Khóa luận: Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.26

Nghiên cứu về quá trình lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184 26, khám phá tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

• Đề tài: Nghiên Cứu Lên Men Tổng Hợp Kháng Sinh Từ Streptomyces 184 26

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về kháng sinh
• 1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)
• 1.3. Cải tạo giống và bảo quản giống vi sinh vật
• 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
• 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh
• 1.6. Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh
• 1.7. Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Giống xạ khuẩn
• 2.1.2. Vi sinh vật
• 2.1.3. Các loại môi trường nuôi cấy
• 2.1.4. Dụng cụ, hóa chất
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Chọn lọc và cải tạo giống
• 2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh
• 2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được
• 2.3. Phương pháp thực nghiệm
• 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy giữ giống
• 2.3.2. Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn
• 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
• 2.3.4. Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
• 2.3.5. Phương pháp cải tạo và chọn giống
• 2.3.6. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh
• 2.3.7. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc dịch lên men
• 2.3.8. Các phương pháp chiết tách kháng sinh
• 2.3.9. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký
• 2.3.10. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết
• 2.3.11. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
• 3.1. Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184
• 3.2. Kết quả chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng của kháng sinh
• 3.3. Kết quả cải tạo giống
• 3.3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
• 3.3.2. Kết quả đột biến
• 3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh
• 3.5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc
• 3.6. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh
• 3.7. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
• 3.8. Kết quả chạy sắc ký cột
• 3.9. Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học và một số đặc điểm của KS thu được
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHÁO
• DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Khám phá tiềm năng kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces 184

Trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao trở thành một ưu tiên hàng đầu trong y học. Xạ khuẩn, đặc biệt là chi Streptomyces, từ lâu đã được biết đến là một "nhà máy" sản xuất kháng sinh tự nhiên, đóng góp hơn 55% tổng số kháng sinh được phát hiện. Đề tài nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.26 mở ra một hướng đi đầy hứa hẹn, tập trung vào một chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất Tây Ninh, Việt Nam. Chủng này cho thấy tiềm năng to lớn trong việc sản xuất các chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Nghiên cứu này không chỉ dừng lại ở việc xác nhận khả năng sinh kháng sinh mà còn đi sâu vào việc tối ưu hóa toàn bộ quy trình, từ khâu cải thiện đặc tính di truyền của chủng vi sinh vật đến việc tìm ra điều kiện lên men và chiết tách hiệu quả nhất. Mục tiêu cuối cùng là thu được một hợp chất kháng sinh tinh khiết, có hoạt tính mạnh, đồng thời sơ bộ xác định cấu trúc hóa học của nó, tạo tiền đề cho các ứng dụng trong tương lai. Việc nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng, góp phần vào kho tàng các hợp chất kháng sinh mới, đặc biệt là những hợp chất có nguồn gốc bản địa, tận dụng sự đa dạng sinh học phong phú của Việt Nam.

1.1. Giới thiệu tổng quan về xạ khuẩn Streptomyces

Streptomyces là một chi vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có cấu trúc dạng sợi phân nhánh phức tạp, thuộc nhóm xạ khuẩn (Actinomycetes). Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là trong đất, và đóng vai trò quan trọng trong chu trình phân hủy vật chất hữu cơ. Đặc điểm nổi bật nhất của chi Streptomyces là khả năng sinh tổng hợp một loạt các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đa dạng, bao gồm kháng sinh, chất chống ung thư (actinomycin D), chất điều hòa miễn dịch và enzyme. Khả năng này biến chúng thành đối tượng nghiên cứu hàng đầu trong công nghệ sinh học và dược phẩm. Khuẩn lạc của Streptomyces trên môi trường thạch thường khô, có nếp nhăn tỏa ra như hình phóng xạ và bám chặt vào bề mặt môi trường. Chúng hình thành hai loại khuẩn ty: khuẩn ty cơ chất (KTCC) ăn sâu vào môi trường và khuẩn ty khí sinh (KTKS) phát triển trên bề mặt, mang các chuỗi bào tử. Màu sắc của khuẩn ty và bào tử là một trong những đặc điểm quan trọng dùng để phân loại. Nghiên cứu hình thái của chủng Streptomyces 184.26 là bước đầu tiên để định danh và hiểu rõ đặc tính sinh học của chúng.

1.2. Tầm quan trọng của việc tìm kiếm kháng sinh mới

Sự xuất hiện và lan rộng của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc đang là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Việc lạm dụng và sử dụng kháng sinh không đúng cách đã thúc đẩy quá trình tiến hóa của vi khuẩn, làm giảm hiệu quả của các loại thuốc hiện có. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết phải liên tục nghiên cứu và phát triển các loại kháng sinh mới với cơ chế tác động khác biệt. Khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật từ thiên nhiên, như các chủng Streptomyces, là một chiến lược hiệu quả để khám phá các hợp chất tiềm năng. Mỗi chủng mới được phân lập có thể mang trong mình mã di truyền để tổng hợp một loại kháng sinh độc đáo. Do đó, các công trình như nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.26 không chỉ có giá trị khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn to lớn, góp phần giải quyết cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh và bảo vệ sức khỏe con người trong tương lai.

II. Bí quyết cải tạo giống Streptomyces 184

Một trong những thách thức lớn nhất trong sản xuất kháng sinh quy mô công nghiệp là hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng vi sinh vật hoang dại thường rất thấp. Để khắc phục vấn đề này, quá trình cải tạo giống đóng một vai trò then chốt. Mục tiêu của việc cải tạo là tạo ra các biến chủng có khả năng sản xuất kháng sinh cao hơn nhiều lần so với chủng gốc, đồng thời ổn định về mặt di truyền và phù hợp với điều kiện lên men công nghiệp. Đối với chủng Streptomyces 184.26, nghiên cứu đã áp dụng một chiến lược cải tạo bậc thang, kết hợp giữa phương pháp sàng lọc tự nhiên và gây đột biến nhân tạo. Quá trình này đòi hỏi sự kiên trì, tỉ mỉ và các kỹ thuật vi sinh vật chính xác để phân lập, nuôi cấy và đánh giá hoạt tính kháng sinh của hàng trăm, thậm chí hàng nghìn khuẩn lạc. Thành công của giai đoạn này là yếu tố quyết định đến hiệu quả kinh tế của toàn bộ quy trình sản xuất, giúp giảm chi phí và tăng sản lượng, từ đó làm cho sản phẩm cuối cùng dễ tiếp cận hơn. Việc lựa chọn được biến chủng ưu việt sẽ là nền tảng vững chắc cho các bước tối ưu hóa tiếp theo trong quy trình lên men tổng hợp kháng sinh.

2.1. Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên SLNN để chọn chủng tốt

Sàng lọc ngẫu nhiên là bước đầu tiên trong quá trình cải tạo giống. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc biến dị tự nhiên luôn tồn tại trong một quần thể vi sinh vật. Từ một ống giống thuần khiết của Streptomyces 184.26, các bào tử được pha loãng và cấy trải trên môi trường thạch để thu được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Mỗi khuẩn lạc được xem như một dòng cá thể riêng biệt. Các nhà nghiên cứu sẽ chọn ngẫu nhiên hàng chục khuẩn lạc có hình thái đa dạng và tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của chúng trên các vi sinh vật kiểm định như Bacillus subtilis và Escherichia coli. Kết quả từ nghiên cứu gốc cho thấy, qua sàng lọc, dạng chủng SLNN.31 đã thể hiện hoạt tính vượt trội nhất. Phương pháp này tuy đơn giản nhưng rất hiệu quả trong việc phát hiện các biến dị tự nhiên có lợi, tạo ra nguồn vật liệu di truyền quý giá cho các bước cải tạo sâu hơn.

2.2. Kỹ thuật đột biến bằng tia tử ngoại UV nâng cao hoạt tính

Để đẩy nhanh quá trình cải tạo và tạo ra những biến đổi mạnh mẽ hơn, phương pháp đột biến UV đã được áp dụng. Tia tử ngoại (UV) là một tác nhân vật lý có khả năng gây ra những thay đổi trong cấu trúc AND của vi sinh vật. Khi chiếu tia UV với liều lượng và thời gian được kiểm soát chặt chẽ, một phần lớn tế bào sẽ bị tiêu diệt, nhưng những tế bào sống sót có thể mang những đột biến gen. Trong nghiên cứu này, các bào tử từ chủng tốt nhất sau sàng lọc ngẫu nhiên được xử lý bằng tia UV. Sau đó, các khuẩn lạc sống sót được sàng lọc lại để đánh giá hoạt tính kháng sinh. Nghiên cứu đã tiến hành đột biến hai lần liên tiếp (đột biến bậc thang). Kết quả cho thấy biến chủng ĐB2.36 thu được sau lần đột biến thứ hai có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao vượt trội so với chủng gốc. Kỹ thuật đột biến UV là một công cụ mạnh mẽ, giúp phá vỡ các cơ chế điều hòa kìm hãm, từ đó "mở khóa" tiềm năng sản xuất kháng sinh của chủng Streptomyces 184.26.

III. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh Streptomyces 184

Sau khi đã có trong tay biến chủng ưu việt, bước tiếp theo là tối ưu hóa quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh. Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong một môi trường dinh dưỡng được kiểm soát để chúng tạo ra sản phẩm mong muốn. Trong sản xuất kháng sinh hiện đại, phương pháp lên men chìm (submerged fermentation) được ưa chuộng hơn cả do dễ tự động hóa, kiểm soát điều kiện và cho hiệu suất cao. Quá trình này được thực hiện trong các bình phản ứng sinh học (bioreactor), nơi vi sinh vật phát triển lơ lửng trong môi trường lỏng. Việc lựa chọn thành phần môi trường và các điều kiện vật lý như pH, nhiệt độ, tốc độ lắc (sục khí) ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của Streptomyces 184.26 và khả năng sản xuất kháng sinh của nó. Một môi trường lên men tối ưu phải cung cấp đủ nguồn carbon, nito, khoáng chất và các yếu tố vi lượng cần thiết cho quá trình trao đổi chất thứ cấp. Nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát nhiều công thức môi trường khác nhau để tìm ra môi trường cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, đảm bảo nền tảng cho việc thu được lượng lớn dịch lên men để tiến hành chiết tách và tinh chế.

3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy MT thích hợp nhất

Thành phần môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá trình lên men. Mỗi chủng vi sinh vật có những yêu cầu dinh dưỡng riêng biệt. Trong nghiên cứu về Streptomyces 184.26, nhiều công thức môi trường khác nhau (ký hiệu MT1, MT2, MT5, MT6, MT7) đã được thử nghiệm. Các môi trường này chứa các nguồn carbon (tinh bột, glucose), nguồn nito (bột đậu tương, pepton), và các muối khoáng cần thiết. Bằng cách nuôi cấy biến chủng đã được cải tạo trên các môi trường dịch thể tương ứng, sau đó đo hoạt tính kháng sinh của dịch lọc, nghiên cứu đã xác định được môi trường tối ưu. Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng, môi trường MT2dt (dịch thể) cho phép chủng Streptomyces 184.26 tạo ra vòng vô khuẩn lớn nhất trên cả E. coli và B. subtilis. Do đó, MT2dt đã được chọn làm môi trường chính cho quá trình lên men chìm ở quy mô lớn hơn.

3.2. Đánh giá độ bền của kháng sinh theo pH và nhiệt độ

Việc hiểu rõ độ bền của kháng sinh trong dịch lên men là cực kỳ quan trọng cho các bước xử lý tiếp theo như bảo quản và chiết tách. Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính kháng sinh. Dịch lọc lên men được điều chỉnh đến các mức pH khác nhau (3, 5, 7, 9, 11) và ủ ở các nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ phòng, đun cách thủy, đun sôi). Kết quả cho thấy kháng sinh do Streptomyces 184.26 tổng hợp có hoạt tính bền và cao nhất ở pH=3. Ngược lại, hoạt chất này không bền với nhiệt độ cao; hoạt tính kháng sinh giảm đáng kể khi đun nóng. Những thông tin này cung cấp chỉ dẫn quý báu: quá trình chiết tách và cô đặc dịch chiết nên được thực hiện ở pH axit và nhiệt độ thấp (ví dụ: sử dụng máy cất quay chân không) để bảo toàn tối đa hoạt tính của sản phẩm.

IV. Hướng dẫn chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

Sau khi kết thúc quá trình lên men, kháng sinh tồn tại trong một hỗn hợp phức tạp cùng với sinh khối tế bào, các chất dinh dưỡng còn sót lại và nhiều sản phẩm trao đổi chất khác. Do đó, quá trình chiết tách và tinh chế kháng sinh là bắt buộc để thu được hợp chất tinh khiết. Giai đoạn này bao gồm nhiều bước, bắt đầu bằng việc loại bỏ sinh khối tế bào (thường bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc), tiếp theo là chiết hoạt chất từ dịch lọc vào một dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước. Việc lựa chọn dung môi và pH chiết phù hợp là rất quan trọng để đạt hiệu suất thu hồi cao nhất. Sau khi chiết, dịch dung môi hữu cơ chứa kháng sinh thô sẽ được cô đặc. Hỗn hợp thô này sau đó cần được tinh chế sâu hơn bằng các phương pháp sắc ký. Các kỹ thuật như sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột được sử dụng để tách riêng các thành phần khác nhau trong dịch chiết, dựa trên sự khác biệt về tính chất hóa lý của chúng, cuối cùng phân lập được kháng sinh ở dạng tinh khiết để phục vụ cho việc xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học.

4.1. Lựa chọn dung môi hữu cơ và pH tối ưu cho quá trình chiết

Hiệu quả của việc chiết kháng sinh phụ thuộc lớn vào sự phân bố của hoạt chất giữa pha nước (dịch lên men) và pha dung môi hữu cơ. Nghiên cứu đã thử nghiệm nhiều loại dung môi như ethyl acetate, n-butanol ở các điều kiện pH khác nhau. Dựa trên việc đo hoạt tính kháng sinh trong cả pha dung môi và pha nước sau khi chiết, kết quả đã khẳng định rằng dung môi ethyl acetat ở pH=3 cho hiệu quả chiết tách tốt nhất. Ở điều kiện này, hoạt chất kháng sinh được chuyển gần như hoàn toàn từ dịch lọc sang lớp ethyl acetat, trong khi lớp nước còn lại rất ít hoặc không còn hoạt tính. Việc xác định được điều kiện chiết tối ưu này là một bước tiến quan trọng, giúp tối đa hóa lượng kháng sinh thô thu được, tạo điều kiện thuận lợi cho các bước tinh chế sau này.

4.2. Ứng dụng sắc ký cột để phân lập các thành phần kháng sinh

Sắc ký cột là một kỹ thuật mạnh mẽ để tách và tinh chế các hợp chất từ một hỗn hợp. Trong nghiên cứu này, bột kháng sinh thô thu được sau khi cô đặc dịch chiết ethyl acetat đã được nạp lên một cột nhồi silica gel. Một hệ dung môi phù hợp (hệ 3: Butylacetat:Ethanol:Triethylamin) được cho chảy liên tục qua cột. Các thành phần khác nhau trong hỗn hợp thô sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau do ái lực tương tác với pha tĩnh (silica gel) và pha động (dung môi) là khác nhau. Dịch chảy ra khỏi cột được thu thành nhiều phân đoạn nhỏ. Bằng cách kiểm tra hoạt tính kháng sinh và phân tích thành phần của từng phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, nghiên cứu đã xác định và gộp các phân đoạn chứa cùng một chất. Qua nhiều lần chạy cột tinh chế, nghiên cứu đã thành công phân lập được ít nhất hai thành phần kháng sinh riêng biệt, được ký hiệu là KS1 và KS2, với hiệu suất tách lần lượt là 14,36% và 26,14%.

V. Kết quả sơ bộ xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh mới

Bước cuối cùng và cũng là một trong những bước quan trọng nhất của một công trình nghiên cứu khám phá thuốc mới là xác định cấu trúc hóa học của hợp chất đã được tinh chế. Việc biết được cấu trúc phân tử cho phép các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế tác động, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính, đồng thời mở ra khả năng tổng hợp hóa học hoặc bán tổng hợp để tạo ra các dẫn xuất tốt hơn. Đối với kháng sinh KS2, thành phần thu được với hiệu suất cao hơn và có hoạt tính kháng sinh mạnh, nghiên cứu đã tiến hành phân tích bằng các phương pháp phổ hiện đại. Các kỹ thuật như phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến (UV-VIS), phổ hồng ngoại (IR), và phổ khối lượng (MS) đã được sử dụng. Mỗi phương pháp cung cấp những thông tin đặc trưng về các nhóm chức, các liên kết hóa học, và khối lượng phân tử của hợp chất. Mặc dù đây chỉ là những bước xác định sơ bộ, nhưng kết quả thu được là những mảnh ghép quan trọng, tạo nền tảng vững chắc cho các phân tích sâu hơn như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để làm sáng tỏ hoàn toàn cấu trúc hóa học của kháng sinh tiềm năng này.

5.1. Phân tích phổ tử ngoại UV và phổ hồng ngoại IR

Phân tích phổ cung cấp những "dấu vân tay" đặc trưng của một phân tử. Phổ UV-VIS của kháng sinh KS2 cho thấy hai đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 441 nm và 301 nm. Sự hiện diện của các đỉnh hấp thụ này gợi ý rằng trong cấu trúc phân tử có thể chứa các hệ thống liên kết đôi liên hợp, nhân thơm hoặc các dị tố như oxy, nito. Trong khi đó, phổ hồng ngoại (IR) cung cấp thông tin về các nhóm chức có mặt trong phân tử. Các đỉnh hấp thụ đặc trưng ghi nhận được trên phổ IR của KS2 tương ứng với dao động của các nhóm chức quan trọng như -OH (hydroxyl), -COOH (axit cacboxylic), C=O (carbonyl, có thể của aldehyd hoặc ester), và C-N (có thể của amin hoặc amid). Những dữ liệu này giúp phác thảo nên bộ khung cấu trúc ban đầu của hợp chất.

5.2. Xác định khối lượng phân tử bằng phổ khối lượng MS

Phổ khối lượng (MS) là một kỹ thuật phân tích cực kỳ nhạy và chính xác, cho phép xác định khối lượng phân tử của một hợp chất. Kết quả phân tích phổ khối lượng của mẫu kháng sinh KS2 tinh khiết cho thấy một tín hiệu ion phân tử, từ đó dự đoán khối lượng phân tử của hợp chất là khoảng 685.29 đvC. Đây là một thông tin cốt lõi, khi kết hợp với dữ liệu từ các phương pháp phổ khác và các phân tích nguyên tố, sẽ giúp các nhà hóa học đề xuất công thức phân tử và các cấu trúc hóa học có thể có của kháng sinh. Việc xác định chính xác khối lượng phân tử là một bước kiểm chứng quan trọng về độ tinh khiết của mẫu và là cơ sở để tiến hành các nghiên cứu xác định cấu trúc chi tiết hơn trong tương lai.

VI. Tương lai nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces tại Việt Nam

Công trình nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.26 đã đạt được những kết quả ban đầu rất đáng khích lệ, từ việc cải tạo thành công giống vi sinh vật đến việc phân lập và phân tích sơ bộ các hợp chất kháng sinh mới. Điều này không chỉ khẳng định tiềm năng của chủng Streptomyces 184.26 mà còn cho thấy hướng đi đúng đắn trong việc khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật bản địa của Việt Nam. Tương lai của lĩnh vực này hứa hẹn nhiều cơ hội và thách thức. Cần tiếp tục đầu tư vào các nghiên cứu sâu hơn để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các kháng sinh đã phân lập, đồng thời đánh giá phổ kháng khuẩn, độc tính và cơ chế tác động của chúng một cách toàn diện. Bên cạnh đó, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như giải trình tự gen, kỹ thuật di truyền sẽ giúp nâng cao hơn nữa hiệu suất sinh tổng hợp và thậm chí tạo ra các kháng sinh "lai" với những đặc tính mong muốn. Việc xây dựng một quy trình hoàn chỉnh từ phòng thí nghiệm đến sản xuất thử nghiệm sẽ là mục tiêu dài hạn, góp phần vào sự tự chủ về nguồn cung dược phẩm và nâng cao vị thế của ngành công nghệ sinh học Việt Nam.

6.1. Kiến nghị về định danh và cải tạo giống chuyên sâu

Để phát triển bền vững, các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc định danh chính xác tên khoa học của chủng Streptomyces 184.26 bằng các phương pháp sinh học phân tử như giải trình tự gen 16S rRNA. Việc này không chỉ cần thiết cho việc công bố khoa học mà còn giúp so sánh và đối chiếu với các chủng đã biết trên thế giới. Về cải tạo giống, bên cạnh các phương pháp truyền thống như đột biến UV, nên ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại. Các phương pháp như tái tổ hợp gen, kỹ thuật CRISPR-Cas9, hay dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những biến chủng với hiệu suất vượt trội và ổn định hơn, hướng tới việc tối ưu hóa cho sản xuất quy mô công nghiệp. Việc xây dựng một ngân hàng các biến chủng tốt sẽ là tài sản quý giá cho các nghiên cứu sau này.

6.2. Hướng phát triển quy trình sản xuất và ứng dụng thực tiễn

Từ những kết quả đạt được, hướng đi tiếp theo là hoàn thiện và tối ưu hóa quy trình lên men tổng hợp kháng sinh trong các hệ thống lên men lớn hơn (bioreactor 5 lít, 50 lít). Quá trình này đòi hỏi việc kiểm soát chặt chẽ các thông số như pH, nhiệt độ, oxy hòa tan và chế độ cấp dinh dưỡng để đạt năng suất tối đa. Đồng thời, cần tiếp tục nghiên cứu để xác định cấu trúc hóa học chính xác của KS1 và KS2 bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và các phương pháp khác. Sau khi có cấu trúc, cần tiến hành các thử nghiệm dược lý sâu rộng để đánh giá phổ tác dụng, độc tính cấp và mãn tính. Mục tiêu cuối cùng là phát triển một sản phẩm kháng sinh tiềm năng có thể được đưa vào thử nghiệm lâm sàng, góp phần giải quyết vấn đề kháng kháng sinh và mang lại giá trị kinh tế - xã hội to lớn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Bộ Y TÉ VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀLNGHIÊN cứu LÊN MEN TỔNG HỢP I Dir vien Vien oaiiTOc MOria [NQI KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.26 Ngưòi hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Sinh viên thực hiện: Bùi Ngọc Bích Lóp: CMSH-1101 Khóa: K18 HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Được sự phân công của Khoa Công nghệ sinh học - Viện đại học mờ Hà Nội Và sự đồng ý cúa thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu ớ Đại học Dược Hà Nội lôi dã thực hiện đề lài “ Nghiên cứu long hợp kháng sinh từ streptomyces 184.26” Đe hoàn thành khóa luận này tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giáng dạy tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện ở Khoa Công Nghệ Sinh Học- Viện Đại Học Mờ Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn đến thay giáo hướng dẫn PGS.TS: Cao Văn Thu đã tận tình, chu đáo hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này. Đồng thời tôi cũng rất biết ơn các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại Học Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho lôi hoàn thành khóa luận này Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành khóa luận hoàn chinh nhất nhưng do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và cũng hạn chế về kinh nghiệm và kiến thức nên không thế tránh khói nhưng thiếu sót nhất định cúa bán thân Tôi rất mong được sự góp ý của quý Thầy cô giáo và các bạn đe khóa luận được hoàn chinh hơn. Viện Đại học Mở Hà Nội Tôi xin chart thành earn ớn. ■ Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Ngọc Bích MỤC LỤC ĐẶT VÁN DÈ.

Đại cương về kháng sinh. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes). Cái tạo giống và bão quàn giống vi sinh vật. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh.

Chiết tách và tinh chế kháng sinh. Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces. 10 CHƯƠNG II.

ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU. Đối tượng nghiên cứu. Giong xạ khuẩn. Vi sinh vật.

Các loại môi trường nuôi cấy. Dụng cụ, hóa chất.2 Phương pháp nghiên cứu. Chọn lọc và cải tạo giống. Lên men, chiết tách kháng sinh.

Sơ bộ xác định một số tính chất cùa kháng sinh thu được. Phương pháp thực nghiệm. Phương pháp nuôi cấy giữ giong. Phương pháp xác định hình thái xạ khuân.

Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán. Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. Phương pháp cài tạo và chọn giống. Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh.

Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ ben pH của kháng sinh trong dịch lọc dịch lên men. Các phương pháp chiết tách kháng sinh. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết.

Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được. 24 CHƯƠNG III: KÉT QUẢ THỤ C NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT. Xác định hình thái xạ khuẩn streptomyces 184. Kết quã chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng cùa kháng sinh.

Ket quả cãi tạo giống. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. Kết quả đột biến. Kết quà lên men sinh tổng bợp kháng sinh.28 - " TI11Í viẹiĩ ViệnTJại nọc Mợ Hà Nội 3.

Kết quả đánh giá ảnh hường của pH và nhiệt độ đến độ bền cùa kháng sinh trong dịch lọc. Kết quà chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh. Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng. Kết quả chạy sắc kí cột.

Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học và một số đặc diếm cùa KS thu được.35 KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ. 36 TÀI LIỆU THAM KHÁO. 41 DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẨT AND Acid 2'- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces ISP quốc tế) KS Kháng sinh KTCC Khuân ty cơ chất KTKS Khuấn ty khí sinh MC Mầu chứng MT Môi trường MTdt tewiioW Mở Hà Nội E. coli Escherichia coli ATCC 25922 s Sai số chuẩn đã hiệu chình SKLM Sắc ký lớp móng SLNN Sàng lọc ngầu nhiên TB Tế bào uv Ultra violet (tứ ngoại) V The tích vsv Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC Bâng 2.

Các vi sinh vật kiếm định.2: Thành phần các môi trường nuôi cay xạ khuẩn (g/100ml). Môi trường nuôi cay vsv kiếm định. Các dung môi sử dụng và một số đặc tính của nó.1 Kốt quà thừ HTKS với 10 vsv kiếm định. Ket quả thử nghiệm HTK.S sàng lọc ngẫu nhiên.3 Kết quà thừ HTKS đột biến lần 1.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2.

Ket quà thử HTKS chọn môi trường lên men. Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt.7 Kết quả ành hưởng cùa pH đến độ bền kháng sinh. Anh hường của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trongdịch lọc. Kết quà chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau.

Kết quáỉ tách kháng áinh^rotig. Ket quà thừ HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1. Kết quả SKLM các PĐ 2-12 cúa lần chạy cột lần 2 tách KS1. Kết quả SKLM các PĐ 2-15 cũa lần chạy cột lần 3 tách KS2.

Ket quá thừ HTKS sàng lọc ngẫu nhiên.15 Kết quà thủ' HTKS đột biến lần 1.16 Kết quá thử HTKS đột biến lần 2.44 Phụ lục 4: Hình ành thử HTKS trong SLNN trên E. 46 Phụ lục 5: Hìnhảnh thử HTKS ờ ĐB 1 trên E. 46 Phụ lục 6: Hìnhảnh thứ HTKS ở ĐB 2 trên B. 47 Phụ lục 7: Hìnhánh phố tử ngoại vết (UV) vết KS2 của Streptomyces 184.

47 Phụ lục 8: Hìnhãnh phố từ ngoại vết (UV) vết KS2 của Streptomyces 184. 48 Phụ lục 9: Hình ảnh phố hồng ngoại (IR) KS2 của Streptomyces 184. 48 Phụ lục 10: Hình ãnh phổ khối (IM) KS2 của Streptomyces 184.49 ĐẬT VÁN ĐÈ Năm 1928 khi Alexander Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triến s.aureus của Penicillin notatum, đến năm 1940, Ermst Chain và Howard Walter đã chiết ra được Penicillin từ chúng Penicilium chrysogenium có hoạt tính cao hơn nhiều lần và đã cứu dược hàng ngàn thương binh trong chiến tranh thế giới thứ 1. Từ đó, các công trình nghiên cứu kháng sinh liên tục được tiến hành, ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng, và ngành công nghệ lên men sàn xuất kháng sinh đã ra đời.

Mặc dù đã có rất nhiều thành công trong việc phát hiện ra kháng sinh và những tiến bộ trong kỹ thuật sản xuất kháng sinh, nhưng hiện nay các bệnh nhiễm khuẩn vẫn đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới, khoang hơn 17 triệu người chết mỗi năm. Tự sử dụng thuốc và lạm dụng kháng sinh là một yếu tố quan trọng gây hiện tượng kháng kháng sinh, giảm tuồi thọ cùa thuốc. Do dó thay dược sự cấp thiết phái liên tục cho nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng sinh mới. Khí hậu Việt Nám điềù kỊiệh rất thuận lợi ého sự phát then đa dạng của hệ vsv, đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tồng hợp kháng sinh, trong số đó 55% là do chi Streptomyces săn xuất.

Chi này còn có nhiều vsv ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tống hợp các chất khác: chất điều trị ung thư (actinomycin D), chất kích thích tăng trường được sử dụng nhiều trong chăn nuôi. Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng họp kháng sinh từ Streptomyces 184.26" với các mục tiêu sau: - Cãi tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế KS. - Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tông họp dược.

Dại cương về kháng sinh 1. Định nghĩa kháng sinh Theo quan niệm truyền thống: "Kháng sinh là những sán phấtn trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triền hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác". Theo quan niệm hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cà các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tồng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cá với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bang con đường cung cấp chung. Kháng sinh là sán phẩm trao đổi chất thứ cấp chi được sinh tống hợp mạnh mẽ ở giai đoạn phát triến sau (pha logarit muộn, pha dừng, hoặc pha suy tàn) cùa sinh trường vsv.

Phân loại kháng sinh Có nhiều cách khác nhau đế phân loại kháng sinh: > Phân loại theo nguồn gốc: Khártg ạnh .nguồn gốc tự nhiên,.kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp. > Phân loại theo tính nhạy căm của vi khuân với kháng sinh: kháng sinh diệt khuân , kháng sinh kìm khuân > Phân loại theo cơ chế tác dụng: úc chế tống hợp vách tế bào vi khuân, ức chế tổng hợp protein, ức chế tống hợp acid nucleic, ức chế chuyển hóa, thay đổi tính thấm cùa màng tế bào. > Phân loại theo cấu trúc hóa học: Đây là cách phân loại khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được đặc diem cùa chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian đế nghiên cứu về các đặc diem khác. Khái quát theo đích tác dụng của kháng sinh: - Tổng họp thành tế bào: p -lactam, vancomycin.

- Màng tế bào chat: Polyen. - Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin. 2 - Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), macrolid (liên kết t-ADN). - Trao đối chất hô hấp: Antimycin,.

- Trao đồi chat folat: Sulfamid,. Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ờ phụ lục p. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh cùa xạ khuẩn. - Sự hình thành chất kháng sinh cùa xạ khuẩn: kháng sinh là sàn phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của quá trình sinh trường.

- Anh hường của thành phần lên men: nguồn carbon, nguồn nitơ, phosphat vô cơ và các yếu tố vi lượng. - Ảnh hường của điều kiện nuôi cấy: độ thông khí. pH, tuổi giống. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi trong tự nhiên.

Trước kia chúng được xếpíýàoTân thực-vậts nhưng hgày nay, chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomyces). Đa số xạ khuấn là vi khuấn Gr (+), hiếu khí. hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), tý lệ G+C > 55%.