Luận văn thạc sĩ hus phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng.

• Tác giả: Vũ Thị Thanh
• Người hướng dẫn: PGS. Nghiêm Ngọc Minh
• Trường học: Trường đại học khoa học tự nhiên
• Chuyên ngành: Khoa học môi trường
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase để kiểm soát rệp muội hại cây trồng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Rệp muội hại cây trồng
• 1.2. Đặc điểm sinh học của rệp muội hại cây trồng
• 1.3. Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam
• 1.4. Thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc sinh học
• 1.5. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới
• 1.6. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng ở Việt Nam
• 1.7. Nấm ký sinh côn trùng
• 1.8. Hệ enzyme chitinase từ nấm sợi
• 1.9. Cấu trúc của chitinase
• 1.10. Cơ chế hoạt động của chitinase
• 1.11. Cơ chất cảm ứng của chitinase
• 1.12. Các nguồn thu nhận chitinase
• 1.13. Ứng dụng của chitinase
• 1.14. Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp
• 1.15. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
• 1.15.1. Nhiệt độ nuôi cấy
• 1.15.2. pH môi trường
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng
• 2.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp phân lập nấm
• 2.3.2. Sàng lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp hại ngô cao
• 2.3.3. Chọn lọc chủng nấm ký sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao
• 2.3.4. Xác định hoạt tính chitinase của chủng nấm ký sinh côn trùng
• 2.3.5. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm có độc lực diệt rệp hại ngô cao
• 2.3.6. Phương pháp phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA
• 2.3.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm được lựa chọn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có độc lực diệt rệp muội hại ngô cao
• 3.2. Tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao
• 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử của chủng nấm NM4
• 3.4. Xác định trình tự gene mã hóa 18S rRNA của chủng NM4
• 3.5. Tách chiết DNA tổng số của chủng nấm NM4
• 3.6. Nhân đoạn gene 18S rRNA của chủng NM4
• 3.7. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Penicillium sp.
• 3.7.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất
• 3.7.2. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất
• 3.7.3. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất
• 3.7.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
• 3.7.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.7.6. Ảnh hưởng của pH môi trường lên men
• 3.7.7. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ
• 3.7.8. Ảnh hưởng của thời gian lên men
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• THÔNG TIN CỦA CHỦNG NẤM PENICILLIUM SP. M4 TRÊN NGÂN HÀNG GEN NCBI
• PHỤ LỤC 3: CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN TỚI

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng và chitinase

Nấm ký sinh côn trùng là một trong những giải pháp sinh học hiệu quả để kiểm soát dịch hại, đặc biệt là rệp muội. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase, một enzyme quan trọng trong việc tiêu diệt côn trùng. Chitinase có khả năng phân hủy chitin, thành phần chính của lớp vỏ côn trùng, từ đó giúp kiểm soát sự phát triển của rệp muội hại cây trồng.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có khả năng phát triển trong cơ thể côn trùng, gây ra các bệnh lý nghiêm trọng. Chúng tiết ra các enzyme như chitinase, giúp tiêu diệt côn trùng bằng cách phân hủy lớp vỏ chitin. Nghiên cứu cho thấy rằng nấm ký sinh có thể phát triển nhanh chóng trong điều kiện môi trường thích hợp, từ đó tạo ra một lượng lớn enzyme cần thiết cho việc kiểm soát dịch hại.

1.2. Vai trò của chitinase trong kiểm soát rệp muội

Chitinase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu diệt rệp muội bằng cách phân hủy lớp vỏ chitin của chúng. Enzyme này không chỉ giúp nấm ký sinh xâm nhập vào cơ thể côn trùng mà còn làm giảm khả năng sống sót của chúng. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm ký sinh sẽ mở ra hướng đi mới trong việc kiểm soát dịch hại hiệu quả và bền vững.

II. Vấn đề và thách thức trong kiểm soát rệp muội

Rệp muội là một trong những loài côn trùng gây hại nghiêm trọng nhất đối với cây trồng. Chúng không chỉ làm giảm năng suất mà còn lây lan nhiều loại virus gây bệnh cho cây. Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để kiểm soát rệp muội đã dẫn đến nhiều hệ lụy về môi trường và sức khỏe con người. Do đó, cần tìm kiếm các giải pháp sinh học an toàn và hiệu quả hơn.

2.1. Tác động của rệp muội đến nông nghiệp

Rệp muội gây thiệt hại lớn cho nông nghiệp, làm giảm năng suất và chất lượng cây trồng. Chúng hút nhựa cây, làm yếu cây và tạo điều kiện cho các bệnh khác phát triển. Theo thống kê, thiệt hại do rệp muội gây ra lên tới hàng tỷ đô la mỗi năm trên toàn cầu.

2.2. Hạn chế của thuốc bảo vệ thực vật hóa học

Việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học không chỉ gây ô nhiễm môi trường mà còn làm giảm số lượng côn trùng có ích. Hơn nữa, rệp muội có thể phát triển kháng thuốc, làm cho việc kiểm soát trở nên khó khăn hơn. Do đó, cần thiết phải tìm kiếm các biện pháp sinh học thay thế.

III. Phương pháp nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. Các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH và nguồn dinh dưỡng cũng được tối ưu hóa để tăng cường khả năng sinh tổng hợp enzyme này.

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm

Quá trình phân lập chủng nấm ký sinh côn trùng được thực hiện từ các mẫu côn trùng bị nhiễm bệnh. Các chủng nấm được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm để xác định khả năng sinh tổng hợp chitinase. Việc tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính cao sẽ giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát rệp muội.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp chitinase

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH và nguồn dinh dưỡng được điều chỉnh để tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh các yếu tố này có thể làm tăng đáng kể hoạt tính của enzyme, từ đó nâng cao hiệu quả kiểm soát rệp muội.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nấm ký sinh côn trùng trong nông nghiệp

Nấm ký sinh côn trùng không chỉ giúp kiểm soát rệp muội mà còn có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nông nghiệp. Việc sử dụng chế phẩm từ nấm ký sinh có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học, bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

4.1. Lợi ích của việc sử dụng nấm ký sinh

Sử dụng nấm ký sinh côn trùng giúp kiểm soát dịch hại một cách tự nhiên, an toàn cho môi trường. Nấm ký sinh có khả năng phát tán nhanh và chỉ gây hại cho côn trùng có hại, không ảnh hưởng đến các loài có ích khác.

4.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng có thể giảm thiểu đáng kể thiệt hại do rệp muội gây ra. Các chế phẩm từ nấm ký sinh đã được thử nghiệm và cho thấy hiệu quả cao trong việc kiểm soát dịch hại, mở ra hướng đi mới cho nông nghiệp bền vững.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và enzyme chitinase mở ra nhiều triển vọng cho việc kiểm soát dịch hại trong nông nghiệp. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ nấm ký sinh không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

5.1. Tương lai của nghiên cứu nấm ký sinh

Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng sẽ tiếp tục được mở rộng, nhằm tìm kiếm các chủng nấm mới có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch hại và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

5.2. Hướng đi mới cho nông nghiệp bền vững

Việc áp dụng các biện pháp sinh học như nấm ký sinh côn trùng trong nông nghiệp sẽ góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, an toàn cho sức khỏe con người và bảo vệ môi trường. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Tổn thất sản lượng nông nghiệp toàn cầu do côn trùng gây hại ước tính chiếm khoảng 15% mỗi năm, riêng tại Hoa Kỳ con số này xấp xỉ 13%. Trong số hơn 300 loài côn trùng phá hoại nguy hiểm nhất thế giới, nhóm rệp muội chiếm tới khoảng 250 loài, gây thiệt hại kinh tế hàng tỷ USD cho nền nông nghiệp hàng năm. Tại Việt Nam, sự bùng phát của các loài dịch hại khiến sản lượng nông sản dự trữ hao hụt từ 3% đến 10% mỗi niên vụ nếu không có biện pháp bảo vệ hiệu quả. Điển hình như tại huyện Tân Kỳ và xã Nghĩa Dũng (tỉnh Nghệ An), dịch rệp cờ từng bùng phát gây hại trên 80% diện tích gieo trồng ngô, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và phẩm chất hạt.

Trước thực trạng việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây ô nhiễm môi trường đất, nguồn nước ngầm, diệt trừ thiên địch và để lại dư lượng độc hại trên nông sản, việc phát triển các giải pháp sinh học là yêu cầu cấp thiết. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề kiểm soát sinh học đối với rệp muội hại ngô (Aphis maydis) thông qua việc phân lập, sàng lọc các chủng nấm ký sinh côn trùng bản địa có độc lực cao và khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase ngoại bào mạnh mẽ.

Mục tiêu cụ thể của công trình là tuyển chọn chủng nấm có hoạt lực diệt rệp vượt trội, xác định phân loại phân tử dựa trên đoạn gene mã hóa 18S rRNA, đồng thời tối ưu hóa các thông số công nghệ lên men xốp nhằm nâng cao hoạt tính enzyme chitinase. Nghiên cứu được triển khai trên các mẫu đất và xác rệp thu thập tại khu vực Đồng Mai (Hà Đông) cùng bãi bồi sông Hồng (Hà Nội) trong giai đoạn từ năm 2010 đến 2013. Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn khi xác định được chủng nấm đạt tỷ lệ tiêu diệt rệp muội lên tới 92,3%, mở ra triển vọng sản xuất chế phẩm sinh học an toàn thay thế hóa chất độc hại, hướng tới nền nông nghiệp sinh thái bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) và cơ chế bệnh học của nấm ký sinh côn trùng thuộc các nhóm nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn (Deuteromycetes). Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh bắt đầu khi bào tử tiếp xúc với lớp biểu bì côn trùng, nảy mầm và hình thành ống mầm xuyên thủng lớp vỏ cutin. Vỏ cutin của côn trùng được cấu tạo từ phức hệ protein và chitin liên kết chặt chẽ. Do đó, quá trình xâm nhiễm phụ thuộc mật thiết vào hệ enzyme phân giải ngoại bào bao gồm protease, lipase và đặc biệt là chitinase.

Lý thuyết về hệ enzyme chitinase chỉ ra rằng enzyme này xúc tác thủy phân liên kết $\beta$-1,4-glucoside giữa các phân tử N-acetylglucosamine (GlcNAc) cấu thành nên bộ khung chitin của côn trùng. Chitinase được phân loại thành ba họ chính gồm Glycohydrolase 18, 19 và 20. Trong đó, các enzyme thuộc họ Glycohydrolase 18 phân bố rộng rãi ở nấm sợi, đảm nhận chức năng phân cắt nội mạch (endochitinase) và phân cắt ngoại mạch (exochitinase), giúp phá hủy cấu trúc vỏ cơ thể sâu hại nhanh chóng.

Bên cạnh đó, nghiên cứu áp dụng lý thuyết công nghệ lên men rắn (Solid-State Fermentation - SSF). Phương pháp lên men xốp tận dụng cơ chất dạng hạt từ phụ phẩm nông nghiệp như bột ngô, cám gạo, lõi ngô nhằm mô phỏng môi trường tự nhiên, giúp nấm sợi phát triển hệ sợi mạnh mẽ, tiêu tốn ít năng lượng, giảm lượng nước thải và đạt mật độ enzyme cao hơn so với lên men chìm truyền thống.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn mẫu được thu thập gồm mẫu đất bề mặt và xác rệp bị nhiễm nấm tự nhiên tại cánh đồng mía phường Đồng Mai, quận Hà Đông, Hà Nội. Phương pháp phân lập sử dụng kỹ thuật pha loãng bậc phân thập phân từ $10^{-1}$ đến $10^{-8}$ trên môi trường thạch PDA cải tiến có bổ sung hỗn hợp kháng sinh ampicillin (100 mg/l) và tetracycline (100 mg/l) nhằm ức chế vi khuẩn tạp nhiễm, ủ ở $30^\circ\text{C}$ trong thời gian từ 3 đến 5 ngày.

Thử nghiệm đánh giá độc lực sinh học được thực hiện trên đối tượng rệp ngô (Aphis maydis) thu thập từ bãi bồi sông Hồng. Cỡ mẫu thử nghiệm được chuẩn hóa với 25 con rệp cùng lứa tuổi trên một đơn vị thí nghiệm lá ngô tươi (diện tích 20-25 $\text{cm}^2$), lặp lại 3 lần độc lập (tổng số 75 cá thể rệp cho mỗi chủng nấm khảo sát). Bào tử nấm được thu nhận và pha huyền phù trong dung dịch Tween 80 nồng độ 0,05%, chuẩn hóa mật độ đạt $1 \times 10^8$ bào tử/ml bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 40 lần. Rệp được phun sương đều 10 ml dịch bào tử, nuôi dưỡng trong điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt ở nhiệt độ $30^\circ\text{C}$, độ ẩm không khí 70% và chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày trong 7 ngày. Tỷ lệ chết thực tế được hiệu chỉnh theo công thức Abbott chuẩn quốc tế.

Hoạt tính chitinase được định tính qua đường kính vòng phân giải trên đĩa thạch chứa 0,5% chitin sau khi nhuộm dung dịch Lugol 1%. Định lượng hoạt tính enzyme thô được tiến hành bằng phương pháp so màu với thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) ở bước sóng 540 nm, xác định hàm lượng đường khử N-acetyl-$\beta$-D-glucosamine giải phóng qua đường chuẩn nồng độ từ 0 đến 10 $\mu\text{mol/ml}$.

Định danh phân loại phân tử được thực hiện thông qua tách chiết DNA tổng số bằng lysozyme, SDS kết hợp Proteinase K. Đoạn gene 18S rRNA được nhân bản bằng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với cặp mồi chuyên biệt EF4f và Fung5R qua 32 chu kỳ nhiệt. Sản phẩm PCR tinh sạch bằng bộ kít AccuPrep được giải trình tự trên hệ thống máy tự động ABI PRISM 3100 Avant và phân tích cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm BLAST, ClustalX và MEGA4. Quá trình tối ưu hóa các thông số lên men xốp (nguồn cơ chất, độ dày môi trường từ 6 đến 25 mm, độ ẩm từ 40% đến 100%, nồng độ chitin cảm ứng từ 0% đến 2,5%, nhiệt độ từ 20 đến $40^\circ\text{C}$, pH từ 3 đến 10, nguồn nitơ vô cơ và thời gian lên men từ 4 đến 12 ngày) được tiến hành đơn biến nhằm xác định điểm hoạt độ cực đại.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân lập từ đất và xác rệp tự nhiên đã thu nhận được 6 chủng nấm sợi thuần khiết ký hiệu từ NM1 đến NM6. Đánh giá độc lực diệt rệp ngô (Aphis maydis) sau 7 ngày xử lý cho thấy sự phân hóa rõ rệt về hiệu lực sinh học giữa các chủng:

• Chủng NM4 thể hiện độc tính diệt rệp mạnh nhất, đạt tỷ lệ rệp chết lên tới 92,3 ± 2,1% ở ngày thứ 7. Sợi nấm phát triển bao phủ toàn bộ cơ thể rệp bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi phun.
• Chủng NM3 đạt hiệu lực diệt rệp cao thứ hai với tỷ lệ 88,4 ± 2,6% sau 7 ngày.
• Bốn chủng còn lại (NM1, NM2, NM5, NM6) chỉ đạt tỷ lệ tiêu diệt rệp dao động từ 39,3% đến 49,9%, thấp hơn gần 2 lần so với chủng NM4.

Khảo sát hoạt tính chitinase sơ bộ trên đĩa thạch khẳng định cả hai chủng NM3 và NM4 đều tạo vòng phân giải cơ chất chitin rõ nét, trong đó chủng NM4 tạo đường kính vòng thủy phân lớn vượt trội. Phân tích trình tự đoạn gene 18S rRNA dài khoảng 550 cặp bazơ (bp) và đối chiếu trên ngân hàng gene NCBI xác nhận chủng NM4 thuộc chi Penicillium, được định danh là Penicillium sp. NM4 và đăng ký mã số tiếp nhận quốc tế.

Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men xốp sinh tổng hợp chitinase của chủng Penicillium sp. NM4 đã xác lập bộ thông số tối ưu toàn diện:

• Nguồn cơ chất thích hợp nhất là bột ngô nguyên chất (hoạt độ enzyme cao gấp 1,4 đến 2,1 lần so với các nguồn cám gạo, lõi ngô hay gạo đơn lẻ).
• Khối lượng cơ chất tối ưu là 16 g trong bình tam giác 250 ml (tương ứng độ dày lớp cơ chất đạt 17 mm).
• Độ ẩm cơ chất ban đầu tối ưu đạt mức 60% (v/w).
• Nồng độ cơ chất cảm ứng chitin bổ sung đạt điểm tối ưu tại 1,0% (w/w).
• Nhiệt độ nuôi cấy lý tưởng là $30^\circ\text{C}$ và môi trường duy trì ở pH 6,0 (đệm sodium citrate 0,05 M).
• Nguồn nitơ vô cơ bổ sung hiệu quả nhất là urê ở nồng độ tối ưu 0,9% (w/w), giúp hoạt tính chitinase tăng hơn 1,6 lần so với môi trường không bổ sung nitơ.
• Thời gian lên men thu nhận hoạt tính enzyme đỉnh điểm là sau 7 đến 8 ngày nuôi cấy tĩnh.

Thảo luận kết quả

Khả năng tiêu diệt rệp vượt trội của chủng Penicillium sp. NM4 (92,3%) có mối tương quan thuận trực tiếp với năng lực sinh tổng hợp enzyme chitinase ngoại bào. Khi bào tử nấm tiếp xúc với vỏ rệp, việc tiết nhanh enzyme chitinase giúp phân giải các liên kết polymer chitin, tạo lỗ thủng cơ học cho phép sợi nấm xâm nhập sâu vào mô bào và khoang máu của vật chủ, dẫn đến hiện tượng rệp bị tiêu diệt hoàn toàn chỉ sau 3 đến 7 ngày. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu quốc tế trên các chi nấm ký sinh như Lecanicillium lecanii hay Beauveria bassiana, chứng minh rằng hoạt lực diệt sâu hại phụ thuộc quyết định vào mức độ cảm ứng của hệ enzyme phân giải vách.

Sự biến thiên hoạt tính enzyme theo các điều kiện môi trường có thể được minh họa trực quan thông qua các dạng biểu đồ chuyên dụng:

• Động thái diệt rệp theo thời gian được mô tả rõ nét bằng đồ thị đường biểu diễn (line chart), thể hiện tỷ lệ rệp chết tăng vọt từ ngày thứ 3 (vượt 50%) và đạt đỉnh tiệm cận cực đại ở ngày thứ 7 đối với chủng NM4 và NM3, tách biệt hoàn toàn so với đường dốc thoai thoải của các chủng đối chứng.
• Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất và nồng độ nitơ vô cơ được biểu diễn qua biểu đồ cột so sánh (bar chart), cho thấy cột giá trị hoạt tính của bột ngô và nồng độ urê 0,9% vượt trội rõ rệt so với các nguồn ammonium sulfate hay sodium nitrate.
• Ảnh hưởng đồng thời của pH và nhiệt độ thể hiện dạng đường cong hình chuông kinh điển, trong đó hoạt tính enzyme suy giảm mạnh khi nhiệt độ vượt quá $37^\circ\text{C}$ hoặc khi pH dịch chuyển sang môi trường kiềm (pH > 8,0).

Việc nấm Penicillium sp. NM4 đạt hoạt tính tối ưu trên cơ chất bột ngô ẩm 60% bổ sung 0,9% urê và 1% chitin ở $30^\circ\text{C}$ mang ý nghĩa thực tiễn rất cao. Điều kiện này hoàn toàn tương thích với điều kiện nhiệt đới gió mùa tại Việt Nam và tận dụng được nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ sẵn có tại địa phương để phục vụ sản xuất quy mô công nghiệp.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, luận văn đưa ra 4 nhóm khuyến nghị hành động cụ thể nhằm hoàn thiện công nghệ và ứng dụng vào sản xuất:

1. Chuẩn hóa quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học quy mô bán công nghiệp (pilot):

   • Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ sinh học phối hợp cùng các Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ địa phương.
   • Mục tiêu định lượng: Nâng quy mô lên men xốp từ bình tam giác lên hệ thống buồng lên men tầng 100 đến 500 lít, đảm bảo mật độ bào tử đạt $\ge 1 \times 10^9$ CFU/g và hoạt tính chitinase đạt $\ge 50$ U/g chế phẩm.
   • Lộ trình: Triển khai thực hiện trong thời gian 12 đến 18 tháng.

2. Thử nghiệm hiện trường và đánh giá an toàn sinh thái trên diện rộng:

   • Đơn vị thực hiện: Cục Bảo vệ thực vật phối hợp với các Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật tại các vùng chuyên canh ngô (Nghệ An, Phú Thọ, Đắk Lắk).
   • Mục tiêu định lượng: Đạt hiệu lực giảm mật độ rệp muội hại ngô từ 75% đến 85% trên đồng ruộng thực tế sau 5 đến 7 ngày phun, giảm thiểu 80% lượng thuốc trừ sâu hóa học sử dụng.
   • Lộ trình: Hoàn thành khảo nghiệm đồng ruộng trong 24 tháng qua 4 vụ gieo trồng liên tiếp.

3. Nghiên cứu phối chế đa thành phần và cải tiến dạng bào chế thương phẩm:

   • Đơn vị thực hiện: Các doanh nghiệp sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học và phân bón hữu cơ vi sinh.
   • Mục tiêu định lượng: Bổ sung chất mang, chất bám dính sinh học và phụ gia chống tia UV nhằm kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm trên 12 tháng ở nhiệt độ phòng ($25-30^\circ\text{C}$), duy trì tỷ lệ sống của bào tử $\ge 80%$.
   • Lộ trình: Thực hiện trong 12 tháng.

4. Xây dựng quy trình tích hợp quản lý dịch hại sinh học trong chuỗi nông nghiệp sạch:

   • Đơn vị thực hiện: Hệ thống Khuyến nông Quốc gia và các Hợp tác xã nông nghiệp.
   • Mục tiêu định lượng: Tổ chức tập huấn kỹ thuật chuyển giao cho khoảng 3.000 đến 5.000 hộ nông dân, áp dụng chế phẩm nấm ký sinh vào quy trình sản xuất ngô và rau an toàn theo tiêu chuẩn VietGAP/GlobalGAP.
   • Lộ trình: Triển khai thường niên theo các mùa vụ canh tác.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo chuyên sâu, mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng cụ thể:

1. Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Khoa học môi trường, Bảo vệ thực vật:

   • Giá trị tiếp cận: Cung cấp cơ sở lý luận chi tiết về sinh tổng hợp enzyme ngoại bào từ vi nấm, kỹ thuật sàng lọc độc lực côn trùng học và quy trình định danh phân tử bằng chỉ thị 18S rRNA.
   • Tình huống ứng dụng: Sử dụng làm tài liệu tham khảo cho các đề tài nghiên cứu về enzyme tái tổ hợp, công nghệ vi sinh xử lý môi trường hoặc làm bài giảng chuyên đề công nghệ sinh học nông nghiệp.

2. Kỹ sư công nghệ vi sinh và bộ phận R&D tại các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học:

   • Giá trị tiếp cận: Nắm bắt trọn vẹn công thức môi trường lên men rắn tối ưu (tỷ lệ bột ngô, 0,9% urê, 1% chitin, 60% độ ẩm) có tính khả thi kinh tế cao.
   • Tình huống ứng dụng: Trực tiếp áp dụng để thiết kế quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm diệt rệp muội và các chế phẩm enzyme chitinase thương mại.

3. Cán bộ quản lý nông nghiệp, khuyến nông và chuyên viên Chi cục Trồng trọt & Bảo vệ thực vật:

   • Giá trị tiếp cận: Cập nhật bằng chứng thực nghiệm về hiệu lực diệt rệp muội (92,3%) của chủng nấm bản địa, làm cơ sở khoa học xây dựng chính sách thay thế thuốc hóa học.
   • Tình huống ứng dụng: Xây dựng các mô hình cánh đồng mẫu lớn canh tác hữu cơ, kiểm soát dịch hại sinh học không để lại tồn dư hóa chất.

4. Học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên các trường đại học khối ngành khoa học tự nhiên:

   • Giá trị tiếp cận: Tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm chặt chẽ, phương pháp dựng đường chuẩn DNS đo enzyme, tính toán hiệu chỉnh Abbott và xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm chuyên dụng.
   • Tình huống ứng dụng: Định hướng phương pháp luận nghiên cứu khi thực hiện luận văn thạc sĩ, khóa luận tốt nghiệp trong lĩnh vực công nghệ enzyme và vi sinh học ứng dụng.

Câu hỏi thường gặp

Chủng nấm Penicillium sp. NM4 tiêu diệt rệp muội hại ngô theo cơ chế sinh học nào? Nấm tiêu diệt rệp chủ yếu qua con đường tiếp xúc biểu bì. Bào tử nấm bám dính vào lớp vỏ cutin của rệp, nảy mầm và tiết ra hệ enzyme ngoại bào gồm protease, lipase và đặc biệt là chitinase. Chitinase thủy phân lớp khung chitin, giúp ống mầm xuyên thủng biểu bì, xâm nhập vào xoang cơ thể, hút chất dinh dưỡng và phát triển hệ sợi nấm làm rệp chết sau 3 đến 7 ngày.

Vì sao phương pháp lên men rắn lại được lựa chọn để sản xuất chitinase thay cho lên men lỏng? Phương pháp lên men rắn có chi phí đầu tư thiết bị thấp, quy trình vận hành đơn giản và tiêu thụ ít năng lượng hơn lên men chìm. Đặc biệt, phương pháp này tận dụng trực tiếp các phụ phẩm nông nghiệp như bột ngô, cám gạo làm giá thể, tạo điều kiện thông khí tự nhiên giúp nấm sợi sinh trưởng tốt và thu được dịch enzyme có hoạt tính đậm đặc với lượng nước thải phát sinh tối thiểu.

Hiệu lực diệt rệp ngô của chủng nấm NM4 đạt mức cao nhất trong điều kiện môi trường nào? Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nhiệt độ $30^\circ\text{C}$ và độ ẩm không khí 70%, dịch huyền phù nấm Penicillium sp. NM4 ở mật độ $1 \times 10^8$ bào tử/ml đạt hiệu lực tiêu diệt rệp ngô lên tới 92,3 ± 2,1% sau 7 ngày xử lý. Rệp bắt đầu chết mạnh từ ngày thứ 2 và hệ sợi nấm mọc trắng bao phủ xác rệp từ ngày thứ 3.

Vai trò của việc bổ sung cơ chất cảm ứng chitin trong môi trường lên men là gì? Chitinase ở nấm sợi là enzyme cảm ứng. Việc bổ sung 1,0% (w/w) bột chitin huyền phù vào môi trường lên men đóng vai trò kích hoạt mạnh mẽ các gene mã hóa enzyme chitinase của nấm Penicillium sp. NM4, giúp tăng tốc độ tổng hợp và bài tiết enzyme ra môi trường ngoại bào cao hơn rõ rệt so với môi trường không chứa chitin.

Chế phẩm nấm ký sinh này có an toàn cho con người và hệ sinh thái đồng ruộng không? Chế phẩm có nguồn gốc từ nấm ký sinh côn trùng tự nhiên, cơ chế tác động chuyên biệt trên lớp vỏ chitin của côn trùng mục tiêu nên hoàn toàn không gây độc hại cho người, gia súc và động vật có xương sống. Chế phẩm không để lại dư lượng độc trong đất, không làm ô nhiễm mạch nước ngầm và bảo vệ an toàn các loài thiên địch hữu ích trên đồng ruộng.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 6 chủng nấm sợi từ mẫu đất và xác rệp tự nhiên tại Hà Nội, trong đó tuyển chọn được chủng NM4 có độc lực diệt rệp ngô (Aphis maydis) cao nhất đạt tỷ lệ 92,3 ± 2,1% sau 7 ngày.
• Đã định danh phân tử đoạn gene 18S rRNA xác định chủng NM4 thuộc chi Penicillium, đặt tên khoa học là Penicillium sp. NM4 và đăng ký dữ liệu trên GenBank/NCBI.
• Đã xác định chủng nấm NM4 có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase ngoại bào mạnh mẽ, đóng vai trò then chốt trong việc phân hủy lớp vỏ chitin bảo vệ của sâu hại.
• Đã xác lập trọn vẹn quy trình lên men xốp tối ưu: cơ chất bột ngô (16 g/bình 250 ml), độ ẩm 60%, 1,0% chitin cảm ứng, 0,9% urê, nuôi cấy ở $30^\circ\text{C}$, pH 6,0 trong thời gian 7 đến 8 ngày.
• Công trình đóng góp giải pháp công nghệ sinh học hoàn chỉnh, mở ra hướng sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh an toàn, thân thiện môi trường nhằm thay thế thuốc hóa học độc hại trong nông nghiệp.

Lộ trình tiếp theo cần tập trung nâng quy mô sản xuất pilot và thử nghiệm đồng ruộng diện rộng trong 12 đến 24 tháng tới. Kính mời các viện nghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất thuốc bảo vệ thực vật và các hợp tác xã nông nghiệp kết nối hợp tác chuyển giao công nghệ, chung tay phát triển các sản phẩm nông nghiệp sinh thái an toàn và bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Rệp muội hại cây trồng 1. Đặc điểm sinh học của rệp muội hại cây trồng Trong các loài sâu hại cây trồng có thể nói rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố tập trung nhất ở vùng ôn đới [36], rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với độ đa dạng thấp hơn.

Ước tính trên thế giới có khoảng 4000 loài rệp muội đã được phát hiện trong đó vùng Đông Nam Á có hơn 1000 loài. Trong số này có khoảng 250 loài rệp là côn trùng phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát [26]. Các loài thuộc họ rệp muội gây hại mạnh trong nông nghiệp phải kể đến như: rệp đào (Myzus persicae) gây hại trên cải, rệp bông (Aphis gossypii) gây hại trên cây bông, rệp muội hại ngô (Aphis maydis) gây hại trên cây ngô… Các loài thuộc họ rệp muội (Aphididae) có thân mềm, màu sắc khác nhau, từ màu xanh lá cây, vàng, nâu, đen, hồng hoặc hầu như không có màu. Rệp muội có kích thước rất nhỏ (từ 1-2 mm), hình quả lê, trần trụi, ở cuối bụng có phiến đuôi và 2 ống bụng ở 2 bên, có ba cặp chân phân đốt, mắt kép và một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ khung kitin.

Rệp có lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng màng) hoặc không cánh [3] (hình 1. Râu Chân Mắt Ống tiết Đầu Ngực Bụng Đuôi Hình 1. Cấu tạo ngoài của rệp Phương thức dinh dưỡng của rệp là chích hút nhựa cây bằng miệng. Chúng làm yếu cây bằng cách hút cạn nguồn dinh dưỡng và gây ảnh hưởng nghiêm trọng Trường đại học khoa học tự nhiên 3 Lớp cao học môi trường K19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh cho sự phát triển của cây.

Chúng tiết ra chất đường mật không chỉ làm đóng khí khổng của lá mà còn góp phần tăng sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mô quang hợp, ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất cây trồng. Thêm vào đó, các loài rệp còn là những phương tiện góp phần lây lan virus từ những cây bệnh sang các cây khỏe mạnh [27]. Rệp sinh sản bằng hai hình thức: đơn tính và hữu tính (là sự kết hợp giữa các cá thể khác nhau tạo ra trứng để tồn tại qua mùa đông). Tại vùng nhiệt đới, chu kỳ sinh trưởng của rệp muội rất ngắn từ 5-7 ngày [3].

Mỗi rệp cái đẻ trung bình 30-50 con, quá trình sinh con lặp đi lặp lại trong suốt mùa hè, sinh ra nhiều thế hệ. Trong điều kiện nhiệt độ 20-30oC một năm có thể tới 20-30 thế hệ. Tuy nhiên, vòng đời của rệp muội tương đối ngắn, phần lớn từ 15-20 ngày, cá biệt là 25-30 ngày. Các loài rệp muội có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm khá rộng, có một số loài như rệp cải phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 10-30oC.

Rệp muội là những loài côn trùng có sức tàn phá khủng khiếp trên nhiều loại cây trồng khác nhau như ngô, khoai tây, khoai lang, các cây họ dưa (cucurbitaceae) (dưa chuột, dưa tây, dưa hấu, bầu bí), họ cà (solanaceae) (như ớt chuông, cà tím, thuốc lá, cà chua), cam quýt, bông vải, đào, mận, mơ, táo, bắp cải, cải xanh, rau bina, rau diếp, cà rốt và họ cà rốt. Chúng đã gây thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do cây cho năng suất kém hoặc mất mùa. Mặt khác, thế giới mỗi năm cũng phải chi nhiều tỷ đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại cây trồng. Rệp muội gây hại bốn mùa, đặc biệt từ mùa xuân đến mùa thu, nhất là vào thời điểm thời tiết râm mát, độ ẩm không khí cao.

Rệp ngô có tên khoa học là Aphis maydis, thuộc họ rệp muội, là một trong những loại sâu hại quan trọng đối với người trồng ngô. Rệp hút nhựa ở trên nõn ngô, bẹ lá, bông cờ, lá bi, làm cho cây ngô mất hết dinh dưỡng, trở nên gầy yếu, bắp bé đi hoặc không hình thành bắp nếu bị hại từ giai đoạn cây còn nhỏ, chất lượng hạt xấu kém. Rệp phá hại làm giảm năng suất và phẩm chất ngô rõ rệt. Ngoài cây ngô chúng còn có nhiều loại cây ký chủ khác như: kê, cao lương, mía, cỏ trồng làm thức Trường đại học khoa học tự nhiên 4 Lớp cao học môi trường K19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh ăn cho gia súc… Mặt khác chúng còn là môi giới truyền virus gây một số bệnh cho cây bắp như potyvirus, virus màu vàng, bệnh vàng lùn, bệnh khảm lá, bệnh đỏ lá… [17].

Trong quần thể rệp thường thấy nhiều loại hình: Rệp cái không cánh, rệp cái có cánh và rệp con. Rệp trưởng thành có hai loại hình, rệp có cánh và rệp không cánh dài 1,5-2,3 mm, màu vàng nhạt hoặc xanh xám, cơ thể hình bầu dục, thân mềm. Chân và tuyến tiết sáp ngắn, màu xanh đen. Rệp cái có cánh có đầu, ngực màu đen và bụng màu xanh.

Rệp non màu xanh sáng, chân và tuyến tiết sáp giống như trưởng thành có màu đen (hình 1. Rệp non trải qua 7-10 lần lột xác mới thành rệp trưởng thành. Một năm có từ 7-10 lứa. Rệp ngô Aphis maydis Rệp ngô sinh sản theo lối đơn tính và đẻ con.

Chúng thường đẻ nhiều nhất ở nhiệt độ 30oC và đẻ ít nhất ở nhiệt độ 15oC [25]. Rệp ngô thường phát triển nhiều trong tháng 1 và tháng 2 lúc độ ẩm không khí cao. Từ tháng 4 trở đi số lượng rệp giảm dần. Trong mùa hè chỉ thấy rệp xuất hiện lẻ tẻ.

Rệp thường phá hại ở cây ngô từ giai đoạn 8-10 lá cho tới khi ngô chín sáp. Đến cuối vụ khi cây ngô đã già, không còn thức ăn nữa thì các con rệp có cánh di chuyển sang các cây ký chủ, đẻ ra rệp con không có cánh tiếp tục phát triển trên các cây ký chủ này cho tới vụ ngô sau. Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam  Tình hình rệp muội hại cây trồng trên thế giới Trường đại học khoa học tự nhiên 5 Lớp cao học môi trường K19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh Trên thế giới, rệp đang được coi là kẻ thù nguy hiểm đối với cây trồng. Rệp cây hại tại nhiều quốc gia và không cố định trong một vùng nhất định.

Những thiệt hại do rệp gây ra đang ngày càng nghiêm trọng và diễn ra trên diện rộng. Sản lượng nông nghiệp thế giới hàng năm bị thiệt hại khoảng 15% do côn trùng [33], ở Mỹ là 13% [59]. Mặc dù chưa có thống kê chính thức về thiệt hại nông nghiệp do rệp nhưng trong số 300 loài côn trùng gây hại nghiêm trọng [49] thì có đến 250 loài là rệp. Chúng là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải.

Theo nghiên cứu của các nhà côn trùng học Úc, ngành du lịch nước này đã thiệt hại 75 triệu USD/năm do nạn rệp hoành hành. Tình trạng nạn rệp lan tràn ở xứ sở này chỉ là một phần của đại dịch toàn cầu với số lượng rệp trên thế giới đã tăng lên gấp đôi mỗi năm. Các nhà côn trùng học cho biết, nguyên nhân là việc thay đổi biện pháp diệt côn trùng (không dùng thuốc xịt mà dùng mồi) và do sự gia tăng đáng kể lượng du khách đến từ các nước đang phát triển, nơi rệp vẫn còn đang hoành hành. Tại châu Á, rệp gây thiệt hại nghiêm trọng một số loại cây trồng, đặc biệt là dưa chuột, hại tiêu và cà chua.

Các rệp đào Myzus persicae thường phát triển nhanh trong mùa vụ và phát triển nhanh chóng đến tuổi trưởng thành nên tăng nhanh về số lượng. Ước tính thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do nạn rệp hoành hành. Tại 3 tỉnh của Thái Lan, trong tháng 7/2009 nạn rầy nâu hại lúa, rệp hại cây trồng đã bùng phát mạnh và gây thiệt hại khoảng 7,5 ngàn ha mỗi vụ. Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất trên thế giới, nhưng năng suất bị đe dọa nghiêm trọng bởi Aphis glycines (rệp đậu tương).

Sản lượng hạt bị thiệt hại ước tính khoảng 34% [65], theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con số thiệt hại thậm chí lên đến 48-72%. Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [30]. Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) ký sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là các loại cải và cải dầu. Ngoài ra nó còn ký sinh trên cà chua và bí xanh.

Ở phía Trường đại học khoa học tự nhiên 6 Lớp cao học môi trường K19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ môi trường Vũ Thị Thanh đông của miền Trung Ấn Độ, Lipaphis erysimi cùng với Myzus persicae và Brevicoryne brassicae là ba loại rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea). Trong đó Lipaphis erysimi phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,4- 91,3 % sản lượng [28]. Theo nghiên cứu của Patel và cộng sự (2004), nếu không có biện pháp bảo vệ, Lipaphis erysimi có thể gây thiệt hại 80,6-97,6% sản lượng cải dầu [57]. Trong một nghiên cứu khác, Razaq và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng, Lipaphis erysimi và Brevicoryne brassicae cũng gây thiệt hại 75,1-81,9% sản lượng cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [64].

Ngoài cải dầu, Brassica brassicae còn phá hoại nhiều cây quan trọng khác như súp lơ, cà rốt và củ cải. Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [54]. Myzus persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp truyển bệnh virus gây bệnh rụng lá ở khoai tây. Rệp truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [71].

Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng nguy hiểm đối với cây lương thực. Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch. Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng sự (2010), năng suất lúa mì có thể bị giảm 7,9-34,2 % do Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) phá hoại [21]. Như vậy với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết.

Biện pháp kiếm soát rệp và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp.