Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Vương Diệu Linh có tiêu đề: "Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt", thuộc chuyên ngành Di truyền học (Mã số: 62420121), được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Võ Thị Thương Lan tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2018. Đề tài nhận kinh phí hỗ trợ từ đề tài cấp nhà nước mã số KC.05/11-15 thuộc Bộ Khoa học và Công nghệ.
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Di truyền ngoại gen là cơ chế điều hòa thông tin di truyền thông qua methyl hóa DNA và biến đổi histone mà không làm thay đổi trình tự nucleotide. Hiện tượng methyl hóa quá mức tại các đảo CpG vùng promoter của các gen ức chế khối u dẫn đến sự bất hoạt gen, tạo điều kiện cho tế bào phân chia không kiểm soát và hình thành khối u.
Ung thư tuyến tiền liệt là bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu và có tỷ lệ tử vong cao ở nam giới trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Trong các biến đổi di truyền ngoại gen ở ung thư tuyến tiền liệt, gen GSTP1 (π-class glutathione S-transferase gene - mã hóa enzym khử độc tố gây ung thư) bị methyl hóa vùng promoter với tần suất cao (khoảng 85–90% ở các nghiên cứu quốc tế) nhưng hiếm khi xuất hiện ở các loại ung thư khác. Tỷ lệ methyl hóa GSTP1 có sự khác biệt giữa các chủng tộc và khu vực địa lý. Tại Việt Nam, vào thời điểm thực hiện đề tài, các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng về dấu chuẩn di truyền ngoại gen nói chung và methyl hóa GSTP1 trong ung thư tuyến tiền liệt nói riêng chưa được công bố. Việc xây dựng và tối ưu quy trình kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để phát hiện methyl hóa GSTP1 trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại Việt Nam là yêu cầu cấp thiết.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:
- Tối ưu hóa thành phần, điều kiện kỹ thuật và đánh giá độ nhạy của phản ứng MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt.
- Xác định mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư và quá sản lành tính tuyến tiền liệt.
- Phát triển kỹ thuật lai điểm (Dot blot) nhằm tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu:
- 96 mẫu mô bệnh phẩm đúc paraffin (gồm 59 mẫu ung thư tuyến tiền liệt có tỷ lệ tế bào ác tính >70% và 37 mẫu quá sản lành tính tuyến tiền liệt) được thu thập từ các bệnh nhân phẫu thuật hoặc sinh thiết tại Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K trong giai đoạn 2010–2012.
- Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 (mua từ ATCC) sử dụng làm đối chứng dương cho trạng thái GSTP1 bị methyl hóa.
- Mẫu máu toàn phần chống đông bằng $K_2\text{EDTA}$ của người khỏe mạnh từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương (thu thập tháng 12/2011) sử dụng làm đối chứng dương cho trạng thái GSTP1 không bị methyl hóa.
- Các chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α và JM109; plasmid tái tổ hợp pG-Me mang trình tự promoter GSTP1 bị methyl hóa.
- Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát sự methyl hóa vùng promoter của gen GSTP1 bằng kỹ thuật xử lý bisulfite, MS-PCR, cắt enzym giới hạn, giải trình tự Sanger và lai điểm trên mẫu mô đúc paraffin thu thập tại Bệnh viện K (Việt Nam).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trước trong nước và quốc tế
Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu về di truyền học, di truyền ngoại gen và dấu chuẩn sinh học trong ung thư:
- Cơ sở di truyền học và biến đổi cấu trúc gen: Thuyết "hai mục tiêu" của Knudson (1971) trên gen Rb1; vai trò của các gen ức chế khối u BRCA1, BRCA2 (Miki và cs., 1994; Wooster và cs., 1995), p53 (Vogelstein và cs., 2000); các gen tiền ung thư và gen sinh ung như v-sis, c-ras, KIT, PDGFRA (Bos, 1989; Hirota và cs., 1998; Heinrich và cs., 2003).
- Hệ thống phân loại mô bệnh học: Thang phân độ Gleason (Donald Gleason, 1974) và phân loại điểm Gleason trong tiên lượng mức độ ác tính của ung thư tuyến tiền liệt.
- Di truyền ngoại gen và methyl hóa DNA: Khái niệm biểu sinh học (Riggs và Jones, 1996; Feinberg, 2007); hoạt động của enzym DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L (Okano và cs., 1999; Bestor, 2000; Bourc'his và cs., 2001); các biến đổi sửa đổi histone (H3K4me, H3K9me, H3K27me, H4K16ac) và enzym HDAC, HAT, HMT, HDMs, LSD1 (Fraga và cs., 2005; Seligson và cs., 2005; Metzger và cs., 2005; Varier và Timmers, 2011).
- Phương pháp phân tích methyl hóa DNA: Phương pháp COBRA (Xiong và Laird, 1997); kỹ thuật MS-PCR (Herman và cs., 1996); phương pháp MethyLight (Eads và cs., 2000); kỹ thuật HeavyMethyl/HeavyLight (Cottrell và cs., 2004).
- Dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 trong ung thư tuyến tiền liệt: Nghiên cứu của Lee và cs. (1994) lần đầu ghi nhận methyl hóa GSTP1; tổng hợp 24 nghiên cứu trên 1027 bệnh nhân của Jerónimo và cs. (2004) cho thấy tỷ lệ methyl hóa đạt 85%; nghiên cứu của Bastian và cs. (2004) phát hiện 21/21 mẫu mô ung thư dương tính với methyl hóa GSTP1 trong khi 13 mẫu quá sản lành tính đều âm tính; các phân tích kết hợp nhiều gen của Yegnasubramanian và cs. (2004), Enokida và cs. (2005); các bộ kit thương mại như ConfirmMDx (MDxHealth, 2013) phân tích 3 gen GSTP1, APC, RASSF1A, Epi proLung (SHOX2), EpiproColon (SEPT9).
- Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Nghiên cứu methyl hóa gen BRCA1 ở ung thư vú và buồng trứng (Võ Thị Thương Lan và cs., 2011); methyl hóa gen thụ thể estrogen ER ở ung thư vú (Trần T. và cs., 2012); methyl hóa CDKN2A (p16) (Vi Thuật Thắng và cs., 2012); nghiên cứu kết hợp 3 gen APC, RASSF1A, GSTP1 ở ung thư buồng trứng (Võ L. và cs., 2014).
Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết
Trước thời điểm thực hiện luận án, chưa có công bố khoa học nào tại Việt Nam phân tích tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 trên bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt và quá sản lành tính tuyến tiền liệt. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng việc thiết lập quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh từ xử lý mẫu mô FFPE, xử lý bisulfite, thiết kế hệ mồi nested MS-PCR đặc hiệu, kiểm chứng sản phẩm bằng enzym giới hạn $BstUI$ và giải trình tự Sanger, đồng thời phát triển kỹ thuật lai điểm đặc hiệu methyl (MS-DBA) để nâng cao độ nhạy phát hiện.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết
Gen GSTP1 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể 11 (11q13), có kích thước 2,8 kb gồm 7 exon mã hóa chuỗi polypeptide 209 axit amin. Vùng promoter của GSTP1 chứa đảo CpG cùng các trình tự điều hòa phiên mã như hộp TATA, 2 vị trí nhận biết của SP1 (GGGCGG) và 1 vị trí nhận biết của AP-1 (TGACTCA). Khi các gốc cytosine tại đảo CpG bị gắn nhóm methyl (tạo thành 5-methylcytosine dưới xúc tác của các DNMTs), cấu trúc chất nhiễm sắc bị đóng xoắn, ngăn cản các yếu tố phiên mã tiếp cận, dẫn tới bất hoạt gen và làm mất khả năng khử các chất độc hại ngoại sinh và nội sinh.
| Thông số gen |
Đặc điểm chi tiết |
| Tên gen |
GSTP1 (Glutathione S-transferase Pi 1) |
| Vị trí nhiễm sắc thể |
11q13 |
| Kích thước & Cấu trúc |
2,8 kb; 7 exon; khung đọc mở mã hóa 209/211 bộ ba |
| Vùng điều hòa phiên mã |
Hộp TATA, 2 vị trí SP1 (GGGCGG), 1 vị trí AP-1 (TGACTCA) |
| Chức năng sinh học |
Mã hóa enzym GST khử độc pha II, liên kết xenobiotic, điều hòa JNK |
Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị mẫu và tách chiết DNA:
- Mẫu FFPE: Cắt lát 5–10 $\mu\text{m}$ bằng máy cắt Microm HM 325, loại bỏ sáp bằng xylene và ethanol, tách chiết DNA bằng kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) hoặc E.Z.N.A DNA Tissue (Omega).
- Tế bào PC3 và mẫu máu: Tách chiết bằng Reliaprep Blood gDNA Miniprep (Promega).
- Đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 260 nm và 280 nm ($A_{260}/A_{280}$) để đánh giá độ sạch và hàm lượng DNA.
- Xử lý bisulfite:
- Sử dụng bộ kit MethylEdge Bisulfite Conversion System (Promega). Nguyên lý: Sodium bisulfite chuyển đổi cytosine không bị methyl hóa thành uracil (sau PCR biến đổi thành thymine), trong khi 5-methylcytosine giữ nguyên là cytosine.
- Kiểm tra hiệu quả xử lý bisulfite bằng phản ứng PCR khuếch đại gen $\beta$-globin với cặp mồi đặc hiệu cho DNA chưa xử lý (268 bp) và sau xử lý (250 bp ở vòng 1, 224 bp ở vòng 2).
- Kỹ thuật MS-PCR (Methylation-Specific PCR):
- Thiết kế mồi lồng (Nested MS-PCR) gồm 2 vòng phản ứng cho cả 2 trạng thái methyl hóa và không methyl hóa.
- Sản phẩm vòng 2: Trình tự methyl hóa có kích thước 155 bp (mồi GS Me-F2 và GS Me-R); trình tự không methyl hóa có kích thước 149 bp (mồi GS Un-F2 và GS Un-R).
- Kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm MS-PCR:
- Cắt bằng enzym giới hạn $BstUI$ (nhận biết trình tự $\text{5'-CGCG-3'}$). Đoạn 155 bp của GSTP1 bị methyl hóa chứa 2 vị trí cắt của $BstUI$, sau khi cắt tạo ra các đoạn 87 bp, 44 bp và 24 bp.
- Tách dòng sản phẩm PCR vào các vector pGEM-T Easy, InsTAclone hoặc GeneJET và tiến hành giải trình tự Sanger để so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank.
- Kỹ thuật lai điểm đặc hiệu methyl (MS-DBA - Methyl Specific Dot Blot Assay):
- Thiết kế đầu dò đặc hiệu ASO (đoạn 46 bp) dựa trên trình tự promoter GSTP1 bị methyl hóa.
- Đánh dấu đầu dò bằng Biotin-11-dUTP thông qua phản ứng PCR.
- Cố định sản phẩm MS-PCR lên màng nylon tích điện dương (Roche), lai ở nhiệt độ tối ưu ($58^\circ\text{C}$), ủ với phức hợp Streptavidin-Alkaline Phosphatase (SA-AP) và phát hiện tín hiệu màu bằng cơ chất Western Blue.
- Xử lý thống kê: Sử dụng các thuật toán thống kê sinh học để kiểm định mối tương quan giữa tình trạng methyl hóa và các chỉ số lâm sàng (tuổi, loại bệnh, độ Gleason), phân tích đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic) để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị diện tích dưới đường cong (AUC).
| Tên cặp mồi |
Trình tự nucleotide ($\text{5'-3'}$) |
Kích thước đoạn (bp) |
Mục đích sử dụng |
| Globin F / R |
caacttcatccacgttcacc / gaagagccaaggacaggtac |
268 |
Kiểm tra chất lượng DNA gốc |
| Globin Un-F / R |
agaagagttaaggataggtatggttgt / cttaccccacaaaacaataacaacaaa |
250 |
Kiểm tra hiệu quả bisulfite (Vòng 1) |
| Globin Un-F / R1 |
agaagagttaaggataggtatggttgt / acttctcctcaaaaatcaaatacacca |
224 |
Kiểm tra hiệu quả bisulfite (Vòng 2) |
| GSTP-F / R |
tgggaaagagggaaaggcttc / gtactcactggtggcgaagac |
258 |
Khuếch đại promoter GSTP1 gốc |
| GS Me-F1 / R |
tcggttagttgcgcggcgatttc / cgacgaaactccaacgaaaac |
210 |
MS-PCR phát hiện methyl hóa (Vòng 1) |
| GS Me-F2 / R |
ttcggggtgtagcggtcgtc / cgacgaaactccaacgaaaac |
155 |
MS-PCR phát hiện methyl hóa (Vòng 2) |
| GS Un-F1 / R |
agttgtgtggtgattttgggg / ccaacaaaaacctcacaacct |
194 |
MS-PCR phát hiện không methyl hóa (Vòng 1) |
| GS Un-F2 / R |
gatgtttggggtgtagtggttgtt / ccaacaaaaacctcacaacct |
149 |
MS-PCR phát hiện không methyl hóa (Vòng 2) |
| ASO-RF / ASO-ME1 |
agaattcgaccgctcttctaa / gtcggcgggagttcgcg |
46 |
Tạo đầu dò lai điểm đặc hiệu methyl |
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương này tổng kết cơ sở lý thuyết về sinh học ung thư, cơ chế di truyền và biểu sinh:
- Cơ sở tế bào học và di truyền ung thư: Trình bày 6 đặc tính cơ bản của tế bào ung thư theo Hanahan và Weinberg (duy trì tín hiệu tăng sinh, trốn tránh ức chế khối u, chống lại apoptosis, nhân lên bất tử, cảm ứng tạo mạch, xâm lấn và di căn). Phân tích vai trò của các gen ức chế khối u (p53, Rb1, BRCA1/2) và gen sinh ung (ras, KIT, PDGFRA).
- Di truyền ngoại gen và methyl hóa DNA: Trình bày cơ chế methyl hóa tại đảo CpG, vai trò của các enzym DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L; hiện tượng giảm methyl hóa toàn cục đi kèm tăng methyl hóa cục bộ tại promoter của các gen ức chế khối u trong tế bào ung thư. Tổng kết bảng các gen bị methyl hóa quá mức trong ung thư ở người (BRCA1, CDKN2A, GSTP1, HIC1, MLH1, RASSF1A, SEPT9, SHOX2).
- Bệnh học ung thư tuyến tiền liệt và hệ thống Gleason: Mô tả 5 mức độ mô học theo Donald Gleason (từ độ 1 đến độ 5 dựa trên cấu trúc tuyến), cách tính điểm Gleason (từ 2 đến 10) và phân loại nhóm nguy cơ. Trình bày giới hạn của chỉ số kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt PSA (ngưỡng bình thường 4 ng/ml; vùng xám 4–10 ng/ml gây ra tỷ lệ sinh thiết không cần thiết cao).
- Cấu trúc gen GSTP1 và các phương pháp phân tích: Mô tả cấu trúc 7 exon của GSTP1, cơ chế khử độc và chống oxy hóa. So sánh ưu, nhược điểm của các phương pháp phân tích methyl hóa DNA: COBRA, MS-PCR, MethyLight, HeavyMethyl và kỹ thuật lai điểm. Điểm lại các công trình nghiên cứu methyl hóa GSTP1 trên thế giới và thực trạng nghiên cứu di truyền ngoại gen tại Việt Nam.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu, hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm:
- Vật liệu và thiết bị: Đặc điểm của 96 mẫu mô paraffin thu thập tại Bệnh viện K (59 ung thư, 37 quá sản lành tính), dòng tế bào PC3, mẫu máu đối chứng, hệ thống máy cắt tiêu bản Microm HM 325, máy luân nhiệt PCR, hệ thống điện di màng gel acrylamide/agarose và hệ thống lai màng.
- Quy trình chiết tách DNA và xử lý bisulfite: Chi tiết các bước deparaffin hóa, ly giải tế bào bằng Proteinase K, thu hồi DNA; quy trình biến đổi DNA bằng MethylEdge Bisulfite Conversion System và quy trình kiểm tra chất lượng bằng cặp mồi khuếch đại gen $\beta$-globin.
- Quy trình Nested MS-PCR và kiểm tra sản phẩm: Thiết lập thành phần phản ứng ($25,\mu\text{l}$ chứa $1\times\text{PCR buffer}$, $\text{MgCl}_2$, dNTP, enzyme JumpStart Taq polymerase, mồi) và chu trình nhiệt cho vòng 1 và vòng 2. Quy trình ủ cắt sản phẩm PCR với enzym $BstUI$ ở $60^\circ\text{C}$, điện di trên gel polyacrylamide 8–10%. Quy trình tách dòng vào vector pGEM-T Easy và giải trình tự nucleotide.
- Xây dựng quy trình lai điểm (Dot blot): Thiết kế plasmid chuẩn pG-Me, nhân dòng đoạn promoter methyl hóa, đánh dấu Biotin-11-dUTP bằng PCR. Tối ưu hóa các bước khóa màng (sử dụng dung dịch blocking), nhiệt độ lai ($58^\circ\text{C}$), rửa màng ở độ ngặt cao và hiện màu bằng Streptavidin-Alkaline Phosphatase kết hợp cơ chất Western Blue.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:
- Thu thập mẫu và tách chiết DNA: Đã thu nhận và định loại mô bệnh học thành công cho 59 mẫu ung thư tuyến tiền liệt và 37 mẫu quá sản lành tính. Hàm lượng DNA tách chiết từ các mẫu FFPE đạt yêu cầu thực hiện phản ứng PCR (nồng độ đo qua phổ hấp thụ $A_{260}/A_{280}$ đạt độ tinh sạch từ 1,7 đến 1,9).
- Xử lý bisulfite và kiểm tra chất lượng: Phản ứng PCR gen $\beta$-globin cho thấy toàn bộ các mẫu sau xử lý bisulfite đều chuyển đổi hoàn toàn (không khuếch đại với cặp mồi cho DNA chưa xử lý, khuếch đại đặc hiệu phân đoạn 224 bp với mồi sau xử lý).
- Tối ưu hóa phản ứng MS-PCR: Thiết lập thành công hệ thống Nested MS-PCR. Kiểm tra sản phẩm 155 bp đặc hiệu methyl bằng phản ứng cắt enzym $BstUI$ cho ra đầy đủ 3 phân đoạn 87 bp, 44 bp, 24 bp trên gel polyacrylamide 10%. Kết quả giải trình tự Sanger xác nhận toàn bộ các gốc cytosine ngoài CpG đều biến đổi thành thymine, trong khi cytosine thuộc CpG giữ nguyên.
| Nhóm mẫu nghiên cứu |
Số lượng mẫu ($n$) |
Số mẫu có methyl hóa GSTP1 ($n$) |
Tỷ lệ methyl hóa (%) |
Giá trị kiểm định |
| Ung thư tuyến tiền liệt |
59 |
39 |
66,1% |
$p < 0,05$ |
| Quá sản lành tính (BPH) |
37 |
4 |
10,8% |
— |
- Xác định ngưỡng phát hiện của MS-PCR: Sử dụng plasmid tái tổ hợp pG-Me pha loãng bậc 10 trộn với DNA máu người bình thường (đã xử lý bisulfite) xác định phản ứng MS-PCR có thể phát hiện được 10 bản copy plasmid pG-Me trong nền 15 ng DNA tổng số, tương đương ngưỡng phát hiện đạt 0,15%.
- Phân tích mối liên quan lâm sàng: Tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 ở nhóm ung thư tuyến tiền liệt (66,1%) cao hơn rõ rệt so với nhóm quá sản lành tính (10,8%) với sự sai khác có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$). Phân tích đường cong ROC cho thấy dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 có khả năng phân biệt tốt giữa mẫu ung thư và mẫu quá sản lành tính.
- Phát triển kỹ thuật lai điểm (MS-DBA): Tối ưu hóa thành công nhiệt độ lai ở $58^\circ\text{C}$ và hệ thống dung dịch khóa màng. Kỹ thuật lai điểm phân biệt tuyệt đối giữa trình tự methyl hóa 155 bp và không methyl hóa 149 bp. Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật lai điểm kết hợp MS-PCR đạt 0,01% (nhạy hơn 15 lần so với phương pháp điện di sản phẩm MS-PCR thông thường). Khi kiểm tra lại trên 39 mẫu ung thư và 4 mẫu quá sản lành tính dương tính từ MS-PCR, kỹ thuật lai điểm khẳng định tính chính xác của toàn bộ các mẫu này.
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới của luận án
Luận án tự công bố 3 đóng góp khoa học mới cơ bản:
- Lần đầu tiên tại Việt Nam, tác giả đã xây dựng và tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật Nested MS-PCR chuyên biệt để phát hiện hiện tượng methyl hóa promoter gen GSTP1 trên mẫu mô đúc paraffin của bệnh nhân ung thư và quá sản lành tính tuyến tiền liệt.
- Xác định được tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt chiếm 66,1% (39/59 mẫu) và ở bệnh nhân quá sản lành tính chiếm 10,8% (4/37 mẫu). Chứng minh sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 với ung thư tuyến tiền liệt ($p < 0,05$). Ngưỡng phát hiện methyl hóa của kỹ thuật MS-PCR được xác định là 0,15%.
- Xây dựng và phối hợp thành công kỹ thuật lai điểm (Dot blot) với kỹ thuật MS-PCR sử dụng đầu dò gắn Biotin, nâng cao ngưỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 xuống mức 0,01%, đồng thời đảm bảo độ đặc hiệu phân biệt giữa trình tự methyl hóa và không methyl hóa.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất
- Đề xuất ứng dụng quy trình kỹ thuật Nested MS-PCR kết hợp lai điểm đặc hiệu methyl như một xét nghiệm sinh học phân tử hỗ trợ giải phẫu bệnh trong việc chẩn đoán phân biệt giữa tổn thương ác tính và quá sản lành tính tuyến tiền liệt.
- Kiến nghị mở rộng khảo sát tình trạng methyl hóa GSTP1 trên các nguồn bệnh phẩm không xâm lấn hoặc ít xâm lấn như mẫu máu (huyết tương/huyết thanh), dịch chọc hút và nước tiểu để hướng tới việc sàng lọc sớm ung thư tuyến tiền liệt trong cộng đồng.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Mẫu nghiên cứu được thu thập từ một trung tâm duy nhất (Bệnh viện K) trong khoảng thời gian từ 2010 đến 2012 với cỡ mẫu 96 trường hợp (59 mẫu ung thư và 37 mẫu quá sản lành tính).
- Mẫu bệnh phẩm là mô đúc khối paraffin (FFPE) lưu trữ, DNA sau tách chiết có mức độ phân mảnh nhất định do quá trình cố định formalin, đòi hỏi quy trình xử lý bisulfite và khuếch đại mồi lồng nghiêm ngặt.
- Kỹ thuật MS-PCR định tính và bán định lượng không cung cấp chi tiết tỷ lệ methyl hóa của từng vị trí nucleotide CpG riêng lẻ như phương pháp giải trình tự thế hệ mới hoặc kỹ thuật định lượng huỳnh quang thời gian thực (qMS-PCR/MethyLight).
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Mở rộng cỡ mẫu nghiên cứu trên nhiều trung tâm y tế tại các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam nhằm đánh giá toàn diện tần suất methyl hóa GSTP1.
- Thiết lập bảng dấu chuẩn phối hợp nhiều gen (panel đa gen như GSTP1, APC, RASSF1A) nhằm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán.
- Ứng dụng quy trình phát hiện methyl hóa trên các mẫu sinh thiết lỏng (nước tiểu, huyết tương) để phục vụ theo dõi tái phát sau điều trị.
Giá trị tham khảo
Luận án mang lại giá trị khoa học và thực tiễn cho nhiều nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Hóa sinh: Tài liệu tham khảo về phương pháp xử lý mẫu FFPE, quy trình chuyển đổi bisulfite, thiết kế mồi nested MS-PCR phân biệt trạng thái methyl hóa, cũng như quy trình chế tạo đầu dò đánh dấu Biotin và kỹ thuật lai điểm.
- Giảng viên và nhà nghiên cứu y sinh: Cung cấp nguồn tổng quan tài liệu có hệ thống về cơ chế di truyền ngoại gen, sinh học khối u tuyến tiền liệt, phân loại Gleason và các phương pháp phân tích biến đổi DNA.
- Bác sĩ giải phẫu bệnh và chuyên gia ung bướu: Cung cấp số liệu dịch tễ phân tử về tỷ lệ methyl hóa GSTP1 trên bệnh nhân Việt Nam, hỗ trợ thêm tiêu chí phân tử bên cạnh các phương pháp chẩn đoán mô bệnh học và xét nghiệm PSA truyền thống.
Câu hỏi thường gặp
1. Tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân ung thư và quá sản lành tính tuyến tiền liệt trong nghiên cứu này là bao nhiêu?
Theo kết quả thực nghiệm của luận án trên 96 mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện K, tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở nhóm bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt là 66,1% (39/59 mẫu) và ở nhóm quá sản lành tính tuyến tiền liệt là 10,8% (4/37 mẫu). Sự khác biệt giữa hai nhóm có ý nghĩa thống kê với $p < 0,05$.
2. Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật MS-PCR và kỹ thuật lai điểm trong luận án đạt mức nào?
Phản ứng Nested MS-PCR đạt ngưỡng phát hiện là 0,15% (phát hiện được 10 bản copy plasmid pG-Me trong 15 ng DNA mẫu máu sau xử lý bisulfite). Khi kết hợp MS-PCR với kỹ thuật lai điểm (Dot blot) sử dụng đầu dò đặc hiệu đánh dấu Biotin, ngưỡng phát hiện được nâng cao lên mức 0,01% (nhạy hơn 15 lần).
3. Tác giả sử dụng các đối chứng chuẩn nào cho trạng thái methyl hóa và không methyl hóa của gen GSTP1?
- Đối chứng dương cho trạng thái methyl hóa: DNA tổng số tách từ dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 và plasmid tái tổ hợp pG-Me mang đoạn chèn promoter GSTP1 bị methyl hóa.
- Đối chứng dương cho trạng thái không methyl hóa: DNA tổng số tách từ mẫu máu toàn phần của người khỏe mạnh.
4. Bằng cách nào tác giả kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm MS-PCR 155 bp?
Tác giả sử dụng hai phương pháp độc lập để kiểm chứng:
- Cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn $BstUI$ (nhận biết trình tự $\text{5'-CGCG-3'}$); sản phẩm 155 bp bị cắt thành 3 đoạn có kích thước 87 bp, 44 bp và 24 bp trên gel polyacrylamide 10%.
- Tách dòng sản phẩm PCR vào vector và giải trình tự Sanger để khẳng định sự chuyển đổi toàn bộ cytosine ngoài CpG thành thymine và bảo tồn cytosine trong CpG.
5. Dấu chuẩn protein PSA và phân độ Gleason có những đặc điểm gì được luận án nêu ra?
PSA là kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt với ngưỡng bình thường trong máu là 4 ng/ml; nồng độ 4–10 ng/ml nằm trong "vùng xám" có thể dẫn tới sinh thiết không cần thiết, trong khi 25% bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt vẫn có nồng độ PSA bình thường. Phân độ Gleason (Donald Gleason, 1974) đánh giá độ biệt hóa tế bào theo 5 mức độ và tính điểm từ 2 đến 10 để tiên lượng nguy cơ tiến triển của bệnh.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Vương Diệu Linh đã thiết lập và tối ưu hóa thành công hệ thống kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm Nested MS-PCR và lai điểm đặc hiệu methyl (MS-DBA) để khảo sát hiện tượng methyl hóa promoter gen GSTP1 trên mẫu mô bệnh phẩm đúc paraffin. Nghiên cứu đã chứng minh tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 ở nhóm ung thư tuyến tiền liệt (66,1%) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm quá sản lành tính (10,8%), với ngưỡng phát hiện kỹ thuật đạt 0,15% đối với MS-PCR và 0,01% khi kết hợp lai điểm. Công trình cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về di truyền ngoại gen trong ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam, tạo cơ sở khoa học cho việc phát triển các bộ công cụ dấu chuẩn phân tử hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng bệnh.
