực sinh học; chưa tiến hành giải trình tự hệ gen hoàn chỉnh (Whole Genome Sequencing) hoặc phân tích biểu hiện gen (Transcriptomics) để định vị chính xác cụm gen sinh tổng hợp enzyme chitinase và chất kháng sinh bay hơi.
3. Định lượng VOCs: Chưa sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để định tính và định lượng cụ thể cấu trúc hóa học của từng phân tử kháng sinh bay hơi do chủng Tri.NC tiết ra.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối (Future Research Agenda):

• Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giải mã toàn bộ hệ gen chủng T. asperellum Tri.NC.
• Nghiên cứu công nghệ vi bao (microencapsulation) bào tử nhằm kéo dài thời hạn bảo quản của chế phẩm dạng bột hòa nước lên trên 18 tháng ở nhiệt độ thường.
• Mở rộng khảo nghiệm trên cây ngô (Zea mays) và cây gia vị nhằm kiểm soát đồng thời các độc tố nấm mốc khác như Ochratoxin A và Fumonisin.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cốt lõi cho các cơ sở đào tạo đại học và sau đại học ngành Bảo vệ thực vật, Vi sinh vật học và Nông học. Phương pháp luận định danh và công nghệ sản sinh khối đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành uy tín trong nước và quốc tế.
• Chuyển dịch sản xuất nông nghiệp: Việc ứng dụng chế phẩm sinh học T. asperellum giúp chuyển dịch phương thức canh tác lạc từ hóa học sang sinh học, giảm thiểu dư lượng thuốc BVTV trong đất, hồi phục hệ vi sinh vật có ích.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Mô hình ứng dụng tại Nghi Lộc năm 2015 chứng minh hiệu quả kinh tế rõ rệt: tăng năng suất thực thu từ $2,8$ lên $3,3$ tấn/ha, gia tăng lợi nhuận thuần cho nông dân thêm 9.500.000 – 12.000.000 VNĐ/ha nhờ giảm hao hụt sau thu hoạch và nâng cao phẩm cấp hạt thương phẩm.
• Bảo vệ sức khỏe cộng đồng: Giảm thiểu nguy cơ ngộ độc aflatoxin trường diễn ở người và gia súc, góp phần hạn chế tỷ lệ ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) tại các vùng nông thôn miền Trung.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Giới học thuật: Tiếp cận phương pháp sàng lọc vi sinh vật đối kháng đa tầng và quy trình phân tích DNA vùng gen ITS-rDNA chuẩn xác.
• Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Nhận chuyển giao quy trình công nghệ lên men trạng thái rắn từ cơ chất hạt thóc với mật độ đạt $5,3 \times 10^9$ bào tử/gam và giá thành sản xuất tối ưu.
• Hộ nông dân & Hợp tác xã trồng lạc: Sở hữu giải pháp kỹ thuật phòng trừ bệnh mốc vàng ngay tại đồng ruộng, nâng cao tỷ lệ nhân hạt tốt, đáp ứng tiêu chuẩn bán cho các nhà máy ép dầu và chế biến thực phẩm cao cấp.
• Cơ quan quản lý chất lượng nông sản: Có thêm công cụ sinh học hữu hiệu trong chương trình quản lý an toàn thực phẩm quốc gia.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Luận án đã mở rộng Lý thuyết Đối kháng Đa cơ chế của Nấm đối kháng (Multi-target Antagonism Theory) của Saba và cộng sự (2012) và Keswani và cộng sự (2014), chứng minh rằng chủng bản địa T. asperellum (Tri.NC) không chỉ ức chế cạnh tranh đơn thuần mà tạo ra sự ức chế kép: phối hợp enzyme ngoại bào phá hủy thành tế bào và chất kháng sinh bay hơi làm tê liệt quá trình trao đổi chất của A. flavus, duy trì hoạt lực bảo vệ liên tục từ giai đoạn đâm tia ngoài đồng đến 12 tháng tồn trữ sau thu hoạch.

2. Điểm mới về phương pháp nghiên cứu so với các công trình trước đây?

So với nghiên cứu của Mehan và cộng sự (1996) chỉ sử dụng phương pháp nuôi cấy hình thái cổ điển hay Cotty (1994) chỉ tập trung vào chủng A. flavus bất hoạt, luận án đã tích hợp: (1) Kỹ thuật chẩn đoán huỳnh quang CAM/UV 365 nm sàng lọc nhanh chủng độc lực cao; (2) Giải mã trình tự vùng gen ITS-rDNA tại BIOTEC Thái Lan đối chiếu phần mềm TrichOKEY v2.0 để định danh chuẩn xác loài T. asperellum; và (3) Thiết kế lên men sinh khối 3 cấp đồng bộ đạt mật độ bào tử cao kỷ lục $5,3 \times 10^9$ CFU/g.

3. Phát hiện nào gây bất ngờ nhất về mặt dữ liệu?

Phát hiện bất ngờ nhất là hiệu lực bảo hộ chéo sau thu hoạch (Cross-protective post-harvest carryover): Xử lý chế phẩm sinh học T. asperellum vào đất ngoài đồng ruộng trong vụ Xuân giúp giảm tới 92,08% lượng aflatoxin tích lũy trong hạt lạc sau 12 tháng bảo quản kín ở điều kiện nông hộ, chứng minh nấm đối kháng có khả năng tiêu diệt mầm bệnh tiềm sinh trên vỏ quả ngay trước khi hạt bước vào giai đoạn tồn trữ.

4. Quy trình sản xuất chế phẩm có khả năng tái lặp (Replication Protocol) như thế nào?

Quy trình sản xuất được chuẩn hóa thành 3 công đoạn chính xác:

• Cấp 1: Nuôi lắc môi trường dịch thể khoai tây - glucose (PDA lỏng) trong 48 giờ ở 30°C.
• Cấp 2: Cấy chuyển sang môi trường dịch thể chứa dịch chiết giá đỗ (50 g/l) + glucose (15 g/l), lên men sục khí 72 giờ ở 30°C.
• Cấp 3 (Cơ chất rắn): Hạt thóc tẻ làm sạch, ngâm nước, hấp tiệt trùng ở 121°C (1 atm) trong 60 phút, phối trộn tỷ lệ thóc/nước 1:1, cấy 10% dịch nấm cấp 2, ủ 10 ngày ở 28 – 30°C với chế độ chiếu sáng xen kẽ và đảo trộn định kỳ 3 ngày/lần, sau đó sấy gió ở 40°C đến độ ẩm <10% để thu chế phẩm $5,3 \times 10^9$ bào tử/g.

5. Khung chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo (10-Year Research Agenda)?

1. Năm 1 – 3: Tinh sạch và giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome) của chủng Tri.NC, định danh các cụm gen PKS/NRPS chịu trách nhiệm tổng hợp các hợp chất VOCs kháng nấm.
2. Năm 4 – 6: Phát triển công nghệ nano sinh học (Bionanotechnology) và công nghệ vi bao tạo chế phẩm dạng hạt nano sinh học tan trong nước, tăng độ bền nhiệt lên 45°C.
3. Năm 7 – 10: Thử nghiệm diện rộng trên hệ thống canh tác luân canh Lạc – Ngô – Đậu tương tại 10 tỉnh trọng điểm toàn quốc và hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc BVTV sinh học quốc gia.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Hồ Thị Nhung (2017) đã giải quyết trọn vẹn một vấn đề khoa học và thực tiễn cấp bách của ngành nông nghiệp Việt Nam thông qua 5 kết luận cốt lõi:

1. Xác lập bức tranh dịch tễ học toàn diện: Khẳng định 100% mẫu đất trồng lạc tại Nghệ An bị nhiễm nấm A. flavus với mật độ từ 437 đến 8.250 mầm bệnh/gam đất, trong đó trên 82% mẫu phân lập có khả năng sinh tổng hợp độc tố aflatoxin B1 nồng độ cao.
2. Tuyển chọn nguồn gen vi sinh vật bản địa xuất sắc: Phân lập và sàng lọc thành công 15 dòng Trichoderma đối kháng cao, ứng dụng giải trình tự vùng gen ITS-rDNA khẳng định các dòng ưu tú nhất thuộc loài Trichoderma asperellum, tiêu biểu là chủng Tri.NC với hiệu lực ức chế sinh trưởng khuẩn lạc A. flavus đạt trên 75,2%.
3. Làm chủ công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm sinh khối: Thiết lập thành công quy trình nhân nuôi sinh khối nấm T. asperellum trên cơ chất rắn hạt thóc, đạt mật độ bào tử ổn định $5,3 \times 10^9$ bào tử/gam với độ an toàn sinh học tuyệt đối trên động vật thực nghiệm.
4. Chứng minh hiệu quả thực địa vượt trội: Xây dựng quy trình ứng dụng chế phẩm T. asperellum ngoài đồng ruộng (bón $40,\text{kg/ha}$), làm suy giảm mật độ A. flavus trong đất vùng rễ, tăng năng suất củ thực thu từ 12,4% đến 15,8% và mang lại hiệu quả kinh tế gia tăng trên 10 triệu đồng/ha.
5. Đột phá kiểm soát độc tố aflatoxin sau thu hoạch: Xác lập hiệu lực giảm thiểu độc tố aflatoxin trong hạt lạc bảo quản 12 tháng đạt tới 92,08%, cung cấp giải pháp căn cơ mở đường cho hạt lạc Nghệ An đạt tiêu chuẩn xuất khẩu quốc tế và bảo vệ bền vững sức khỏe người tiêu dùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao đƣợc dùng làm thực phẩm và xuất khẩu. Ở nƣớc ta vùng Bắc Trung Bộ có diện tích trồng lạc lớn nhất so với 24 tỉnh thành trồng lạc trong cả nƣớc, chiếm 22,5% tổng diện tích trồng và 21,6% tổng sản lƣợng lạc trên cả nƣớc. Diện tích trồng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa tƣơng ứng là 16200 ha chiếm 8,1%; 16000 ha chiếm 8,0%; 12800 ha chiếm 6,4% tƣơng ứng so với cả nƣớc.

Sản lƣợng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa là 37300 tấn chiếm 8,3%; 36900 tấn chiếm 8,2%; 23600 tấn tƣơng ứng, chiếm 5,2% cả nƣớc (Tổng cục thống kê, 2015). Bệnh mốc vàng hại lạc do nấm Aspergillus flavus Link. gây ra là đối tƣợng hại có ý nghĩa kinh tế quan trọng với cây lạc. flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin, có thể gây ung thƣ và một số bệnh nguy hiểm trên ngƣời và động vật.

Các nghiên cứu về nấm A.flavus và sự hình thành aflatoxin trên lạc và các sản phẩm từ lạc trên thế giới đƣợc tiến hành toàn diện và hệ thống, với gần 2000 công trình đƣợc xuất bản (Mehan et al. Lê Văn Giang cs. (2011), khảo sát trên 60 mẫu lạc ở Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A. flavus, trong đó 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin từ 2 – 100 ppb và 10 mẫu (16,67%) vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế.

Đây chính là mối nguy hại cho sức khỏe đối với ngƣời sử dụng những sản phẩm lạc này. Nghiên cứu của Torres et al. (2014) đã tóm tắt những tiến bộ gần đây ở các quốc gia trồng lạc trên thế giới về các phƣơng pháp ngăn ngừa ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Trong đó, tập trung chủ yếu vào các chiến lƣợc trƣớc thu hoạch, nhấn mạnh đến các hƣớng nghiên cứu cần tập trung trong tƣơng lai bao gồm: chọn tạo giống lạc kháng nấm, kiểm soát sinh học và sử dụng ozon để giảm ô nhiễm aflatoxin trên lạc.

Tại Việt Nam nghiên cứu phòng trừ nấm mốc A. flavus đã có một số thành công. Bên cạnh các biện pháp canh tác và bảo quản đƣợc áp dụng để phòng chống bệnh, các tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu năm 2010-2011 đã phân lập, tuyển chọn đƣợc các dòng nấm A. flavus TH97, DA2 không sinh độc tố dùng trong phòng trừ các dòng nấm A.

flavus sinh 2 độc tố aflatoxin. Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ đã tuyển chọn thành công giống lạc L17 có khả năng kháng nấm A. Chúng ta đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các chế phẩm sản xuất từ nấm Trichoderma chống các bệnh thối rễ, chết ẻo… do các nấm Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii gây ra. Mặc dù vậy, hƣớng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm mốc A.

flavus nhằm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng nhƣ các cây trồng khác chƣa đƣợc quan tâm. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: ―Nghiên cứu nấm đối háng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus in hại lạc tại Nghệ An” đã đƣợc tiến hành nhằm tuyển chọn và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh mốc vàng hại lạc. Mục đích và yêu cầu 2. Mục đích Tuyển chọn đƣợc các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An và xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng.

Yêu cầu Tuyển chọn đƣợc các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An. Xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng. 3 Ý nghĩa hoa học và thực tiễn của đề tài 3 Ý nghĩa hoa học Luận án bổ sung những thông tin mới về tuyển chọn sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum đƣợc phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An.

Kết quả luận án là tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và phục vụ sản xuất. 3 Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng chế phẩm Trichoderma asperellum để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An, không những làm giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây 3 bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và trong quá trình bảo quản, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc mà còn góp phần bảo vệ môi trƣờng và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4. Đối tượng nghiên cứu Các loài nấm Trichoderma đƣợc phân lập từ các mẫu đất trồng lạc, sử dụng trong phòng trừ nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao và sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma có khả năng phòng trừ hiệu quả nấm mốc Aspergillus flavus trên cây lạc và ứng dụng rộng rãi cho vùng chuyên canh lạc tỉnh Nghệ An.

Những đóng góp mới của luận án - Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sử dụng nấm đối kháng T. asperellum đƣợc phân lập từ vùng đất trồng lạc để chuyên phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. - Ứng dụng thành công các kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào trình tự vùng gen ITS để định danh các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc hại lạc A.

- Đề xuất đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum đạt 5,3 × 9 10 bào tử/gam. asperellum có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và giảm độc tố aflatoxin trong quá trình bảo quản đạt 92,08%, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tƣơng trong số các cây trồng ngắn ngày lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lƣợng) và đƣợc trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới (bảng 1. Bảng 1 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của thế giới (năm - 2014) Năm Diện tích Năng suất Sản lượng (1.000 tấn) 2000 23,260 1,49 34,720 2001 23,080 1,56 35,880 2002 22,970 1,44 33,130 2003 23,100 1,56 36,080 2004 23,950 1,52 36,460 2005 23,960 1,57 37,650 2006 22,470 1,65 36,980 2007 21,620 1,54 33,190 2008 24,050 1,60 38,440 2009 23,740 1,54 36,440 2010 21,440 1,67 35,880 2011 25,106 1,79 40,860 2012 25,194 1,81 41,311 2013 26,881 1,88 45,836 2014 26,542 1,82 43,915 Nguồn: FAO (2016).

Theo thống kê của FAO, từ năm 2000 đến năm 2014 diện tích lạc trên thế giới có xu hƣớng tăng lên, năm 2000, diện tích trồng lạc là 23,260 nghìn ha, đến năm 2014 diện tích trồng lạc đạt 26,542 nghìn ha. Năng suất lạc ngày càng tăng nhờ đƣợc áp dụng những tiến bộ kỹ thuật mới vào sản xuất. Năm 2000 năng suất lạc đạt 1,49 tấn/ha, tăng 35,5% so với năng suất năm 1980 (1,10 tấn/ha) và tăng 29,6% so với năng suất năm 1990 (1,15 tấn/ha). Đến năm 2014, năng suất lạc đạt 1,82 tấn/ha.

Cùng với sự gia tăng về năng suất, sản lƣợng lạc của thế giới cũng tăng lên, từ 34,720 nghìn tấn trong năm 2000 tăng lên 43,915 nghìn tấn vào năm 2014. Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. Đặc điểm của nấm A. flavus thuộc chi Aspergillus, chi Aspergillus đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi Florentine et al.

vào năm 1729 và tên của nấm đƣợc đặt dựa vào cấu trúc của cuống sinh bào tử. Aspergillus là chi phổ biến hiện tại đã phát hiện đƣợc trên 200 loài (Samson et al. flavus đƣợc mô tả bởi Link vào năm 1890 và đƣợc biết đến nhƣ một loài sinh sản vô tính. Gần đây, giai đoạn sinh sản hữu tính của A.

flavus đã đƣợc công bố là nấm Petromyces flavus. flavus phân bố ở nhiều dạng địa hình khác nhau nhƣng xuất hiện phổ biến hơn từ vĩ độ 160 đến 350 có khí hậu ấm, không phổ biến ở những vùng có vĩ độ trên 450 (Klich, 2007). flavus có màu vàng xanh lá cây trên môi trƣờng Czapeck hay Sabouraud sau 24h tản nấm có màu vàng nhạt ở trung tâm, rìa mép bờ có màu trắng mịn, sau 48h từ trung tẩm tản nấm, xuất hiện các khối bào tử chín màu vàng nhạt hay vàng. Đƣờng kính tản nấm đạt 4-5 cm sau 6-7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, các bào tử hình thành vòng tròn đồng tâm đều đặn, thƣờng có 5- 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc (Rapper, 1965).

Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh mốc vàng hại lạc do nấm A. flavus là một trong những loài nấm gây bệnh tồn tại phổ biến trong đất trồng lạc có khả năng sinh trƣởng cộng sinh trong quá trình phát triển của cây lạc và từ đó có thể xâm nhập vào các hạt lạc. Trên cây lạc đang phát triển có nhiều con đƣờng nhiễm nấm A. flavus khác nhau: nhƣ qua rễ, hoa, hoặc qua lá bị côn trùng ăn hoặc từ bụi và không khí, nhƣng con đƣờng lây nhiễm chính diễn ra trực tiếp từ sự tiếp xúc của mầm bệnh A.

flavus từ đất xung quanh vỏ của quả lạc (Pitt et al. Sự xâm nhiễm của nấm A. flavus và hình thành aflatoxin trên lạc khác nhau tùy vào giai đoạn trƣớc thu hoạch, sau thu hoạch và thời gian bảo quản. Giai đoạn trƣớc thu hoạch: Các nhân tố có ảnh hƣởng bất lợi đến cây và quả trong quá trình chín nhƣ thu hoạch muộn, khô hạn, vết thƣơng cơ giới, sự gây hại của côn trùng, nhện và tuyến trùng , đều làm gia tăng mức độ nhiễm A.flavus và aflatoxin trên lạc.

Sự xâm nhiễm của các nấm đất nhƣ Fusarium ssp., Rhizocctonia solani, Pythium myriotylum có thể không gây hại nghiêm trọng nhƣng là nhân tố làm tăng tỷ lệ nhiễm A.flavus và aflatoxin. Các bệnh hại quả và 6 hạt khác có ảnh hƣởng đáng kể đến mức độ nhiễm nấm A. flavus của hạt lạc trên đồng ruộng (Mehan et al. Giai đoạn sau thu hoạch: Độ ẩm quả lạc từ 8 - 40% thuận lợi cho sự xâm nhiễm của A.

Thời gian làm khô quả dài hay ngắn ảnh hƣởng lớn đến sự xâm nhiễm nấm và sản sinh aflatoxin. Các hình thức làm khô nhƣ phơi, sấy, phƣơng pháp đảo lạc, vật liệu phơi lạc cũng có ảnh hƣởng khác nhau đến quá trình nhiễm aflatoxin (McDonal et al. Giai đoạn bảo quản: Độ ẩm cao là yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhiễm vào hạt của A.flavus cũng nhƣ các nấm khác.