MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Di truyền ngoại gen là thông tin di truyền qui định bởi cách thức methyl hóa DNA và biến đổi histone. Thay đổi mức độ methyl hóa DNA là một trong những biến đổi di truyền ngoại gen tham gia kiểm soát tiêu cực, kìm hãm hoạt động của gen. Thực tế cho thấy rất nhiều bệnh ung thƣ khác nhau liên quan mật thiết đến thay đổi mức độ methyl hóa ở promoter của các gen ức chế khối u; làm bất hoạt các gen đó dẫn đến hình thành và phát triển ung thƣ. Ngoài ra, mức độ methyl hóa bất thƣờng còn là dấu hiệu tiên lƣợng bệnh tái phát hoặc di căn.
Hoạt động của những gen liên quan đến tính nhạy cảm với hóa, xạ trị có thể bị thay đổi bởi sự methyl/khử methyl dẫn đến tính kháng. Do đó mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm năng trong chẩn đoán, tiên lƣợng và điều trị ung thƣ. Ung thƣ tuyến tiền liệt là loại ung thƣ phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao ở nam giới. Giống nhƣ ở các loại ung thƣ khác, hiện tƣợng methyl hóa DNA tăng cao ở một số gen trong ung thƣ tuyến tiền liệt, đặc biệt ở giai đoạn sớm.
Trong đó, gen đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là GSTP1 (π-class glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử các độc tố gây ung thƣ. Methyl hóa GSTP1 xảy ra phổ biến (90 %) ở ung thƣ tuyến tiền liệt nhƣng rất hiếm ở các loại ung thƣ khác. Hơn nữa, methyl hóa GSTP1 tăng tỷ lệ với cấp độ ung thƣ từ nguyên phát đến di căn. Tuy nhiên tỷ lệ methyl hóa GSTP1 thay đổi phụ thuộc vào chủng tộc, vùng địa lý.
Do đó methyl hóa GSTP1 đƣợc tập trung nghiên cứu với các chủng tộc ngƣời ở các quốc gia khác nhau để phát triển thành dấu chuẩn hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ tuyến tiền liệt. Năm 2011, công ty MDx Health (Mỹ) đã thử nghiệm bộ kit “ConfirmMDx” phát hiện sớm ung thƣ tuyến tiền liệt dựa vào methyl hóa của 3 gen GSTP1, APC và RASSF1A. Năm 2013, bộ kit này đã đƣợc thƣơng mại và đƣa vào danh mục bảo hiểm y tế chi trả cho thăm khám định kỳ ở Mỹ. Ở Việt Nam, nghiên cứu cơ bản về methyl hóa DNA nói chung và dấu chuẩn methyl hóa DNA liên quan đến ung thƣ nói riêng mới đƣợc triển khai.
Nghiên cứu và phát triển thế hệ dấu chuẩn mới, dấu chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán 13 sớm, tiên lƣợng đúng và điều trị đích chính xác là nhiệm vụ cấp thiết của sinh y học hiện đại. Với mong muốn nghiên cứu di truyền ngoại gen và theo kịp những tiến bộ của Y học hiện đại trong việc ứng dụng các dấu chuẩn mới phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lƣợng sống cho ngƣời dân Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hiện tƣợng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt” với mục đích: 1) Tối ƣu hóa thành phần, điều kiện kỹ thuật và đánh giá độ nhạy MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, 2) Xác định mối liên quan giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thƣ và quá sản lành tính tuyến tiền liệt, 3) Phát triển kỹ thuật lai điểm tăng độ nhạy và đảm bảo độ chính xác phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt. Nội dung nghiên cứu: - Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, - Thiết lập và xác định điều kiện tối ƣu để xử lý bisulfite cho DNA tổng số tách chiết từ dòng tế bào PC3, từ mẫu máu và các mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt, - Xây dựng đối chứng chuẩn cho phản ứng MS-PCR phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1.
DNA tách từ dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng phát hiện GSTP1 bị methyl hóa và DNA tách từ mẫu máu ngƣời khỏe mạnh làm đối chứng dƣơng phát hiện GSTP1 không bị methyl hóa, - Áp dụng các kỹ thuật MS-PCR (methylation-specific PCR), phƣơng pháp xác định trình tự gen và kỹ thuật cắt enzym giới hạn phân tích mức độ methyl hóa promoter gen GSTP1 trong các mẫu bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt, 14 - Xây dựng các mẫu đối chứng GSTP1 bị methyl hóa, GSTP1 không bị methyl hóa để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR, tức là xác định đƣợc nồng độ (số alen GSTP1 tối thiểu bị methyl hóa) mà kỹ thuật MS-PCR có thể phát hiện đƣợc khi áp dụng hỗ trợ chẩn đoán ung thƣ tuyến tiền liệt, - Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng, -Thiết kế đầu dò cho kỹ thuật lai điểm nhằm tăng độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR trong việc phát hiện sự methyl hóa ở promoter gen GSTP1. Những đóng góp mới của luận án: - Lần đầu tiên xây dựng và tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phản ứng MS-PCR để phát hiện promoter gen GSTP1 bị methyl hóa ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt; xác định đƣợc tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt và quá sản lành tính chiếm 66,1 % và 10,8 %. Ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 ở bệnh nhân quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt qua phản ứng MS-PCR là 0,15 %. - Sự sai khác có ý nghĩa giữa methyl hóa promoter gen GSTP1 với ung thƣ tuyến tiền liệt, p < 0,05.
- Kết hợp kỹ thuật lai điểm với kỹ thuật MS-PCR để tăng độ nhạy (ngƣỡng phát hiện methyl hóa promoter gen GSTP1 là 0,01 %), đảm bảo độ đặc hiệu của kỹ thuật MS-PCR trong việc phát hiện methyl hóa ở promoter gen GSTP1 trên bệnh phẩm quá sản lành tính và ung thƣ tuyến tiền liệt. Ung thƣ Ung thƣ đƣợc xem là căn bệnh nan y trong đó một số tế bào của một tổ chức (mô) phân chia không kiểm soát, xâm lấn sang các tổ chức lân cận và có khả năng di căn đến các tổ chức khác ở xa nơi xuất hiện khối u nguyên phát [101]. Sinh trƣởng không kiểm soát của tế bào liên quan đến các hiện tƣợng: (1) Bất hoạt các gen ức chế khối u, (2) Kích hoạt các gen tiền ung thƣ thành các gen gây ung thƣ (3) Thay đổi hoạt động của các gen có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA. Cả ba hiện tƣợng này liên quan chặt chẽ đến đột biến lớn ở cấp độ nhiễm sắc thể cũng nhƣ đột biến điểm ở một gen riêng biệt.
Tuy nhiên, cả 3 hiện tƣợng đều có thể xảy ra ngay cả khi không có một đột biến nào dù chỉ một nucleotide. Đó là do những biến đổi (hay có thể xem là đột biến) ở mức độ di truyền ngoại gen mà không liên quan tới biến đổi trong trình tự DNA. Đặc biệt, những biến đổi di truyền ngoại gen thƣờng xuất hiện sớm, thúc đẩy tế bào bình thƣờng chuyển sang trạng thái ác tính, từ đó dẫn đến phát sinh khối u [93]. Thực trạng ung thƣ Ung thƣ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và là nguyên nhân tử vong đứng thứ hai ở các nƣớc đang phát triển [61].
Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới WHO, ƣớc tính đến năm 2030 dân số thế giới sẽ tăng đến 8,3 tỷ ngƣời, khả năng mắc ung thƣ mới mỗi năm khoảng 27 triệu ngƣời, 17 triệu ngƣời chết vì ung thƣ [19]. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới IARC, trong các trƣờng hợp mắc bệnh và tử vong vì ung thƣ, hơn một nửa số ca có liên quan và hơn hai phần ba trƣờng hợp ung thƣ sẽ gia tăng ở những nƣớc có thu nhập thấp và trung bình. Ung thƣ chủ yếu tập trung ở các dạng ung thƣ phổi, vú, tuyến tiền liệt, buồng trứng, gan, máu, da…[19] Việt Nam là nƣớc đang phát triển gắn liền với sự thay đổi về kinh tế, mức sống đƣợc nâng cao, dẫn đến sự gia tăng của một số bệnh nhƣ tim mạch, tiểu đƣờng và ung thƣ. Năm 2007, Việt Nam có khoảng 110 000 ngƣời mắc ung thƣ mới trong đó 16 khoảng 82 000 ngƣời tử vong do ung thƣ mỗi năm, chiếm tới 73,5 % tổng số bệnh nhân ung thƣ [87].
Đây là tỷ lệ tử vong thuộc hàng cao nhất thế giới, so với tỷ lệ tử vong trên tổng số bệnh nhân ung thƣ toàn cầu là 59,7 % (đối với các nƣớc đang phát triển là 67,8 % và nƣớc phát triển là 49,4 %) [87]. Theo thống kê của Bệnh viện K và Trung tâm Ung bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, hàng năm số lƣợng bệnh nhân mắc ung thƣ tăng thêm khoảng 20 - 30 %, trong đó mƣời loại ung thƣ phổ biến nhất là ung thƣ phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng, vòm họng, thận, da, vú, tuyến tiền liệt, cổ tử cung [140]. Cơ sở tế bào học ung thƣ Ung thƣ có thể hình thành trong một cơ quan hoặc mô nhất định. Hơn 100 dạng ung thƣ đƣợc phân loại dựa trên mức độ hình thành từ vùng mô ban đầu.
Dạng phổ biến nhất của ung thƣ là ung thƣ biểu mô chiếm trên 80 % các loại ung thƣ [48, 101]. Trong quá trình hình thành khối u, tế bào ung thƣ biểu hiện nhiều đặc điểm, trong đó có sáu đặc điểm nổi bật bao gồm: Duy trì tín hiệu tăng sinh; Trốn tránh các yếu tố ức chế khối u; Chống lại sự chết theo chƣơng trình (apoptosis); Cho phép tăng sinh không kiểm soát; Cảm ứng hình thành mạch máu và hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn [48]. (2000), sáu đặc điểm cơ bản của tế bào ung thƣ (Hình 1.1) đƣợc thể hiện trong 6 giai đoạn chính hình thành khối u [48]. Sáu đặc trƣng cơ bản của ung thƣ: (1) Duy trì tín hiệu tăng sinh, (2) Trốn tránh các yếu tố ức chế khối u, (3) Chống lại sự chết của tế bào, (4) Khả năng nhân lên bất tử, (5) Cảm ứng quá trình hình thành mạch máu, và (6) Hoạt hóa quá trình xâm lấn và di căn [48].
• Giai đoạn khởi phát: Tế bào ung thƣ nhận đƣợc các tín hiệu nội bào hoặc ngoại bào kích thích tế bào phân chia liên tục [132]. • Giai đoạn tăng trƣởng: Các tế bào trở nên “vô cảm” với các tín hiệu ức chế phân bào.