MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu Vi-rút cúm phân chia thành 4 loại: vi-rút cúm A-D dựa vào sự khác nhau của kháng nguyên nucleoprotein (NP) và kháng nguyên protein nền (matrix protein, M1), [1-3]. Trong các loại vi-rút trên, vi-rút cúm A gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho sức khỏe con người và gây đại dịch. Dựa vào protein bề mặt như hemagglutinin (HA) hoặc neuraminidase (NA), vi-rút cúm A chia thành các nhóm phụ khác nhau. 18 phân nhóm HA và 11 phân nhóm NA đã được xác định [4], và có thể tổ hợp thành hơn 100 HA-NA (H1-18N1-9) [4-5].
Hơn thế, theo sự phân tích đa dạng và cây phát sinh loài, HA và NA lần lượt được phân ra thành 280 và 202 nhóm phụ, điều này giúp hiểu thêm về sự tiến hóa và dịch tễ học của vi-rút cúm A [6]. Nhiễm cúm A và B theo mùa dẫn đến khoảng 3-5 triệu người mắc bệnh và khoảng 250 000-500 000 người chết hàng năm trên thế giới. Vi-rút cúm A đóng vai trò chính gây ra dịch bệnh lây theo đường hô hấp, tỉ lệ bệnh tật và tử vong cao [7]. Vi-rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, có dạng hình cầu với kích cỡ đường kính khoảng 80-120 nm.
Bộ gen của vi-rút cúm A chứa 8 phân đoạn RNA sợi đơn âm mã hóa cho 11 protein (PB1, PB2, PA, HA1, HA2, NP, NA, M1, M2 NS1, NS2). Virion của vi-rút cúm A chứa vỏ lipid lớp đôi, 3 protein xuyên màng của vi-rút được gắn chặt vào trong vỏ: glycoprotein HA, NA và protein kênh ion (M2), trái lại protein nền (M1) giữ phức hợp vRNP của vi-rút. Mỗi vRNP gồm mỗi phân đoạn của bộ gen, nhiều phân tử nucleoprotein (NP) và các tiểu đơn vị RNA polymerase, polymerase basic protein 1 (PB1), polymerase basic protein 2 (PB2) và polymerase acidic protein (PA). Ngoài ra Vasin và cộng sự còn phát hiện thêm một số protein như PB1-F2, PB1-N40, PA-X, PA- N155, PA-N182, M42 và NS3 [8].
Phức hợp vRNP là đơn vị cơ bản cho quá trình nhân bản và phiên mã (Hình 1. Cấu trúc của vi-rút cúm A và phức hợp vRNP Chức năng của PB1 là tiểu đơn vị xúc tác và là vị trí trung tâm của RNA polymerase [10-12], PA tham gia vào trong quá trình nhân bản và có hoạt tính endonuclease [13]. PB2 đóng vai trò nhận diện và gắn cấu trúc cap [14-16]. Quá trình nhân bản và phiên mã của vi-rút cúm A Đầu N của PB1 có vị trí 1-15 axit amin tương tác với đầu C của PA [10-11, 17- 18] và cấu trúc tinh thể của sự tương tác này đã được phân tích [19-20].
Đầu C của PB1, vị trí axit amin 678-757 tương tác với đầu N của PB2 [10-11, 17-18] và sự tương tác này cũng đã được phân tích bằng tinh thể hóa [21]. Trong số các tiểu đơn vị của RNA polymerase của vi-rút cúm thì PB1 chứa các vùng (motif) có bảo tồn cao [22]. Để kháng vi-rút cúm, vắc-xin có thể được dùng để ngừa 2 bệnh hoặc dùng thuốc để chữa trị. Vắc-xin hiệu quả và an toàn chống lại sự nhiễm vi-rút cúm đã hiện diện và sử dụng hơn 60 năm qua.
Tuy nhiên, kiến thức về đặc tính của kháng nguyên của những chủng mới cũng như thời gian để sản xuất vắc-xin, sự bảo vệ không đủ đối với các bệnh nhân thiếu miễn dịch dẫn đến không hiệu quả vắc-xin [23]. Nói chung, các tác nhân chống lại vi-rút cúm có thể được phân chia thành 2 nhóm cơ bản: các phân tử sinh học tổng hợp và các cơ chất có nguồn gốc từ sự ly trích thực vật. Sự đa dạng của kháng nguyên và yếu tố di truyền của vi-rút cúm có thể xem xét, nghiên cứu chủ điểm vào những loại thuốc chống vi-rút ở phổ rộng. Những loại thuốc này hiệu quả chống lại sự đa dạng của các chủng vi- rút cúm.
Có những hợp chất đã được biết chống lại các protein xuyên màng của vi-rút cúm chẳng hạn như DAS181(Fludase) chống HA [24], các chất ức chế NA, Oseltamivir (Tamiflu, Roche) và zanamivir (Relenza; GlaxoSmithKline) [25], và amantadine chống lại M2 [26-27] của vi-rút cúm. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng các vi-rút cúm kháng lại các hợp chất trên [26, 28- 32]. Sự tăng nhanh chóng của các chủng vi-rút kháng thuốc đánh dấu tiếp tục những chiến lược phát triển các thuốc mới với những hiệu quả chống vi-rút được cải thiện và mức độ an toàn cao hơn. RNA polymerase của vi-rút cúm là mục tiêu rất phù hợp cho sự phát triển chống lại vi-rút đặc hiệu ở phổ rộng mới bởi RNA polymerase của vi-rút cúm có cấu trúc bảo tồn cao thể hiện qua các chủng vi-rút cúm A, B và C [33-34].
Sự ức chế gắn cap của PB2, hoạt tính endonuclease của PA hoặc các domain trên PB1 đều có ý nghĩa cho liệu pháp chống vi-rút cúm [35-36]. Các nghiên cứu gần đây đề nghị rằng những tương tác bề mặt bên trong PB1-PA và PB1-PB2 mà đã xác định bằng phân tích tinh thể là những mục tiêu để tạo ra các thuốc mới chống lại tất cả các chủng vi-rút cúm A [20-21]. Đặc biệt vị trí từ axit amin 1-50 PB1 của vi-rút cúm A và B cho thấy độ bảo tồn cao, ngoại trừ vị trí axit amin 16, 27 và 44 [37]. 3 Để khảo sát sự tương tác protein-protein, có nhiều thí nghiệm đánh giá về sự tương tác được quan tâm, trong đó thí nghiệm bổ sung phân đoạn protein (protein-fragment complementation assay, PCA) được tiến hành vì nó là phương pháp đơn giản cho người sử dụng.
Trong thí nghiệm bổ sung phân đoạn protein, protein chỉ thị chẳng hạn như protein phát sáng huỳnh quang xanh [38-39] hoặc luciferase được tách thành 2 phân đoạn rời, mỗi phân đoạn rời được dung hợp với một thành phần tương tác (Hình 1.3), 2 phân đoạn chỉ thị đã bị cắt từ 1 protein chỉ thị có hoạt tính nhận biết thấp khi chúng ở xa, chúng có thể xây dựng lại hoạt tính khi chúng gần nhau nhờ các phần tử tương tác. Đặc tính của luciferase có thể hình thành [40], trong khi đó đặc tính của protein phát sát huỳnh quang xanh (GFP) không trở lại đặc tính như tự nhiên [41]. Thêm vào đó luciferase không cần ánh sáng kích hoạt ở bước sóng ngắn để phát hiện. Đặc điểm PCA Fluc.
Fluc được cắt thành 2 phần. Mỗi phân đoạn lần lượt được dung hợp với một trong các thành phần tương tác. Khi các thành phần tương tác ơ xa nhau, luminescence không tạo thành (A). Khi có sự tương tác protein với protein xảy ra, các domain của Fluc đến gần nhau (B).
Sự phục hồi lại cấu trúc, luminescence tăng mạnh (C). Khi có chất ức chế (thuốc), luminescence bị giảm hoặc không xuất hiện.2 Luận giải về việc đặt ra mục tiêu và những nội dung cần nghiên cứu của đề tài Dịch bệnh do vi-rút cúm A dẫn đến bệnh tật và tử vong cao cũng như gây thiệt hại về kinh tế. Bộ gen của vi-rút cúm là bộ gen RNA vì vậy kháng nguyên biến đổi rất nhanh, việc thiết kế vắc-xin ngừa bệnh do vi-rút này gây ra đòi hỏi phải hiểu biết sâu về đặc tính kháng nguyên thay đổi đó, thời gian thiết kế lâu, sự bảo vệ không đủ đối với các bệnh nhân thiếu miễn dịch dẫn đến không hiệu quả vắc- xin [23]. Tính thời điểm này chưa có vắc-xin để ngừa cho tất cả các chủng vi-rút cúm, mà chỉ có vắc-xin ngừa vi-rút cúm mùa hoặc sử dụng thuốc để điều trị.
Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng các loại thuốc trên tạo ra các chủng vi-rút cúm H1N1 kháng thuốc và dẫn đến không hiệu quả và tử vong. Do các chủng mới tạo ra có biến đổi các kháng nguyên dẫn đến không hiệu quả của thuốc [26, 28-32]. RNA polymerase (PB1, PB2 và PA) của vi-rút cúm có cấu trúc bảo tồn cao thông qua các chủng vi-rút cúm A, B và C. Trong số các tiểu đơn vị của RNA polymerase thì tiểu đơn vị PB1 có độ bảo tồn cao nhất [33-34].
Chính vì vậy chúng tôi lựa chọn PB1 là tâm điểm cho việc nghiên cứu về thuốc. Việc thiết kế thuốc cần đánh trúng đích vào tâm điểm của sự tương tác giữa PB1-PA hoặc PB1-PB2 [20-21], vì cấu trúc tinh thể của vị trí tương tác này đã được xác định. Nếu không có mặt một trong 3 tiểu đơn vị RNA polymerase thì không có sự nhân lên của vi-rút cúm. Các nghiên cứu trước thường sử dụng hệ thống tế bào để chuyển nạp vector biểu hiện PB1, PB2, PA, NP, vNS-luc (minireplicon assay) hoặc dùng vi-rút cúm gây nhiễm để sàng lọc thuốc.
Phương pháp thử nghiệm chất ức chế vi-rút nên dùng cho việc xác nhận chất ức chế đó có khả năng sử dụng làm thuốc cho việc điều trị bệnh nhiễm vi-rút cúm. Thêm vào đó việc sàng lọc theo các phương pháp này mất nhiều thời gian, tốn kém kém và chưa đánh trúng mục tiêu. 5 Trong nghiên cứu này chúng tôi dựa vào sự bảo tồn cao ở đầu N của PB1 tương tác với PA của các chủng vi-rút cúm A và B. Dựa vào sự tương tác này chúng tôi thiết kế thí nghiệm bổ sung phân đoạn protein (PCA).
Trong PCA, 1 protein chỉ thị luciferase (Fluc) được cắt thành 2 phân đoạn: domain cuối N và domain cuối C. Domain đầu N của luciferase dung hợp với đầu phân tử tương tác PB1 và đầu C của luciferase dung hợp với đầu phân tử tương tác PA hoặc ngược lại. Hoạt tính luciferase được xây dựng lại khi có sự tương tác xảy ra (PB1-PA) và hoạt tính này giảm mạnh khi có sự hiện diện của chất ức chế sự tương tác protein-protein chẳng hạn như thuốc. Với mô hình này được ứng dụng như một hệ thống sàng lọc thuốc nhanh và đặc hiệu ở mức độ phân tử cho polymerase PB1-PA của vi-rút cúm, sàng lọc với số lượng mẫu lớn, chuẩn bị dễ dàng và đặt biệt sàng lọc trúng đích (Hình 3).
Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đưa ra một số nội dung nghiên cứu như sau: - Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang các vector biểu hiện các gene mã hóa cho Fluc, NPB1-Nluc, NPB1-Cluc, CPA-Nluc và CPA-Cluc - Biểu hiện, tinh sạch các protein dung hợp Fluc, NPB1-Nluc, NPB1-Cluc, CPA- Nluc và CPA-Cluc - Thử nghiệm sự xây dựng lại hoạt tính luciferase dựa vào sự tương tác PB1-PA của RNA polymerase vi-rút cúm - Đánh giá hoạt tính của luciferase khi có chất ức chế sự tương tác PB1-PA của RNA polymerase vi-rút cúm 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Tạo một hệ thống sàng lọc thuốc nhanh, dễ sử dụng và đặc hiệu ở mức độ phân tử ức chế polymerase PB1-PA của vi-rút cúm A trên người 6 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.