Luận án tiến sĩ nghiên cứu hiện tượng methyl hóa vùng promoter gen gstp1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hiện tượng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt, cung cấp thông tin chuyên sâu về cơ chế phân tử.

• Tác giả: Vương Diệu Linh
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1.3. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1.4. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• 1.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 2. MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Giới thiệu về methyl hóa và vai trò trong ung thư tuyến tiền liệt

Methyl hóa là một quá trình biến đổi di truyền ngoại gen, trong đó nhóm methyl được thêm vào DNA, thường tại vùng promoter gen, dẫn đến sự bất hoạt gen. Trong ung thư tuyến tiền liệt, hiện tượng methyl hóa bất thường ở các gen ức chế khối u như GSTP1 (Glutathione S-transferase Pi 1) là phổ biến. GSTP1 đóng vai trò quan trọng trong việc giải độc các chất gây ung thư, và sự bất hoạt của gen này thông qua methyl hóa có liên quan mật thiết đến sự hình thành và tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong cả quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt, nhằm tìm hiểu cơ chế di truyền ngoại gen và phát triển các dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán và điều trị.

1.1. Cơ chế methyl hóa và ảnh hưởng đến biểu hiện gen

Methyl hóa DNA thường xảy ra tại các vị trí CpG trong vùng promoter gen, dẫn đến sự bất hoạt gen. Trong ung thư tuyến tiền liệt, sự methyl hóa quá mức của GSTP1 làm giảm biểu hiện gen, từ đó giảm khả năng giải độc của tế bào. Điều này góp phần vào sự tích tụ các chất độc và thúc đẩy quá trình ung thư hóa. Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp như MS-PCR (Methylation-Specific PCR) để xác định mức độ methyl hóa của GSTP1 trong các mẫu bệnh phẩm.

1.2. Tầm quan trọng của GSTP1 trong ung thư tuyến tiền liệt

GSTP1 là một gen quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi các chất độc hại. Sự bất hoạt của GSTP1 thông qua methyl hóa được coi là một dấu hiệu sớm của ung thư tuyến tiền liệt. Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò của GSTP1 như một dấu chuẩn sinh học tiềm năng trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Các kết quả từ nghiên cứu này có thể hỗ trợ phát triển các bộ kit chẩn đoán dựa trên methyl hóa GSTP1.

II. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật phân tích

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp tiên tiến để phân tích methyl hóa vùng promoter gen GSTP1. Các mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt được thu thập và xử lý bằng kỹ thuật bisulfite, chuyển đổi cytosine không methyl hóa thành uracil, trong khi cytosine methyl hóa vẫn được giữ nguyên. Phương pháp MS-PCR được sử dụng để khuếch đại các trình tự DNA methyl hóa và không methyl hóa, từ đó xác định mức độ methyl hóa của GSTP1. Ngoài ra, kỹ thuật lai điểm (dot blot) được phát triển để tăng độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện methyl hóa.

2.1. Xử lý bisulfite và tối ưu hóa quy trình

Quá trình xử lý bisulfite là bước quan trọng trong việc phân tích methyl hóa. DNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm được xử lý với bisulfite, chuyển đổi cytosine không methyl hóa thành uracil, trong khi cytosine methyl hóa vẫn được giữ nguyên. Quy trình này được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác cao trong việc phân tích methyl hóa.

2.2. Phương pháp MS PCR và ứng dụng

MS-PCR là phương pháp chính được sử dụng để phát hiện methyl hóa của GSTP1. Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại các trình tự DNA methyl hóa và không methyl hóa. Phương pháp này cho phép xác định chính xác mức độ methyl hóa trong các mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng ung thư tuyến tiền liệt.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa của GSTP1 xảy ra phổ biến trong các mẫu ung thư tuyến tiền liệt, trong khi tỷ lệ này thấp hơn đáng kể trong các mẫu quá sản lành tính. Điều này khẳng định vai trò của methyl hóa GSTP1 như một dấu chuẩn sinh học tiềm năng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra mối liên quan giữa mức độ methyl hóa và các đặc điểm lâm sàng của bệnh, như phân độ Gleason và tuổi bệnh nhân. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị đích cho ung thư tuyến tiền liệt.

3.1. Mối liên quan giữa methyl hóa GSTP1 và đặc điểm lâm sàng

Nghiên cứu cho thấy mức độ methyl hóa của GSTP1 có liên quan chặt chẽ với các đặc điểm lâm sàng của ung thư tuyến tiền liệt, bao gồm phân độ Gleason và tuổi bệnh nhân. Điều này cho thấy methyl hóa GSTP1 không chỉ là một dấu hiệu chẩn đoán mà còn có thể được sử dụng để tiên lượng bệnh.

3.2. Triển vọng ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Các kết quả từ nghiên cứu này mở ra triển vọng ứng dụng methyl hóa GSTP1 trong chẩn đoán sớm và điều trị đích cho ung thư tuyến tiền liệt. Việc phát triển các bộ kit chẩn đoán dựa trên methyl hóa GSTP1 có thể giúp cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh, đặc biệt là trong giai đoạn sớm.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu di truyền ngoại gen (epigenetics) và dấu chuẩn sinh học phân tử đang định hình lại toàn diện bối cảnh chẩn đoán ung thư học hiện đại. Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Di truyền học (Mã số: 62420121) của nghiên cứu sinh Vương Diệu Linh, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Võ Thị Thương Lan tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội (thuộc khuôn khổ đề tài cấp nhà nước KC.05/11-15), là công trình tiên phong tại Việt Nam khảo sát có hệ thống hiện tượng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 (Glutathione S-transferase Pi 1) nhằm phân biệt ung thư tuyến tiền liệt (Prostate Cancer - PCa) và quá sản lành tính tuyến tiền liệt (Benign Prostatic Hyperplasia - BPH).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực trạng chẩn đoán lâm sàng hiện hành: chỉ số kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt PSA (Prostate-Specific Antigen) có độ đặc hiệu kém trong "vùng xám" (4–10 ng/ml) dẫn đến hơn 700.000 ca sinh thiết không cần thiết mỗi năm tại Mỹ (Pfeiffer et al., 2006), trong khi 25% bệnh nhân ung thư vẫn có nồng độ PSA bình thường (Bunting, 2002). Tại Việt Nam, ung thư tuyến tiền liệt có tỷ lệ tử vong cao do phần lớn ca bệnh được phát hiện ở giai đoạn muộn. Mặc dù các nghiên cứu quốc tế đã xác lập methyl hóa GSTP1 xảy ra ở hơn 85–90% khối u tuyến tiền liệt (Yegnasubramanian et al., 2004; Bastian et al., 2005), tỷ lệ và đặc tính methyl hóa biến thiên đáng kể theo chủng tộc và vùng địa lý, đòi hỏi phải xác lập dữ liệu thực nghiệm đặc hiệu trên quần thể bệnh nhân Việt Nam.

Hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết được xác lập chặt chẽ:

• RQ1: Tỷ lệ và mức độ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt và quá sản lành tính tại Việt Nam là bao nhiêu?
• RQ2: Phản ứng Nested MS-PCR kết hợp lai điểm (Dot blot) có thể nâng cao độ nhạy phát hiện alen bị methyl hóa ở mức nồng độ vi lượng đến ngưỡng nào?
• RQ3: Hiện tượng methyl hóa promoter GSTP1 có mối tương quan thống kê như thế nào với các thông số bệnh học như độ tuổi và phân độ mô học Gleason?
• H1: Tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở mô ung thư tuyến tiền liệt cao hơn có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) so với mô quá sản lành tính.
• H2: Sự kết hợp giữa kỹ thuật Nested MS-PCR và lai điểm phân tử nhận diện đặc hiệu trình tự methyl hóa sẽ hạ thấp giới hạn phát hiện (LOD) xuống dưới 0,05% alen đích.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp lý thuyết bất hoạt gen do di truyền ngoại gen (Bird, 2002; Jones & Baylin, 2002) và mô hình sinh ung thư tuyến tiền liệt qua sự suy giảm enzyme giải độc pha II. Luận án thực hiện trên cỡ mẫu 96 bệnh nhân (59 mẫu ung thư và 37 mẫu quá sản lành tính) thu thập trong giai đoạn 2010–2012 tại Bệnh viện K, chứng minh tỷ lệ methyl hóa GSTP1 đạt 66,1% ở nhóm ung thư so với 10,8% ở nhóm lành tính ($p < 0,05$), đồng thời tối ưu hóa thành công quy trình lai điểm đạt ngưỡng phát hiện siêu nhạy 0,01%.

---

Literature Review và Positioning

Các nghiên cứu kinh điển về sinh học ung thư xác định quá trình chuyển dạng ác tính chịu sự chi phối song hành của đột biến di truyền (genetic mutations) và biến đổi di truyền ngoại gen (epigenetic alterations) (Hanahan & Weinberg, 2000). Trong khi đột biến gen ức chế khối u Rb1 (Knudson, 1971) hay TP53 (Vogelstein et al., 2000) làm mất kiểm soát chu kỳ tế bào, hiện tượng tăng methyl hóa bất thường (hypermethylation) tại các đảo CpG vùng promoter được chứng minh là cơ chế epigenetic then chốt gây bất hoạt phiên mã các gen đè nén khối u mà không làm thay đổi trình tự nucleotide sơ cấp (Baylin & Herman, 2000).

Tổng quan y văn quốc tế ghi nhận nhiều luồng quan điểm và tranh luận học thuật sâu sắc:

1. Tranh luận về tính đặc hiệu mô và chủng tộc của dấu chuẩn GSTP1: Các nghiên cứu tại Bắc Mỹ và Châu Âu (Lee et al., 1994; Cairns et al., 2001) báo cáo tần suất methyl hóa GSTP1 vượt trên 90% ở ung thư tuyến tiền liệt nguyên phát và khẳng định đây là biến đổi phân tử sớm nhất. Tuy nhiên, các phân tích đa trung tâm của Woodson et al. (2003) và Kwabi-Addo et al. (2010) lại chỉ ra tỷ lệ này dao động mạnh từ 50% đến 88% giữa các nhóm chủng tộc da trắng, da đen và châu Á, đặt ra nghi vấn về khả năng áp dụng một ngưỡng chẩn đoán đồng nhất trên toàn cầu.
2. Tranh luận về cơ chế methyl hóa nền trong mô quá sản lành tính (BPH): Một trường phái (Bastian et al., 2005) khẳng định methyl hóa GSTP1 hoàn toàn không hiện diện trong mô BPH thuần túy (0%), quy kết mọi kết quả dương tính trong BPH là do nhiễm mô ác tính vi thể hoặc sai số kỹ thuật. Ngược lại, trường phái thứ hai (Yegnasubramanian et al., 2004; Enokida et al., 2005) phát hiện mức độ methyl hóa thấp (2–10%) trong một số mẫu BPH, biện giải rằng đây là dấu hiệu của tổn thương tiền ung thư tiềm ẩn (Prostatic Intraepithelial Neoplasia - PIN) hoặc hiện tượng "hiệu ứng trường" (field effect) của biểu mô tuyến tiền liệt lão hóa.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu:

• Yegnasubramanian et al. (2004) tại Đại học Johns Hopkins (Mỹ): Khảo sát 73 mẫu ung thư nguyên phát, 91 mẫu di căn và 25 mẫu BPH bằng Real-time MS-PCR (MethyLight), phát hiện tần suất methyl hóa GSTP1 là 89% ở ung thư, 0% ở BPH, và chứng minh chỉ số methyl hóa tăng lũy tiến theo giai đoạn tiến triển khối u.
• Bastian et al. (2005): Đánh giá 21 mẫu mô ung thư và 13 mẫu BPH, ghi nhận 100% mẫu ung thư mang methyl hóa GSTP1 và 0% ở BPH, thiết lập cơ sở để phát triển các xét nghiệm thương mại như ConfirmMDx (MDxHealth) sử dụng panel đa gen GSTP1, APC, RASSF1A (Van Neste et al., 2016).

Luận án của Vương Diệu Linh định vị chính xác khoảng trống tri thức: thiết lập quy trình Nested MS-PCR kết hợp lai điểm đặc hiệu methyl (MS-DBA) trên bệnh phẩm mô đúc khối nến (FFPE) tại Việt Nam. Công trình chứng minh rằng tỷ lệ methyl hóa GSTP1 ở bệnh nhân Việt Nam đạt 66,1% ở mô ung thư và 10,8% ở mô BPH, phản ánh đặc thù sinh học quần thể và giải quyết rào cản kỹ thuật của việc phân tích DNA bị phân mảnh nghiêm trọng trong mẫu lưu trữ paraffin.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm lý thuyết bất hoạt gen do di truyền ngoại gen (Epigenetic Gene Silencing Theory) của Jones & Baylin (2002) và lý thuyết giải độc qua stress oxy hóa trong cơ chế sinh ung thư tuyến tiền liệt:

• Mở rộng lý thuyết ức chế phiên mã qua biến đổi chromatin: Bằng chứng thực nghiệm từ luận án xác nhận rằng sự methyl hóa các gốc cytosine tại đảo CpG promoter gen GSTP1 (nhiễm sắc thể 11q13) là biến đổi phân tử then chốt dẫn đến mất biểu hiện enzyme Glutathione S-transferase P1-1. Sự thiếu hụt enzyme này làm triệt tiêu khả năng bảo vệ tế bào trước các gốc tự do electrophilic và chất sinh ung (như heterocyclic amines), đồng thời giải phóng sự ức chế đối với kinase c-Jun N-terminal (JNK), thúc đẩy tế bào tiến vào chu trình tăng sinh ác tính vô tổ chức (Adler et al., 1999).
• Chứng minh sự hiện diện của biến đổi ngoại gen giai đoạn sớm: Tỷ lệ 10,8% methyl hóa GSTP1 phát hiện trong mô quá sản lành tính BPH cung cấp minh chứng cho lý thuyết "tổn thương di truyền ngoại gen vùng" (epigenetic field defect), cho thấy sự tích lũy methyl hóa promoter diễn ra từ giai đoạn trước khi xuất hiện các biến đổi giải phẫu bệnh ác tính rõ ràng trên kính hiển vi quang học.

[Mô biểu mô bình thường] 
[Chuyển dạng ác tính biểu mô tuyến tiền liệt (PCa)] (Tần suất methyl hóa đạt 66,1%, p < 0,05)

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của nghiên cứu xây dựng dựa trên sự giao thoa của ba trục lý thuyết: Lý thuyết Di truyền ung thư học (Cancer Genetics), Lý thuyết Di truyền ngoại gen (Epigenetics), và Lý thuyết Đo lường Dấu chuẩn Sinh học Phân tử (Biomarker Analytical Validity Framework).

Các thành phần cấu thành khung phân tích:

1. Trục chuyển đổi Bisulfite (Bisulfite Conversion Chemistry): Nguyên lý hóa học chuyển đổi chọn lọc các cytosine không methyl hóa thành uracil (sau đó thành thymine qua PCR) bằng sodium bisulfite, trong khi 5-methylcytosine ($5\text{mC}$) giữ nguyên bản chất hóa học, tạo tiền đề tạo ra sự khác biệt trình tự sơ cấp phục vụ khuếch đại phân tử.
2. Hệ thống mồi lồng kép đa cấp (Nested Primer Design Framework): Sử dụng hai vòng khuếch đại liên tiếp nhằm tối ưu hóa hiệu suất bắt cặp trên khuôn mẫu DNA FFPE bị phân đoạn, với các cặp mồi được thiết kế phủ qua tối thiểu 4–5 vị trí CpG để loại bỏ hiện tượng khuếch đại không đặc hiệu.
3. Trục lai phân tử tăng cường tín hiệu (Signal Amplification via Dot Blot Hybridization): Sử dụng mẫu dò oligomer gắn Biotin-11-dUTP liên kết phức hợp Streptavidin-Alkaline Phosphatase (SA-AP) để nhận diện chọn lọc amplicon mang methyl hóa, loại bỏ hoàn toàn tín hiệu dương tính giả từ sản phẩm bắt cặp lệch của PCR.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án áp dụng triết lý nghiên cứu thực chứng (positivism) thông qua thiết kế bệnh - chứng (case-control study) kết hợp thực nghiệm phân tử trong phòng thí nghiệm. Thiết kế đa tầng (multi-level design) được triển khai:

• Tầng mẫu chuẩn tế bào (In vitro benchmark): Sử dụng dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt người PC3 (ATCC) làm đối chứng dương chuẩn cho alen GSTP1 bị methyl hóa hoàn toàn; mẫu máu ngoại vi người khỏe mạnh (chống đông bằng $K_2\text{EDTA}$, cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương) làm đối chứng âm (GSTP1 không methyl hóa).
• Tầng plasmid tái tổ hợp chuẩn hóa (Molecular construct): Dòng hóa đoạn trình tự promoter GSTP1 methyl hóa vào plasmid tái tổ hợp $\text{pG-Me}$ (chuyển gen vào vi khuẩn E. coli $\text{DH5}\alpha$ và $\text{JM109}$) để định lượng nồng độ bản sao chính xác tuyệt đối.
• Tầng bệnh phẩm lâm sàng (Clinical cohort): 96 mẫu mô đúc khối nến (FFPE) từ Bệnh viện K (2010–2012), bao gồm 59 mẫu ung thư biểu mô tuyến tiền liệt và 37 mẫu quá sản lành tính.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt:

1. Chuẩn bị mô và tách chiết DNA: Mẫu mô đúc paraffin được cắt lát 5–10 $\mu\text{m}$ bằng máy Microm HM 325 (Thermo Scientific). Vùng tổn thương ác tính được giải phẫu bệnh xác định có mật độ tế bào ung thư $> 70%$ trước khi đục lỗ thu thập mô. DNA tổng số được tách bằng bộ kit QIAamp DNA FFPE Tissue (Qiagen, Cat No. 56404) và E.Z.N.A. DNA Tissue Kit (Omega, Cat No. D3396-01). Độ tinh sạch được xác định qua tỷ số hấp thụ quang phổ $A_{260}/A_{280}$ đạt dao động 1,7–1,9.
2. Quy trình chuyển đổi Bisulfite và Kiểm soát chất lượng: Xử lý 1 $\mu\text{g}$ DNA bằng MethylEdge Bisulfite Conversion System (Promega, Cat No. N1301). Hiệu quả chuyển đổi bisulfite được kiểm soát nghiêm ngặt bằng phản ứng PCR khuếch đại gen nội suy $\beta$-globin không methyl hóa (kích thước sản phẩm 250 bp ở vòng 1 và 224 bp ở vòng 2); DNA chỉ được đưa vào phân tích GSTP1 khi phản ứng kiểm chuẩn $\beta$-globin cho thấy toàn bộ cytosine không methyl hóa đã chuyển đổi hoàn toàn thành uracil.
3. Phản ứng Nested MS-PCR: Thiết kế hệ thống mồi chuyên biệt 2 vòng:
   • Khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa: Vòng 1 sử dụng cặp mồi GS Me-F1 ($5'\text{-tcggttagttgcgcggcgatttc-}3'$) và GS Me-R ($5'\text{-cgacgaaactccaacgaaaac-}3'$) tạo sản phẩm 210 bp; Vòng 2 sử dụng cặp mồi lồng GS Me-F2 ($5'\text{-ttcggggtgtagcggtcgtc-}3'$) và GS Me-R tạo sản phẩm đặc hiệu 155 bp.
   • Khuếch đại GSTP1 không methyl hóa: Vòng 1 dùng GS Un-F1 ($5'\text{-agttgtgtggtgattttgggg-}3'$) và GS Un-R ($5'\text{-ccaacaaaaacctcacaacct-}3'$) tạo sản phẩm 194 bp; Vòng 2 dùng GS Un-F2 ($5'\text{-gatgtttggggtgtagtggttgtt-}3'$) và GS Un-R tạo sản phẩm 149 bp.
4. Kiểm tra tính đặc hiệu và giải trình tự: Sản phẩm MS-PCR 155 bp mang methyl hóa được ủ với enzyme cắt hạn chế BstUI (nhận biết vị trí $5'\text{-CGCG-}3'$ được bảo tồn sau bisulfite) ở 60°C. Các sản phẩm cắt được phân tách trên gel polyacrylamide 10% để khẳng định tính đặc hiệu tuyệt đối trước khi giải trình tự Sanger trực tiếp.
5. Kỹ thuật lai điểm (Dot blot): Mẫu dò oligonucleotide đặc hiệu ASO-ME1 ($5'\text{-gtcggcgggagttcgcg-}3'$) và ASO-RF ($5'\text{-agaattcgaccgctcttctaa-}3'$) được gắn nhãn Biotin-11-dUTP bằng JumpStart Taq Polymerase (Sigma). DNA biến tính được cố định trên màng Nylon tích điện dương (Roche, Cat No. 11209272001), lai ở nhiệt độ tối ưu 55°C, phát hiện màu bằng Streptavidin-Alkaline Phosphatase (SA-AP, Sigma) kết hợp cơ chất Western Blue (Promega).

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Nghiên cứu mang lại 4 phát hiện thực nghiệm có giá trị học thuật và ứng dụng cao:

1. Xác lập tần suất methyl hóa đặc trưng của GSTP1 trên bệnh nhân Việt Nam: Tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 đạt 66,1% (39/59 mẫu) ở nhóm ung thư tuyến tiền liệt và 10,8% (4/37 mẫu) ở nhóm quá sản lành tính. Phân tích thống kê kiểm định Chi-square (${\chi}^2$) chứng minh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê rõ rệt ($p < 0,05$), khẳng định methyl hóa GSTP1 là một chỉ thị đặc hiệu cao cho chuyển dạng ác tính.
2. Đột phá về giới hạn phát hiện phân tử (Analytical Sensitivity): Kỹ thuật Nested MS-PCR đơn thuần đạt ngưỡng phát hiện 0,15% (nhận diện được 10 bản sao plasmid pG-Me trên nền 15 ng DNA hệ gen không methyl hóa). Khi tích hợp thêm kỹ thuật lai điểm (MS-DBA), ngưỡng phát hiện được hạ thấp xuống mức 0,01%, tăng độ nhạy phân tích lên 15 lần, cho phép phát hiện các phân tử DNA khối u mang methyl hóa ở nồng độ cực loãng.
3. Phát hiện hiện tượng methyl hóa trong mẫu BPH và giải trình tự khẳng định: 4 mẫu mô được chẩn đoán mô bệnh học là quá sản lành tính (ký hiệu B1, B2, B3, B4) cho kết quả dương tính với methyl hóa GSTP1. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 155 bp từ các mẫu này khẳng định toàn bộ các gốc CpG tại vùng khảo sát đều giữ nguyên cytosine (được bảo vệ khỏi biến đổi bisulfite do methyl hóa), chứng minh sự tồn tại của biến đổi di truyền ngoại gen trước khi có biến đổi cấu trúc mô học vĩ mô.
4. Phân tích diện tích dưới đường cong ROC (AUC): Phân tích đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic) thiết lập giá trị phân biệt tuyệt vời của dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 giữa mô ung thư và mô lành tính ($p < 0,05$), trong khi không có mối tương quan phụ thuộc vào độ tuổi bệnh nhân, cho thấy đây là biến đổi ác tính thực thụ chứ không đơn thuần là hậu quả của quá trình lão hóa sinh học tự nhiên.

Nhóm bệnh phẩm lâm sàng	Tổng số mẫu ($n$)	Số mẫu GSTP1 Methyl hóa ($+$)	Tỷ lệ Methyl hóa (%)	Giá trị kiểm định thống kê
Ung thư tuyến tiền liệt (PCa)	59	39	66,1%	\multirow{2}{*}{${\chi}^2 = 28,42;; p < 0,05$}
Quá sản lành tính (BPH)	37	4	10,8%
Tổng cộng	96	43	44,8%	—

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết sinh học ung thư: Kết quả cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp củng cố mô hình cơ chế bệnh sinh ung thư tuyến tiền liệt: sự bất hoạt gen khử độc GSTP1 thông qua cơ chế epigenetic là biến đổi phân tử khởi phát, xảy ra trước các biến đổi đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể lớn.
• Về mặt phương pháp luận: Luận án thiết lập một quy trình khép kín từ xử lý mẫu FFPE lưu trữ lâu năm, chuyển đổi bisulfite, nested PCR đến lai điểm phân tử. Phương pháp này có thể chuyển giao và áp dụng trực tiếp cho việc phân tích các dấu chuẩn methyl hóa của các gen khác (như RASSF1A, APC, p16INK4a, SEPT9) trên nhiều loại ung thư biểu mô khác nhau tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử có trang bị cơ bản.
• Về mặt ứng dụng lâm sàng và y tế công cộng: Việc phối hợp xét nghiệm methyl hóa GSTP1 với định lượng PSA huyết thanh cung cấp một giải pháp sàng lọc có độ tin cậy cao, giúp giảm thiểu các ca sinh thiết kim xâm lấn không cần thiết đối với các bệnh nhân nằm trong "vùng xám" PSA (4–10 ng/ml), đồng thời hỗ trợ phát hiện sớm các ổ tổn thương ác tính vi thể bị bỏ sót trong sinh thiết mô học thông thường.

---

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn kỹ thuật và phương pháp luận:

1. Hạn chế về cỡ mẫu và phạm vi địa lý: Nghiên cứu được thực hiện trên 96 bệnh nhân thu thập đơn trung tâm tại Bệnh viện K (Hà Nội). Mặc dù cỡ mẫu đủ độ mạnh thống kê cho mục tiêu kiểm định phân tử, cần mở rộng quy mô đa trung tâm trên các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam để đánh giá toàn diện tính đại diện quần thể.
2. Bản chất định tính/bán định lượng của kỹ thuật MS-PCR: Phương pháp Nested MS-PCR kết hợp lai điểm là kỹ thuật định tính có độ nhạy cao nhưng không cung cấp thông tin định lượng mật độ methyl hóa tuyệt đối trên từng vị trí CpG đơn lẻ như phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - Pyrosequencing / Targeted Bisulfite Sequencing) hay kỹ thuật Real-time PCR (MethyLight, Droplet Digital PCR).
3. Giới hạn loại mẫu bệnh phẩm: Nghiên cứu chủ yếu tập trung trên mẫu mô đúc khối nến (FFPE). Việc mở rộng đánh giá trực tiếp trên các mẫu sinh thiết lỏng (Liquid Biopsy) như DNA tự do trong huyết tương (cfDNA) hoặc tế bào biểu mô bong trong nước tiểu chưa được tiến hành đồng thời trên cùng một bệnh nhân.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối cần tập trung vào các định hướng cụ thể:

• Phát triển panel dấu chuẩn đa gen kết hợp (GSTP1, APC, RASSF1A, PTGS2) trên hệ thống xét nghiệm PCR kỹ thuật số (ddPCR) nhằm nâng cao độ nhạy chẩn đoán lên mức tuyệt đối.
• Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa GSTP1 trên mẫu nước tiểu sau thăm khám trực tràng (DRE) và huyết tương nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán không xâm lấn (non-invasive biomarker).
• Đánh giá động học tái xuất hiện methyl hóa GSTP1 trong huyết tương như một chỉ số tiên lượng tái phát sớm sau phẫu thuật cắt tuyến tiền liệt triệt căn hoặc điều trị kháng androgen.

---

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra những tác động khoa học và thực tiễn sâu rộng:

• Tác động học thuật: Đóng góp bộ dữ liệu phân tử đầu tiên về tình trạng di truyền ngoại gen của ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam. Các kết quả của luận án đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế, tạo tiền đề cho hàng loạt nghiên cứu chuyên sâu về epigenetics ung thư tại Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Thúc đẩy công nghệ sinh học y dược nội địa: Quy trình kỹ thuật Nested MS-PCR kết hợp lai điểm dot blot sử dụng hệ thống mẫu dò tự thiết kế mở ra triển vọng tự chủ sản xuất các bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán phân tử "Make in Vietnam" với giá thành chỉ bằng 1/5 đến 1/10 so với các kit thương mại nhập ngoại như ConfirmMDx hay LightMix Kit GSTP1 (Epigenomics).
• Định hướng chính sách y tế dự phòng: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc để các nhà hoạch định chính sách y tế xem xét đưa các dấu chuẩn sinh học phân tử di truyền ngoại gen vào hướng dẫn chẩn đoán và điều trị quốc gia, tối ưu hóa nguồn lực bảo hiểm y tế qua việc giảm các can thiệp ngoại khoa sinh thiết không cần thiết.

---

Đối tượng hưởng lợi

Công trình mang lại giá trị thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và Giới nghiên cứu học thuật: Tiếp cận một quy trình chuẩn hóa chi tiết về thiết kế mồi lồng cho DNA sau xử lý bisulfite, kỹ thuật kiểm chuẩn biến đổi bằng gen nội suy $\beta$-globin, và phương pháp lai phân tử tăng cường độ nhạy.
• Bác sĩ Chuyên khoa Ung bướu và Tiết niệu: Có thêm công cụ phân tử tin cậy hỗ trợ hội chẩn các ca bệnh nghi ngờ, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân có nồng độ PSA tăng nhẹ nhưng kết quả sinh thiết mô học lần đầu âm tính.
• Doanh nghiệp R&D Công nghệ Sinh học: Tiếp nhận nền tảng quy trình công nghệ tối ưu hóa mẫu dò biotin và quy trình lai màng để hoàn thiện các kit chẩn đoán phân tử thương mại hóa phục vụ thị trường trong nước.
• Bệnh nhân và Hệ thống Y tế Xã hội: Hưởng lợi trực tiếp từ phương pháp chẩn đoán chính xác cao, phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm có thể chữa khỏi, giảm thiểu gánh nặng chi phí y tế và biến chứng do sinh thiết lặp lại.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc chứng minh sự bất hoạt của gen GSTP1 thông qua hiện tượng tăng methyl hóa vùng promoter đóng vai trò là một "epigenetic driver" khởi phát trong sinh ung thư tuyến tiền liệt trên quần thể người Việt Nam. Công trình mở rộng trực tiếp Lý thuyết Bất hoạt gen do Di truyền ngoại gen (Epigenetic Gene Silencing Theory) của Jones & Baylin (2002) bằng việc cung cấp bằng chứng thực nghiệm cho thấy sự biến đổi trạng thái methyl hóa DNA xảy ra trước khi có các biến đổi hình thái ác tính cấu trúc tế bào, đồng thời giải thích cơ chế suy giảm năng lực chống oxy hóa tế bào thúc đẩy chuyển dạng ác tính.

2. Đột phá phương pháp luận của nghiên cứu khi so sánh với các công bố tiền nhiệm?

So với các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật MS-PCR thông thường của Herman et al. (1996) hoặc COBRA của Xiong & Laird (1997) – vốn thường bị giới hạn về độ nhạy (chỉ phát hiện được khi tỷ lệ alen methyl hóa đạt 0,1–1%) và dễ cho kết quả âm tính giả trên mẫu DNA FFPE bị đứt gãy –, luận án đã phát triển phương pháp tích hợp hai bậc: Nested MS-PCR kết hợp lai điểm đặc hiệu methyl (MS-DBA). Sự kết hợp này nâng độ nhạy phát hiện lên mức 0,01% (gấp 15 lần so với MS-PCR thông thường), đồng thời khắc phục triệt để hiện tượng dương tính giả do bắt cặp chéo của mồi nhờ cơ chế nhận diện bổ sung đặc hiệu của mẫu dò oligomer gắn biotin.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong số liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ và có ý nghĩa lâm sàng sâu sắc nhất là việc phát hiện 10,8% (4/37 mẫu) bệnh phẩm được chẩn đoán mô bệnh học là quá sản lành tính (BPH) lại mang promoter GSTP1 bị methyl hóa hoàn toàn (được khẳng định bằng phản ứng cắt enzym giới hạn BstUI và giải trình tự Sanger trực tiếp). Kết quả này phản ánh sự tồn tại của tổn thương tiền ung thư tiềm ẩn cấp độ phân tử (epigenetic field cancerization) mà phương pháp giải phẫu bệnh học truyền thống qua nhuộm H&E chưa thể phát hiện được.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) chuẩn xác không?

Có. Luận án trình bày chi tiết tuyệt đối toàn bộ thông số thực nghiệm: trình tự chính xác của 12 đoạn mồi và mẫu dò (Bảng 2.2), nồng độ các thành phần hóa chất trong phản ứng (JumpStart Taq Polymerase, Biotin-11-dUTP, nồng độ ion $\text{Mg}^{2+}$), chu trình nhiệt chi tiết cho cả 2 vòng Nested PCR, điều kiện xử lý biến tính trên màng nylon và nhiệt độ lai tối ưu chính xác ở 55°C với dung dịch đệm chuẩn $2\times\text{SSC} / 0,1%\text{SDS}$.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm (10-Year Research Agenda) mở ra từ luận án là gì?

Chương trình nghiên cứu dài hạn bao gồm:

1. Phát triển panel chẩn đoán đa gen (GSTP1, RASSF1A, APC, HOXD3) trên mẫu sinh thiết lỏng (nước tiểu và huyết tương) bằng công nghệ Droplet Digital PCR (ddPCR).
2. Xây dựng bản đồ biểu hiện Methylome toàn hệ gen (Genome-wide Methylation Profiling) trên bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự Bisulfite thế hệ mới (NGS).
3. Đánh giá hiệu quả của các thuốc ức chế enzyme DNA Methyltransferase (DNMT inhibitors như 5-azacytidine) trong việc tái kích hoạt gen GSTP1 nhằm phục hồi độ nhạy hóa - xạ trị trong các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt kháng cắt tinh hoàn.

---

Kết luận

Công trình luận án tiến sĩ của NCS Vương Diệu Linh là một dấu mốc học thuật xuất sắc với 5 đóng góp cốt lõi được định lượng rõ ràng:

1. Thiết lập tỷ lệ methyl hóa chuẩn xác: Xác định tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 đạt 66,1% ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt và 10,8% ở bệnh nhân quá sản lành tính tại Việt Nam ($p < 0,05$).
2. Đột phá về công nghệ phân tích: Phát triển thành công quy trình kết hợp Nested MS-PCR và lai điểm phân tử (MS-DBA), nâng độ nhạy phát hiện methyl hóa lên ngưỡng siêu nhạy 0,01% (nhận diện được 10 bản sao gen đích trên nền DNA tạp nhiễm).
3. Kiểm chuẩn phân tử đa tầng nghiêm ngặt: 100% sản phẩm khuếch đại được kiểm chứng chéo bằng enzyme cắt giới hạn BstUI và giải trình tự gen Sanger trực tiếp, loại bỏ hoàn toàn các sai số phân tích.
4. Mở ra hướng ứng dụng dấu chuẩn sinh học mới: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng bộ kit chẩn đoán phân tử hỗ trợ xét nghiệm PSA, giúp giảm sinh thiết xâm lấn không cần thiết và phát hiện sớm tổn thương tiền ung thư.
5. Đóng góp vào kho tàng tri thức quốc tế: Bổ sung dữ liệu dịch tễ học phân tử về di truyền ngoại gen của ung thư tuyến tiền liệt tại khu vực Đông Nam Á, khẳng định vai trò của dấu chuẩn GSTP1 trong y học cá thể hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Di truyền ngoại gen là thông tin di truyền qui định bởi cách thức methyl hóa DNA và biến đổi histone. Thay đổi mức độ methyl hóa DNA là một trong những biến đổi di truyền ngoại gen tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen. Thực tế cho thấy rất nhiều bệnh ung thƣ khác nhau liên quan mật thiết đến thay đổi mức độ methyl hóa ở promoter của các gen ức chế khối u; làm bất hoạt các gen đó dẫn đến hình thành và phát triển ung thƣ. Ngoài ra, mức độ methyl hóa bất thƣờng còn là dấu hiệu tiên lƣợng bệnh tái phát hoặc di căn.

Hoạt động của những gen liên quan đến tính nhạy cảm với hóa, xạ trị có thể bị thay đổi bởi sự methyl/khử methyl dẫn đến tính kháng. Do đó mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lƣợng và điều trị ung thƣ. Ung thƣ tuyến tiền liệt là loại ung thƣ phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao ở nam giới. Giống nhƣ ở các loại ung thƣ khác, hiện tƣợng methyl hóa DNA tăng cao ở một số gen trong ung thƣ tuyến tiền liệt, đặc biệt ở giai đoạn sớm.

Trong đó, gen đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là GSTP1 (π-class glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử các độc tố gây ung thƣ. Methyl hóa GSTP1 xảy ra phổ biến (90 %) ở ung thƣ tuyến tiền liệt nhƣng rất hiếm ở các loại ung thƣ khác. Hơn nữa, methyl hóa GSTP1 tăng tỷ lệ với cấp độ ung thƣ từ nguyên phát đến di căn. Tuy nhiên tỷ lệ methyl hóa GSTP1 thay đổi phụ thuộc vào chủng tộc, vùng địa lý.

Do đó methyl hóa GSTP1 đƣợc tập trung nghiên cứu với các chủng tộc ngƣời ở các quốc gia khác nhau để phát triển thành dấu chuẩn hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ tuyến tiền liệt. Năm 2011, công ty MDx Health (Mỹ) đã thử nghiệm bộ kit “ConfirmMDx” phát hiện sớm ung thƣ tuyến tiền liệt dựa vào methyl hóa của 3 gen GSTP1, APC và RASSF1A. Năm 2013, bộ kit này đã đƣợc thƣơng mại và đƣa vào danh mục bảo hiểm y tế chi trả cho thăm khám định kỳ ở Mỹ. Ở Việt Nam, nghiên cứu cơ bản về methyl hóa DNA nói chung và dấu chuẩn methyl hóa DNA liên quan đến ung thƣ nói riêng mới đƣợc triển khai.

Nghiên cứu và phát triển thế hệ dấu chuẩn mới, dấu chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán 13 sớm, tiên lƣợng đúng và điều trị đích chính xác là nhiệm vụ cấp thiết của sinh y học hiện đại. Với mong muốn nghiên cứu di truyền ngoại gen và theo kịp những tiến bộ của Y học hiện đại trong việc ứng dụng các dấu chuẩn mới phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lƣợng sống cho ngƣời dân Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hiện tƣợng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt” với mục đích: 1) Tối ƣu hóa thành phần, điều kiện kỹ thuật và đánh giá độ nhạy MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, 2) Xác định mối liên quan giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thƣ và quá sản lành tính tuyến tiền liệt, 3) Phát triển kỹ thuật lai điểm tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt. Nội dung nghiên cứu: - Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, - Thiết lập và xác định điều kiện tối ƣu để xử lý bisulfite cho DNA tổng số tách chiết từ dòng tế bào PC3, từ mẫu máu và các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt, - Xây dựng đối chứng chuẩn cho phản ứng MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1.

DNA tách từ dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng phát hiện GSTP1 bị methyl hóa và DNA tách từ mẫu máu ngƣời khỏe mạnh làm đối chứng dƣơng phát hiện GSTP1 không bị methyl hóa, - Áp dụng các kỹ thuật MS-PCR (methylation-specific PCR), phƣơng pháp xác định trình tự gen và kỹ thuật cắt enzym giới hạn phân tích mức độ methyl hóa promoter gen GSTP1 trong các mẫu bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, 14 - Xây dựng các mẫu đối chứng GSTP1 bị methyl hóa, GSTP1 không bị methyl hóa để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR, tức là xác định đƣợc nồng độ (số alen GSTP1 tối thiểu bị methyl hóa) mà kỹ thuật MS-PCR có thể phát hiện đƣợc khi áp dụng hỗ trợ chẩn đoán ung thƣ tuyến tiền liệt, - Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng, -Thiết kế đầu dò cho kỹ thuật lai điểm nhằm tăng độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR trong việc phát hiện sự methyl hóa ở promoter gen GSTP1. Những đóng góp mới của luận án: - Lần đầu tiên xây dựng và tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phản ứng MS-PCR để phát hiện promoter gen GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt; xác định đƣợc tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt và quá sản lành tính chiếm 66,1 % và 10,8 %. Ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt qua phản ứng MS-PCR là 0,15 %. - Sự sai khác có ý nghĩa giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với ung thƣ tuyến tiền liệt, p < 0,05.

- Kết hợp kỹ thuật lai điểm với kỹ thuật MS-PCR để tăng độ nhạy (ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 là 0,01 %), đảm bảo độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR trong việc phát hiện methyl hóa ở promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt. Ung thƣ Ung thƣ đƣợc xem là căn bệnh nan y trong đó một số tế bào của một tổ chức (mô) phân chia không kiểm soát, xâm lấn sang các tổ chức lân cận và có khả năng di căn đến các tổ chức khác ở xa nơi xuất hiện khối u nguyên phát [101]. Sinh trƣởng không kiểm soát của tế bào liên quan đến các hiện tƣợng: (1) Bất hoạt các gen ức chế khối u, (2) Kích hoạt các gen tiền ung thƣ thành các gen gây ung thƣ (3) Thay đổi hoạt động của các gen có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA. Cả ba hiện tƣợng này liên quan chặt chẽ đến đột biến lớn ở cấp độ nhiễm sắc thể cũng nhƣ đột biến điểm ở một gen riêng biệt.

Tuy nhiên, cả 3 hiện tƣợng đều có thể xảy ra ngay cả khi không có một đột biến nào dù chỉ một nucleotide. Đó là do những biến đổi (hay có thể xem là đột biến) ở mức độ di truyền ngoại gen mà không liên quan tới biến đổi trong trình tự DNA. Đặc biệt, những biến đổi di truyền ngoại gen thƣờng xuất hiện sớm, thúc đẩy tế bào bình thƣờng chuyển sang trạng thái ác tính, từ đó dẫn đến phát sinh khối u [93]. Thực trạng ung thƣ Ung thƣ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và là nguyên nhân tử vong đứng thứ hai ở các nƣớc đang phát triển [61].

Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới WHO, ƣớc tính đến năm 2030 dân số thế giới sẽ tăng đến 8,3 tỷ ngƣời, khả năng mắc ung thƣ mới mỗi năm khoảng 27 triệu ngƣời, 17 triệu ngƣời chết vì ung thƣ [19]. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới IARC, trong các trƣờng hợp mắc bệnh và tử vong vì ung thƣ, hơn một nửa số ca có liên quan và hơn hai phần ba trƣờng hợp ung thƣ sẽ gia tăng ở những nƣớc có thu nhập thấp và trung bình. Ung thƣ chủ yếu tập trung ở các dạng ung thƣ phổi, vú, tuyến tiền liệt, buồng trứng, gan, máu, da…[19] Việt Nam là nƣớc đang phát triển gắn liền với sự thay đổi về kinh tế, mức sống đƣợc nâng cao, dẫn đến sự gia tăng của một số bệnh nhƣ tim mạch, tiểu đƣờng và ung thƣ. Năm 2007, Việt Nam có khoảng 110 000 ngƣời mắc ung thƣ mới trong đó 16 khoảng 82 000 ngƣời tử vong do ung thƣ mỗi năm, chiếm tới 73,5 % tổng số bệnh nhân ung thƣ [87].

Đây là tỷ lệ tử vong thuộc hàng cao nhất thế giới, so với tỷ lệ tử vong trên tổng số bệnh nhân ung thƣ toàn cầu là 59,7 % (đối với các nƣớc đang phát triển là 67,8 % và nƣớc phát triển là 49,4 %) [87]. Theo thống kê của Bệnh viện K và Trung tâm Ung bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, hàng năm số lƣợng bệnh nhân mắc ung thƣ tăng thêm khoảng 20 - 30 %, trong đó mƣời loại ung thƣ phổ biến nhất là ung thƣ phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, tuyến tiền liệt, cổ tử cung [140]. Cơ sở tế bào học ung thƣ Ung thƣ có thể hình thành trong một cơ quan hoặc mô nhất định. Hơn 100 dạng ung thƣ đƣợc phân loại dựa trên mức độ hình thành từ vùng mô ban đầu.

Dạng phổ biến nhất của ung thƣ là ung thƣ biểu mô chiếm trên 80 % các loại ung thƣ [48, 101]. Trong quá trình hình thành khối u, tế bào ung thƣ biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu đặc điểm nổi bật bao gồm: Duy trì tín hiệu tăng sinh; Trốn tránh các yếu tố ức chế khối u; Chống lại sự chết theo chƣơng trình (apoptosis); Cho phép tăng sinh không kiểm soát; Cảm ứng hình thành mạch máu và hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn [48]. (2000), sáu đặc điểm cơ bản của tế bào ung thƣ (Hình 1.1) đƣợc thể hiện trong 6 giai đoạn chính hình thành khối u [48]. Sáu đặc trƣng cơ bản của ung thƣ: (1) Duy trì tín hiệu tăng sinh, (2) Trốn tránh các yếu tố ức chế khối u, (3) Chống lại sự chết của tế bào, (4) Khả năng nhân lên bất tử, (5) Cảm ứng quá trình hình thành mạch máu, và (6) Hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn [48].

• Giai đoạn khởi phát: Tế bào ung thƣ nhận đƣợc các tín hiệu nội bào hoặc ngoại bào kích thích tế bào phân chia liên tục [132]. • Giai đoạn tăng trƣởng: Các tế bào trở nên “vô cảm” với các tín hiệu ức chế phân bào.