Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học hóa mô miễn dịch và tình trạng methyl hóa gen rassf1a trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học, hóa mô miễn dịch và methyl hóa gen RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt.

• Tác giả: Vi Thuật Thắng
• Người hướng dẫn: Nguyễn Đình Tảo
• Trường học: Học viện Quân y
• Chuyên ngành: Khoa học y sinh
• Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học, hóa mô miễn dịch và tình trạng methyl hóa gen RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược giải phẫu, phôi thai, sinh lý, mô học và phân loại ung thư tuyến tiền liệt
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nghiên cứu mô bệnh học

Nghiên cứu mô bệnh học là một phần quan trọng trong việc chẩn đoán và phân loại ung thư tuyến tiền liệt. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các đặc điểm mô học của khối u, bao gồm cấu trúc, hình thái và sự phân bố của tế bào ung thư. Các tiêu chuẩn phân loại mô bệnh học được áp dụng dựa trên phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2004, giúp xác định chính xác loại và mức độ ác tính của khối u. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng trong các thể và biến thể của ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, đồng thời cung cấp thông tin quan trọng về sự xâm lấn và di căn của khối u.

1.1. Phân loại mô bệnh học

Phân loại mô bệnh học dựa trên các tiêu chuẩn của WHO năm 2004, bao gồm các thể và biến thể của ung thư biểu mô tuyến tiền liệt. Nghiên cứu xác định các típ mô bệnh học khác nhau, từ đó hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Các thể ung thư được phân loại dựa trên mức độ biệt hóa và sự hiện diện của các đặc điểm ác tính như xâm lấn mô đệm và dây thần kinh.

1.2. Đặc điểm mô học

Các đặc điểm mô học của ung thư tuyến tiền liệt bao gồm sự hiện diện của các tế bào ác tính, sự xâm lấn mô đệm và dây thần kinh, cũng như sự phân bố của các chất chứa trong lòng tuyến nang. Nghiên cứu cũng xác định tỷ lệ ung thư phối hợp với tân sản nội biểu mô độ cao (PIN), một yếu tố quan trọng trong tiên lượng bệnh.

II. Hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch là phương pháp quan trọng trong việc xác định các dấu ấn sinh học của ung thư tuyến tiền liệt. Nghiên cứu sử dụng các kháng thể đặc hiệu để đánh giá sự biểu hiện của các protein như PSA, CK34βE12, p63, CK7 và CK5/6. Kết quả cho thấy sự biểu hiện khác nhau của các dấu ấn này trong các típ mô bệnh học khác nhau, giúp phân biệt giữa tế bào ung thư và tế bào lành tính. Phương pháp này cũng hỗ trợ trong việc đánh giá mức độ xâm lấn và tiên lượng bệnh.

2.1. Ứng dụng hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch được sử dụng để xác định sự biểu hiện của các dấu ấn sinh học như PSA, CK34βE12 và p63. Các dấu ấn này giúp phân biệt tế bào ung thư với tế bào lành tính và đánh giá mức độ xâm lấn của khối u. Nghiên cứu cũng cho thấy sự biểu hiện của các dấu ấn này có liên quan đến mức độ biệt hóa và tiên lượng bệnh.

2.2. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch

Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy sự biểu hiện khác nhau của các dấu ấn sinh học trong các típ mô bệnh học khác nhau. Ví dụ, PSA thường biểu hiện mạnh trong các tế bào ung thư biệt hóa tốt, trong khi CK34βE12 và p63 thường biểu hiện yếu hoặc không biểu hiện trong các tế bào ung thư.

III. Methyl hóa gen RASSF1A

Methyl hóa gen RASSF1A là một cơ chế ngoại di truyền quan trọng trong ung thư tuyến tiền liệt. Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá tình trạng methyl hóa của gen RASSF1A trong các mẫu ung thư và tăng sản tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A cao trong các mẫu ung thư, đặc biệt là ở các khối u có mức độ biệt hóa thấp và xâm lấn mạnh. Điều này cho thấy vai trò của methyl hóa gen RASSF1A trong quá trình hình thành và tiến triển của ung thư.

3.1. Cơ chế methyl hóa

Methyl hóa DNA là quá trình thêm nhóm methyl vào DNA, dẫn đến sự bất hoạt gen. Trong ung thư tuyến tiền liệt, methyl hóa gen RASSF1A là một cơ chế phổ biến dẫn đến sự bất hoạt gen ức chế khối u. Nghiên cứu sử dụng phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) để xác định tình trạng methyl hóa của gen RASSF1A trong các mẫu ung thư.

3.2. Kết quả methyl hóa gen RASSF1A

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A cao trong các mẫu ung thư, đặc biệt là ở các khối u có mức độ biệt hóa thấp và xâm lấn mạnh. Điều này cho thấy vai trò của methyl hóa gen RASSF1A trong quá trình hình thành và tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư tuyến tiền liệt là bệnh lý ác tính phổ biến ở nam giới lớn tuổi (thường gặp ở người trên 65 tuổi). Bệnh thường có diễn biến thầm lặng, ít biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn sớm, dẫn đến việc phần lớn các trường hợp chỉ được phát hiện tình cờ qua xét nghiệm mô bệnh học sau phẫu thuật với chẩn đoán ban đầu là tăng sản lành tính tuyến tiền liệt. Về dịch tễ học, ung thư tuyến tiền liệt là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ hai ở nam giới tại các nước Bắc Âu và Bắc Mỹ. Tại Việt Nam, tỷ lệ phát hiện ung thư tuyến tiền liệt qua mô bệnh học sau phẫu thuật tăng sản lành tính chiếm khoảng 8%, và chiếm 3% trong tổng số các ung thư phủ tạng. Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở Việt Nam có xu hướng gia tăng rõ rệt, từ mức 2,3 - 2,5/100.000 dân vào năm 2002 lên 3,4/100.000 dân vào năm 2012, đứng thứ 10 trong các loại ung thư ở nam giới.

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật nội soi cắt u tuyến tiền liệt qua niệu đạo, nhu cầu chẩn đoán mô bệnh học chính xác, phân độ mô học và xác định giai đoạn bệnh ngày càng trở nên cấp thiết. Bên cạnh các tiêu chuẩn hình thái kinh điển, những biến đổi ngoại di truyền (epigenetics) — đặc biệt là hiện tượng methyl hóa quá mức (hypermethylation) vùng promoter của các gen ức chế khối u như gen RASSF1A (Ras-association domain family 1 isoform A) — đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh sớm của ung thư tuyến tiền liệt. Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Vi Thuật Thắng với đề tài "Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học, hóa mô miễn dịch và tình trạng methyl hóa gen RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt" (Chuyên ngành Khoa học y sinh, Mã số: 9720101; Người hướng dẫn: Nguyễn Đình Tảo, Nguyễn Ngọc Hùng; Cơ sở đào tạo: Học viện Quân y) được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu phối hợp giữa hình thái học, dấu ấn miễn dịch và biến đổi sinh học phân tử tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm hai nội dung chính:

1. Nghiên cứu một số đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến tiền liệt tại Bệnh viện Quân y 103 theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2004.
2. Xác định sự bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch, tình trạng methyl hóa gen RASSF1A và đối chiếu với một số đặc điểm mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu bệnh phẩm mô phẫu thuật nội soi và bệnh phẩm sinh thiết của bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến tiền liệt và bệnh nhân tăng sản lành tính tuyến tiền liệt được tiếp nhận, xử lý và phân tích tại Bệnh viện Quân y 103 và Học viện Quân y.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống các kiến thức nền tảng và cập nhật các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến giải phẫu, mô học, phân loại bệnh học và cơ chế phân tử của ung thư tuyến tiền liệt:

• Giải phẫu, phôi thai, sinh lý và mô học tuyến tiền liệt: Tuyến tiền liệt ở người trưởng thành nặng khoảng 20 gam, nằm dưới bàng quang và bọc quanh niệu đạo. Mô học tuyến tiền liệt có cấu trúc phức hợp ống - nang tuyến được bao quanh bởi mô đệm xơ - cơ, lót bởi hai lớp tế bào chính: lớp tế bào chế tiết bên trong (sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt - PSA và phosphatase acid) và lớp tế bào đáy dẹt bên ngoài đứng trên màng đáy mỏng, không có lớp cơ biểu mô (Ovalle và cộng sự, 2013; Frank).
• Hệ thống phân loại mô bệnh học quốc tế:
  • Phân loại WHO (1980): Phân chia u biểu mô thành lành tính và ác tính, gồm các dạng tuyến nang nhỏ, tuyến nang lớn, dạng bè/đặc, tế bào chuyển tiếp, tế bào vảy và không biệt hóa (Nguyễn Văn Hưng, 2005).
  • Phân loại AFIP (2000) của Viện Bệnh học Quân đội Hoa Kỳ: Bổ sung chi tiết các biến thể của ung thư biểu mô tuyến và tổn thương tân sản nội biểu mô (PIN).
  • Phân loại WHO (2004): Hệ thống hóa mã hình thái học ICD-O, quy chuẩn các biến thể của ung thư biểu mô tuyến nang (thể teo đét, giả tăng sản, tuyến bọt, dạng keo/nhầy, tế bào nhẫn, tế bào hạt ưa axit, giống u lympho - biểu mô, dạng sacôm) và ung thư biểu mô tuyến ống (dạng sàng, dạng nhú) (Eble và cộng sự, 2004).
  • Cập nhật phân loại WHO (2016): Bổ sung các phân nhóm u thần kinh nội tiết, ung thư biểu mô nội ống và biến thể tế bào khổng lồ đa hình thái (Humphrey và cộng sự, 2016).
• Hệ thống phân độ mô học Gleason và ISUP: Hệ thống phân độ do Donald F. Gleason công bố năm 1966 và được WHO chuẩn hóa năm 1993, dựa trên cấu trúc sắp xếp của tuyến ung thư với 5 độ mô học. Điểm Gleason là tổng của mẫu mô học thứ nhất (chiếm diện tích lớn nhất) và mẫu mô học thứ hai (chiếm diện tích lớn thứ nhì, >5% diện tích u). Luận án điểm lại cách phân nhóm kinh điển (Damjanov I. và cộng sự, 2007) gồm độ biệt hóa cao (Gleason 2-4), vừa (Gleason 5-7), thấp (Gleason 8-10) và phân nhóm độ ISUP (2014) gồm 5 nhóm độ mô học.
• Ứng dụng hóa mô miễn dịch: Tổng quan nguyên lý phản ứng kháng nguyên - kháng thể, kỹ thuật khuếch đại enzym qua phức hợp Avidin-Biotin (ABC) và Streptavidin-Biotin với chất hiển màu peroxidase (40 kD) kết hợp DAB/AEC. Các dấu ấn được sử dụng gồm PSA (đặc hiệu tế bào chế tiết tuyến tiền liệt), CK34βE12 và p63 (đặc hiệu tế bào đáy, giúp khẳng định tổn thương xâm lấn khi mất lớp tế bào đáy), CK7, CK5/6 (phân biệt biểu mô đường niệu và vảy) và actin (nhận diện mô đệm xơ - cơ).
• Cơ chế ngoại di truyền và methyl hóa gen RASSF1A: Quá trình methyl hóa ADN do các enzym DNA methyltransferase (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b) xúc tác, chuyển nhóm methyl từ S-adenosylmethionine (SAM) sang vị trí C5 của cytosine trong cặp dinucleotide CpG (Maxwell A. và cộng sự, 2015; Robertson K.; Agathanggelou A. và cộng sự, 2005). Luận án điểm lại hiện tượng methyl hóa dưới mức (hypomethylation) làm hoạt hóa các gen ung thư như Cmyc, H-RAS và nghiên cứu của Shao và cộng sự (2004) trên 8 gen (AQP1, CECR1, C1QR1, CTAG2, P53AIP1, TDRD12, BEX1, DYNLT3). Đồng thời, hiện tượng methyl hóa quá mức vùng promoter của gen ức chế khối u RASSF1A (locus 3p21) được xác định là biến đổi xảy ra sớm và có tỷ lệ cao trong ung thư tuyến tiền liệt.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình chuyên khảo kết hợp đồng bộ ba phương diện mô bệnh học chuẩn mực theo WHO 2004, hóa mô miễn dịch đa dấu ấn và kỹ thuật sinh học phân tử xác định tình trạng methyl hóa gen RASSF1A trên quần thể bệnh nhân tại Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và tiêu chuẩn phân tích

Luận án dựa trên các tiêu chuẩn chẩn đoán mô bệnh học của WHO (2004), thang điểm phân độ Gleason và phân loại ISUP (2014). Chẩn đoán xác định ung thư biểu mô tuyến nang tuyến tiền liệt dựa trên 3 tiêu chuẩn mô bệnh học đặc trưng ác tính:

1. Tế bào u xâm nhập dây thần kinh.
2. Khối u có hiện tượng tăng sinh xơ - nhầy.
3. Tuyến ung thư có cấu trúc cuộn giống tiểu cầu thận.

Bên cạnh đó, sự biến mất hoàn toàn của lớp tế bào đáy là tiêu chuẩn vi thể then chốt để phân biệt tổn thương ác tính với các tổn thương tăng sản hoặc teo đét lành tính.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án áp dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp phân tích thực nghiệm y sinh học:

Nhóm nghiên cứu	Phương pháp / Kỹ thuật thực hiện	Chỉ số và mục tiêu đánh giá
Nghiên cứu Mô bệnh học	Nhuộm Hematoxylin - Eosin (H.E) quy chuẩn, quan sát dưới kính hiển vi quang học.	Phân bố độ tuổi; xác định típ mô bệnh học theo WHO (2004); xác định các thể và biến thể; đánh giá tỷ lệ phối hợp PIN độ cao; tính điểm Gleason và phân nhóm độ biệt hóa; ghi nhận đặc điểm chất chứa trong lòng tuyến.
Nghiên cứu Hóa mô miễn dịch (HMMD)	Kỹ thuật miễn dịch enzym gián tiếp, sử dụng kháng thể đơn dòng/đa dòng với hệ thống phát hiện liên kết Streptavidin - Biotin - Peroxidase và chất hiện màu DAB.	Đánh giá mức độ bộc lộ dấu ấn: PSA (tế bào chế tiết u); CK34βE12 và p63 (tế bào đáy); CK7 và CK5/6 (biểu mô đường niệu và dị sản vảy); Actin (tế bào cơ trơn mô đệm).
Nghiên cứu Sinh học phân tử	- Tách chiết ADN từ mô đúc parafin. - Đánh giá chất lượng ADN bằng PCR gen nội chứng $\beta$-globin (cặp mồi GL-F/GL-R). - Xử lý biến đổi ADN bằng sodium bisulfite. - Kỹ thuật Methylation-Specific PCR (MSP).	- Cặp mồi đặc hiệu Methyl: RASSF1A-M210-F và RASSF1A-M211-R. - Cặp mồi đặc hiệu Không methyl: RASSF1A-Un-F2 và RASSF1A-Un-R2. - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, đọc kết quả dưới ánh sáng tia tử ngoại để xác định tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A.

Nguồn tư liệu, xử lý số liệu và y đức

• Bệnh phẩm: Mẫu mô phẫu thuật nội soi và mô sinh thiết tuyến tiền liệt được cố định trong dung dịch formol đệm trung tính 10%, đúc khối parafin và cắt lát mỏng 3-4 $\mu\text{m}$.
• Xử lý số liệu: Số liệu được thu thập, mã hóa và phân tích bằng các phần mềm thống kê y học chuyên dụng; so sánh các tỷ lệ bằng kiểm định chuẩn.
• Đạo đức nghiên cứu: Đề tài tuân thủ các quy chuẩn đạo đức nghiên cứu y sinh học, được Hội đồng Đạo đức và Khoa học của Học viện Quân y thông qua.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương này tổng kết có hệ thống 5 mảng kiến thức:

1. Giải phẫu, phôi thai, sinh lý, mô học và phân loại ung thư tuyến tiền liệt: Mô tả chi tiết cấu trúc giải phẫu hệ thống mạch máu (động mạch bàng quang dưới, động mạch trực tràng giữa), đám rối thần kinh thực vật hạ vị và hệ bạch huyết; nguồn gốc phôi thai từ tuần thứ 12 dưới tác động của androgen; đặc tính sinh lý tiết 0,5 - 2,0 ml dịch/ngày chứa phosphatase acid, acid citric và enzym tiêu protein; cấu trúc mô học nang tuyến với tế bào chế tiết và tế bào đáy. Trình bày chi tiết các bảng phân loại WHO 1980, AFIP 2000, WHO 2004 và WHO 2016.
2. Ung thư tuyến tiền liệt, tân sản nội biểu mô (PIN) và phân độ Gleason: Phân tích đặc điểm đại thể (ổ u màu trắng xám/vàng cam, ranh giới không rõ) và vi thể; phân loại 4 típ nguyên phát (UTBM tuyến, đường niệu, tế bào vảy, tế bào đáy); 4 mẫu cấu trúc của PIN độ cao (hình chùm, vi nhú, mặt sàng, dạng dẹt); nguyên lý phân độ mô học theo Gleason và phân nhóm độ ISUP (2014).
3. Xâm lấn và di căn: Đường lan tràn tại chỗ qua vỏ bao, túi tinh, cổ bàng quang và di căn hạch vùng (hạch bịt, hạch hạ vị), di căn xương (xương chậu, cột sống, xương sườn, xương đùi, xương sọ).
4. Hóa mô miễn dịch và ứng dụng: Nguyên lý kỹ thuật ABC, phức hợp kháng nguyên - kháng thể, vai trò của các kháng thể PSA, CK34βE12, p63, CK7, CK5/6, actin trong phân biệt u lành - ác và xác định nguồn gốc mô học.
5. Methyl hóa gen RASSF1A trong ung thư: Cơ chế sinh học phân tử của hiện tượng methyl hóa ngoại di truyền, cấu trúc locus 3p21 của RASSF1A, vai trò ức chế khối u và nguyên lý kỹ thuật MSP sau xử lý bisulfite.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Đối tượng nghiên cứu: Gồm 3 nhóm bệnh nhân tương ứng với các mục tiêu: nhóm xác định đặc điểm mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, nhóm nhuộm hóa mô miễn dịch và nhóm phân tích methyl hóa gen RASSF1A (kèm nhóm chứng tăng sản lành tính tuyến tiền liệt).
• Vật liệu, hóa chất và thiết bị: Hệ thống máy cắt lát mô, hóa chất nhuộm H.E, panel kháng thể đặc hiệu (PSA, CK34βE12, p63, CK7, CK5/6, actin), bộ kít tách chiết ADN, hóa chất xử lý bisulfite, hệ thống máy nhân gen PCR và thiết bị điện di gel agarose.
• Kỹ thuật thực nghiệm:
  • Quy trình xử lý mô học thường quy và đọc kết quả tiêu bản H.E theo tiêu chuẩn WHO 2004.
  • Quy trình nhuộm HMMD theo kỹ thuật liên kết Streptavidin - Biotin - Peroxidase, đối chứng dương và đối chứng âm.
  • Quy trình biến đổi ADN bằng bisulfite (chuyển Cytosine không methyl thành Uracil, giữ nguyên 5-methylcytosine) và phản ứng PCR khuếch đại gen $\beta$-globin kiểm tra chất lượng khuôn ADN.
  • Quy trình MSP sử dụng các cặp mồi chuyên biệt cho trạng thái methyl hóa và không methyl hóa của vùng promoter gen RASSF1A.
• Xử lý số liệu và vấn đề đạo đức: Phương pháp thống kê y học, xử lý biến số và văn bản chấp thuận của Hội đồng Đạo đức nghiên cứu y sinh.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả định lượng và hình ảnh thực nghiệm:

• Phân bố dịch tễ theo tuổi: Thống kê tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thư biểu mô tuyến tiền liệt theo từng nhóm tuổi.
• Đặc điểm mô bệnh học:
  • Xác định tỷ lệ các típ mô bệnh học theo WHO 2004, trong đó ung thư biểu mô tuyến nang chiếm ưu thế tuyệt đối bên cạnh các thể hiếm gặp như ung thư biểu mô tuyến ống, ung thư biểu mô đường niệu nguyên phát.
  • Tỷ lệ các biến thể của ung thư biểu mô tuyến nang (thể teo đét, thể giả tăng sản, thể tuyến bọt, thể nhầy, thể tế bào nhẫn...).
  • Tỷ lệ u phối hợp và không phối hợp với PIN độ cao; phân bố tỷ lệ theo các mẫu cấu trúc PIN (vi nhú, hình chùm, mặt sàng, dạng dẹt).
  • Phân bố tỷ lệ theo độ biệt hóa/nhóm điểm Gleason (mẫu mô học thứ nhất và mẫu mô học thứ hai).
  • Tỷ lệ hiện diện của các dấu hiệu ác tính đặc trưng: xâm nhập dây thần kinh, tăng sinh mô đệm xơ - nhầy, cấu trúc tuyến hình cầu thận và các dạng chất chứa trong lòng tuyến nang (tinh thể kết tinh, chất tiết đặc màu hồng).
• Kết quả hóa mô miễn dịch:
  • Tỷ lệ và mức độ bộc lộ PSA: Tế bào u biểu mô tuyến nang bộc lộ dương tính mạnh và lan tỏa trong bào tương, kể cả ở các vị trí tế bào u xâm nhập dây thần kinh.
  • Bộc lộ CK34βE12 và p63: Hoàn toàn âm tính ở các nang tuyến ung thư xâm lấn (mất lớp tế bào đáy), trong khi dương tính liên tục hoặc ngắt quãng ở các nang tuyến lành tính và vùng có PIN độ cao.
  • Bộc lộ CK7, CK5/6: Giúp phân định rõ ung thư biểu mô đường niệu nguyên phát/xâm lấn và dị sản vảy.
  • Bộc lộ Actin: Dương tính ở các tế bào cơ trơn của mô đệm, âm tính ở tế bào đáy và tế bào ung thư.
• Kết quả phân tích methyl hóa gen RASSF1A:
  • Đánh giá chất lượng ADN tách chiết và hiệu quả xử lý bisulfite qua phản ứng PCR gen $\beta$-globin (băng khuếch đại trước và sau xử lý).
  • Kết quả MSP xác định tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A ở nhóm mô ung thư biểu mô tuyến tiền liệt và nhóm mô tăng sản tuyến tiền liệt lành tính.
  • Tương quan giữa tình trạng methyl hóa RASSF1A với điểm Gleason, độ biệt hóa mô học, tình trạng u xâm nhập dây thần kinh và sự phối hợp với PIN độ cao.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương 4 phân tích, so sánh và đối chiếu các phát hiện của luận án với y văn:

• Phân tích mối liên quan giữa độ tuổi mắc bệnh với đặc điểm mô học tại Việt Nam.
• Đánh giá tính ứng dụng và độ chính xác của bảng phân loại WHO 2004 đối với các thể và biến thể của ung thư biểu mô tuyến tiền liệt; phân tích ý nghĩa lâm sàng của việc nhận diện tổn thương tiền ung thư (PIN độ cao).
• Bàn luận về tính đa dạng cấu trúc mô học và sự phân bố điểm Gleason, vai trò của mẫu mô học thứ nhất và thứ hai trong tiên lượng bệnh.
• Phân tích giá trị của 3 đặc điểm ác tính then chốt (xâm nhập thần kinh, tăng sinh xơ - nhầy, tuyến hình cầu thận) trong việc đưa ra chẩn đoán xác định trên các mẫu mô sinh thiết nhỏ.
• Phân tích giá trị chẩn đoán của panel kháng thể HMMD: Khẳng định sự phối hợp giữa dấu ấn tế bào u (PSA) và dấu ấn tế bào đáy (CK34βE12, p63) là tiêu chuẩn giúp giải quyết các trường hợp chẩn đoán khó giữa ung thư biệt hóa cao và tổn thương lành tính dạng teo đét/giả tăng sản.
• Thảo luận về cơ chế bất hoạt gen RASSF1A do methyl hóa promoter trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt; so sánh tỷ lệ methyl hóa trong nghiên cứu với các công bố của các tác giả trong nước và quốc tế, khẳng định tiềm năng ứng dụng của dấu ấn sinh học phân tử này trong hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt mô bệnh học:

   • Cung cấp bức tranh toàn diện về đặc điểm vi thể, tỷ lệ các típ, thể và biến thể của ung thư biểu mô tuyến tiền liệt theo phân loại WHO 2004 trên nhóm bệnh nhân tại Bệnh viện Quân y 103.
   • Xác lập tỷ lệ phân bố điểm Gleason và các nhóm độ biệt hóa, đồng thời làm rõ tỷ lệ xuất hiện các dấu hiệu ác tính đặc thù (xâm nhập dây thần kinh, tăng sinh mô đệm xơ - nhầy, cấu trúc hình cầu thận) và chất chứa lòng tuyến.
   • Đánh giá chi tiết sự đồng hành của tổn thương tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt độ cao (PIN độ cao) và các mẫu cấu trúc của nó trong ung thư biểu mô tuyến tiền liệt.

2. Đóng góp về mặt hóa mô miễn dịch:

   • Xây dựng và kiểm chứng giá trị chẩn đoán của bảng dấu ấn miễn dịch đa thông số: Sử dụng PSA để xác định nguồn gốc tế bào biểu mô tuyến tiền liệt; sử dụng phối hợp kháng thể kháng cytokeratin trọng lượng phân tử cao (CK34βE12) và p63 để nhận diện sự hiện diện/biến mất của tế bào đáy, giúp phân biệt rõ ràng giữa tổn thương ung thư vi xâm lấn và các tổn thương tăng sản hoặc teo đét tuyến lành tính.
   • Xác định giá trị của CK7, CK5/6 và actin trong chẩn đoán phân biệt ung thư biểu mô tuyến tiền liệt với ung thư biểu mô đường niệu xâm lấn và các khối u mô đệm.

3. Đóng góp về mặt sinh học phân tử:

   • Thiết lập thành công quy trình kỹ thuật tách chiết ADN từ mẫu mô đúc parafin, xử lý bisulfite và phân tích methyl hóa gen RASSF1A bằng kỹ thuật MSP với các cặp mồi chuyên biệt.
   • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về tỷ lệ methyl hóa gen RASSF1A ở mô ung thư so với mô tăng sản lành tính, chỉ ra mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa với độ biệt hóa Gleason và mức độ xâm lấn vi thể.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Đối tượng nghiên cứu được thu thập tại một trung tâm y tế (Bệnh viện Quân y 103), cỡ mẫu nghiên cứu kỹ thuật sinh học phân tử ở mức độ đại diện cho nhóm nghiên cứu thực nghiệm.
  • Phân loại hình thái học của luận án bám sát khung chuẩn WHO (2004) — là hệ thống phân loại chính thức tại thời điểm triển khai đề tài, các sửa đổi theo WHO (2016) được cập nhật ở phần tổng quan lý thuyết.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm với cỡ mẫu lớn hơn để theo dõi dọc mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen RASSF1A với tỷ lệ tái phát sinh học sau điều trị phẫu thuật hoặc xạ trị.
  • Kết hợp phân tích thêm các gen ức chế khối u khác cùng bị methyl hóa (như GSTP1, p16) nhằm xây dựng bộ chỉ điểm sinh học phân tử đa gen có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán sớm và tiên lượng ung thư tuyến tiền liệt.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho nhiều đối tượng:

• Bác sĩ Giải phẫu bệnh: Tham khảo các tiêu chuẩn hình thái học phân biệt ung thư biểu mô tuyến nang với các tổn thương lành tính, quy trình áp dụng bảng kháng thể HMMD (PSA, CK34βE12, p63) trong xử lý các mẫu sinh thiết khó.
• Bác sĩ Ngoại Tiết niệu và Ung bướu: Hiểu rõ mối tương quan giữa điểm Gleason, phân nhóm độ ISUP, mức độ xâm nhập vỏ bao/dây thần kinh và biến đổi ngoại di truyền để định hướng phác đồ điều trị và đánh giá tiên lượng.
• Học viên sau đại học và Nghiên cứu sinh ngành Y sinh: Tham khảo thiết kế nghiên cứu kết hợp giữa giải phẫu bệnh học kinh điển, kỹ thuật hóa mô miễn dịch và phương pháp sinh học phân tử (tách chiết ADN mô vùi parafin, bisulfite-MSP).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Phân loại mô bệnh học nào được luận án sử dụng làm khung phân tích chính?

Luận án sử dụng Bảng phân loại mô bệnh học các khối u tuyến tiền liệt của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2004 (WHO 2004) làm khung phân loại chính cho các típ mô bệnh học, các thể và biến thể của ung thư biểu mô tuyến tiền liệt.

2. Dấu ấn hóa mô miễn dịch nào được sử dụng để nhận diện tế bào đáy nhằm phân biệt u lành và u ác?

Luận án sử dụng hai dấu ấn đặc hiệu cho tế bào đáy là Cytokeratin trọng lượng phân tử cao dòng 34betaE12 (CK34βE12) và protein nhân p63. Sự mất hoàn toàn lớp tế bào đáy (âm tính với CK34βE12 và p63) là bằng chứng mô học quan trọng khẳng định ung thư biểu mô xâm lấn.

3. Phương pháp sinh học phân tử nào được dùng để xác định tình trạng methyl hóa gen RASSF1A?

Luận án sử dụng kỹ thuật MSP (Methylation-Specific PCR) sau khi xử lý ADN tách chiết từ mô bệnh phẩm bằng hóa chất sodium bisulfite. Phản ứng sử dụng cặp mồi methyl (RASSF1A-M210-F/RASSF1A-M211-R) và cặp mồi không methyl (RASSF1A-Un-F2/RASSF1A-Un-R2), với gen nội chứng là $\beta$-globin (GL-F/GL-R).

4. Ba đặc điểm mô bệnh học nào có giá trị quyết định chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến tiền liệt?

Theo y văn và tiêu chuẩn được luận án áp dụng, ngoài sự xâm lấn ra ngoài tuyến, 3 đặc điểm vi thể quyết định chẩn đoán ác tính gồm: tế bào u xâm nhập dây thần kinh, khối u có hiện tượng tăng sinh mô đệm xơ - nhầy, và cấu trúc tuyến ung thư cuộn lại giống hình tiểu cầu thận.

5. Dấu ấn PSA có vai trò gì trong chẩn đoán hóa mô miễn dịch của luận án?

Kháng thể kháng PSA đặc hiệu cho tế bào biểu mô chế tiết của tuyến tiền liệt. Khi nhuộm HMMD, PSA giúp xác định chắc chắn nguồn gốc tuyến tiền liệt của khối u biểu mô nguyên phát và các ổ ung thư di căn hoặc xâm lấn, đồng thời phân biệt với ung thư biểu mô đường niệu hoặc ung thư từ cơ quan khác lan tới.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Vi Thuật Thắng đã hoàn thành nghiên cứu toàn diện về đặc điểm mô bệnh học theo phân loại WHO 2004, phân độ Gleason và tổn thương PIN độ cao trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến tiền liệt tại Bệnh viện Quân y 103. Công trình đã làm rõ giá trị chẩn đoán của panel hóa mô miễn dịch kết hợp dấu ấn tế bào u (PSA) và dấu ấn tế bào đáy (CK34βE12, p63) trong việc xác định ung thư xâm lấn và phân biệt với các tổn thương lành tính. Đồng thời, luận án đã xác lập thành công kỹ thuật MSP đánh giá tình trạng methyl hóa gen ức chế khối u RASSF1A, cung cấp bằng chứng thực nghiệm về mối liên quan giữa biến đổi ngoại di truyền với mức độ biệt hóa và tiến triển của ung thư biểu mô tuyến tiền liệt tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược giải phẫu, phôi thai, sinh lý, mô học và phân loại ung thư tuyến tiền liệt 1. Sơ lược về giải phẫu Tuyến tiền liệt (TTL) nằm trong khung chậu, sau xương mu, dưới bàng quang, giữa hai cơ nâng hậu môn, trước trực tràng và bao bọc quanh đoạn đầu niệu đạo. Tuyến tiền liệt có dạng hình nón, đáy ở trên, đỉnh ở dưới, ở người trưởng thành tuyến nặng khoảng 20 gam.

Vỏ bao của TTL không phải là vỏ thực sự mà do sự dày lên của mô đệm xơ-cơ ở vùng ngoại vi. Tuyến tiền liệt được cung cấp máu bởi động mạch bàng quang dưới và động mạch trực tràng giữa, các tĩnh mạch tạo thành đám rối tĩnh mạch TTL. Mạng lưới mạch bạch huyết của TTL tập trung chủ yếu ở lớp vỏ bao và vùng mô liên kết xung quanh TTL và đổ vào các hạch bạch huyết chậu trong. Tuyến tiền liệt có hệ thống đám rối thần kinh rất phong phú tách ra từ đám rối hạ vị.

Vùng gần vỏ bao và trong các bó mạch thần kinh thường có nhiều tế bào hạch thần kinh giao cảm. Những nhánh dây thần kinh nhỏ đi qua vỏ bao TTL để vào vùng tuyến, các nhánh dây thần kinh này có thể tiếp xúc hoặc thậm chí có thể ấn lõm vào một phía bờ của các nang tuyến bình thường. Sơ lược về phôi thai và sinh lý Từ tuần thứ 12 của thai kỳ, TTL được hình thành và phát triển dưới ảnh hưởng của androgen (testosterone là thành phần chính của androgen) được sản xuất từ tinh hoàn của thai nhi. Cùng với sự phát triển của nụ biểu mô, trung mô cũng phát triển theo và biệt hóa thành mô đệm xơ-cơ để hình thành mô đệm của TTL.

Các tuyến nằm gần ụ núi thường ngắn và có cấu trúc khá đơn giản, trong khi các tuyến ở xa thường dài hơn và có cấu trúc phức tạp hơn. Sau đó, các tuyến ở xa ụ núi lại chia nhánh vào vùng sau bên của tuyến và hiện tượng này cứ tiếp tục tới tận cùng là các nang tuyến [10], [17], [18]. Thiết đồ đứng ngang với hành niệu đạo được duỗi ra và thiết đồ đứng dọc tuyến tiền liệt Nguồn: Theo Frank. Thiết đồ nhìn sau và ngang qua tuyến tiền liệt Nguồn: Theo Frank.

5 Về sinh lý, dịch TTL được tiết ra bởi các tế bào chế tiết ở nang tuyến và ống tuyến sau đó đổ vào niệu đạo TTL. Dịch tiết của TTL góp phần tạo nên tinh dịch, trung bình mỗi ngày TTL tiết ra khoảng 0,5 - 2,0 ml dịch. Ngoài những thành phần chính là phosphatase acid và acid citric, còn có nhiều loại enzym tiêu hủy protein như fibrinolysin, fibrinogenase, aminopeptidase để góp phần làm loãng tinh dịch. Quá trình chế tiết của TTL chịu sự chi phối của hệ thần kinh giao cảm và đối giao cảm thông qua sự kích thích co thắt mô đệm xơ - cơ của TTL [18], [20].

Sơ lược về mô học Tuyến tiền liệt có cấu trúc dạng phức hợp ống tuyến, các đơn vị nang tuyến đổ vào những ống phân nhánh, các ống phân nhánh lại đổ vào ống dẫn chính, sau đó các ống dẫn chính lớn đổ vào niệu đạo TTL. Các ống dẫn chính này được lót bởi biểu mô chuyển tiếp ở vị trí đổ vào niệu đạo. Cấu trúc mô học của các nang tuyến và các ống dẫn nhỏ là tương tự nhau, chúng bao gồm lớp tế bào chế tiết và lớp tế bào đáy, do đó chúng cũng giống nhau về chức năng, ngoại trừ các ống dẫn nhỏ biểu mô chế tiết ít tạo nhú hơn so với nang tuyến. TTL không có lớp cơ biểu mô, mà chỉ có lớp tế bào đáy bên ngoài.

Lớp tế bào chế tiết bên trong sản xuất kháng nguyên đặc hiệu của TTL và phosphastase acid TTL. Lớp tế bào chế tiết nằm phía trên lớp tế bào đáy, đó là các tế bào hình khối vuông hoặc hình trụ, nhân đồng dạng nằm ở cực đáy, bào tương nhiều bọng nhỏ và có hạt, hiếm khi thấy không bào trong bào tương. Lớp tế bào đáy là những tế bào dẹt, đôi khi có hình vuông, bào tương ít, tỷ lệ nhân/bào tương cao, nhân tròn hoặc bầu dục, đôi khi có hạt nhân nhỏ ưa kiềm, bình thường lớp tế bào đáy chỉ có một hàng tế bào đứng trên màng đáy mỏng [21]. Chất chế tiết trong lòng của các nang tuyến bắt màu hồng nhạt khi nhuộm hematoxylin và eosin (H.

Các thể amylacea có dạng lá xếp đồng tâm và thường thấy trong nang tuyến bình thường. Các nang tuyến và ống 6 tuyến của TTL được bao xung quanh bởi mô đệm gồm các tế bào cơ trơn, nguyên bào sợi và sợi collagen… [16], [18], [22]. Mô học tuyến tiền liệt Nguồn: Theo Ovalle. và cộng sự (2013) [23].

Phân loại mô bệnh học ung thư tuyến tiền liệt Năm 1980, Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization: WHO) đã đưa ra bảng phân loại mô bệnh học (MBH) các khối u của TTL. Tuy nhiên, với sự phát triển mạnh mẽ về dấu ấn miễn dịch cho kháng nguyên đặc hiệu tế bào, đặc biệt là kháng nguyên tế bào u. Từ đó, một số tổn thương của TTL như tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt (prostatic intraepithelial neoplasia: PIN) và một số biến thể mới của UTBM TTL đã được phát hiện. Do đó, trong quá trình ứng dụng thực tế, bảng phân loại này đã dần bộc lộ một số hạn chế.

Để bổ sung một số tổn thương và một số biến thể mới đã được phát hiện. Năm 2000, Viện bệnh học Quân đội Hoa kỳ (Armed Force Institute of Pathology: AFIP) đã đưa ra bảng phân loại MBH tăng sản, u và các tổn thương giống u của TTL. Bảng phân loại này đã được nhiều Hội nghị quốc tế 7 thống nhất và được nhiều nước trên thế giới áp dụng, trong đó có Việt Nam. Đến năm 2004, WHO đã sửa đổi bảng phân loại về MBH các khối u TTL năm 1980 và công bố bảng phân loại về MBH các khối u TTL, đồng thời đưa ra mã hình thái học phân loại quốc tế về các bệnh cho khối u TTL cũng như hệ thống hóa cách gọi tên các khối u TTL.

Tuy nhiên, sau 12 năm, kể từ khi bảng phân loại mô học các khối u TTL của WHO (2004) ra đời, trong quá trình ứng dụng bảng phân loại này vào trong thực tế đã nảy sinh nhiều hiểu biết mới về bệnh học và di truyền học các khối u TTL. Vì vậy, năm 2016, WHO đã bổ sung và sửa đổi bảng bảng phân loại về MBH các khối u TTL (2004) và công bố bảng phân loại mô bệnh học mới nhất về các khối u TTL. Chúng tôi xin giới thiệu tóm tắt các bảng phân loại mô bệnh học khối u TTL đã được công bố: Bảng 1. Bảng phân loại mô bệnh học các khối u tuyến tiền liệt của Tổ chức Y tế Thế giới (1980) I.

Các u biểu mô II. Các u không thuộc biểu mô A. Lành tính III. Ung thư biểu mô tuyến V.

Các u không xếp loại a. Tuyến nang nhỏ VI. Các tổn thương giống u b. Tuyến nang lớn.

Dạng đặc/dạng bè e. Ung thư biểu mô tế bào chuyển tiếp 3. Ung thư biểu mô tế bào vảy 4. Ung thư biểu mô không biệt hoá Nguồn: Theo Nguyễn Văn Hưng (2005) [10].

Bảng phân loại mô bệnh học tăng sản, u và các tổn thương giống u tuyến tiền liệt của AFIP (2000). - Tăng sản - Các u hỗn hợp - U biểu mô lành tính - Các u trung mô - Tân sản nội biểu mô. - Các u khác - UTBM tuyến thông thường. - Các biến thể đặc biệt của UTBM - Các tổn thương giống u tuyến và các dạng khác UTBM tuyến ống.

UTBM tuyến nhày. UTBM tế bào nhẫn. UTBM tuyến-tế bào vảy. UTBM tế bào vảy.

UTBM nang dạng tuyến và dạng đáy. UTBM tế bào chuyển tiếp. UTBM tế bào nhỏ. UTBM dạng sacôm.

UTBM dạng limphô-biểu mô. UTBM không biệt hóa. Nguồn: Theo Nguyễn Văn Hưng (2005) [10]. Bảng phân loại mô bệnh học các khối u tuyến tiền liệt của Tổ chức Y tế Thế giới (2004) 1.

Các u biểu mô ICD-0 1. Các u biểu mô tuyến - UTBM tuyến nang: 8140/3* Biến thể teo đét. Biến thể giả tăng sản. Biến thể tuyến bọt.

Biến thể dạng keo/nhày. 8480/3 Biến thể tế bào nhẫn. 8490/3 Biến thể tế bào hạt ưa axit. 8290/3 Biến thể giống u limphô-biểu mô.

8082/3 Biến thể dạng sacôm 8572/3 - Tân sản nội biểu mô, độ III. 8148/2 - UTBM tuyến ống: 8500/3 Dạng sàng. 8201/3 Dạng nhú. U biểu mô đường niệu UTBM đường niệu.

Các u biểu mô tế bào vảy - UTBM tuyến-vảy. 8560/3 - UTBM tế bào vảy. Các u tế bào đáy - U tuyến tế bào đáy. 8147/0 - Ung thư tế bào đáy.

Các u di căn Nguồn: Theo Eble. và cộng sự (2004) [11]. 10 * Ghi chú: Mã hình thái học phân loại quốc tế về bệnh cho khối u (Morphology code of the Intenational Classification of Disease for Oncology: ICD-0 code) và hệ thống hóa cách gọi tên bệnh như sau: /0: Các khối u lành tính /2: Các ung thư tại chỗ và PIN độ III /3: Các khối u ác tính /1: U giáp biên ác tính (không rõ bản chất). Bảng phân loại mô bệnh học các khối u tuyến tiền liệt của Tổ chức Y tế Thế giới (2016) Các u biểu mô Các u biểu mô tuyến UTBM tuyến nang 8140/3 Biến thể teo đét Biến thể giả tăng sản Biến thể vi nang Biến thể tuyến bọt Biến thể dạng keo/nhày 8480/3 Biến thể tế bào giống tế bào nhẫn 8490/3 Biến thể tế bào khổng lồ đa hình thái Biến thể dạng sacôm 8572/3 Tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt độ cao 8148/2 Ung thư nội ống 8500/2 Ung thư tuyến ống 8500/3 Dạng sàng 8201/3 Dạng nhú 8260/3 Dạng đặc 8230/3 Ung thư biểu mô đường niệu 8120/3 Các u tế bào vảy Ung thư tuyến vảy 8560/3 Ung thư tế bào vảy 8070/3 Ung thư tế bào đáy 8147/3 11 Các khối u thần kinh - nội tiết Ung thư biểu mô tuyến với sự biệt hóa thần kinh – nội tiết.

8574/3 U thần kinh nội tiết biệt hóa cao 8240/3 Ung thư thần kinh nội tiết tế bào nhỏ 8041/3 Ung thư thần kinh nội tiết tế bào lớn 8013/3 Các khối u trung mô Các khối u tạo máu Các khối u di căn Nguồn theo: Humphrey. Ung thư tuyến tiền liệt, tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt và phân độ mô học ung thư biểu mô tuyến 1. Ung thư tuyến tiền liệt 1. UTTTL bắt đầu bằng nhiều ổ, thông thường lúc phát hiện ra các ổ này đã hòa nhập thành một khối, giới hạn không rõ.

Khi khối u xâm nhập vào vỏ bao của tuyến hoặc lan rộng đến túi tinh, trực tràng, bàng quang mới có thể phân biệt rõ khối u.