Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ.1 Phôi ở giai đoạn tiền nhân. Noãn được thụ tinh tạo thành hợp tử và phát triển thành phôi qua nhiều giai đoạn, khởi đầu là giai đoạn tiền nhân. Tiền nhân đực và tiền nhân cái thường hình thành cùng một lúc. Tiền nhân đực hình thành gần vị trí tinh trùng thâm nhập và tiền nhân cái hình thành ở cực bào tương có thoi phân bào [3].
Khoảng 4 giờ sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn hoặc 5-6 giờ sau cấy noãn với tinh trùng có thể nhìn thấy hình ảnh các tiền nhân có kích thước nhỏ và mờ. Khoảng 15 giờ sau khi thụ tinh, hai tiền nhân nằm sát nhau và có hình số 8, và phần tiếp xúc sát nhau tạo thành một mặt phẳng, đồng thời các hạt nhân (nucleoli) sẽ di chuyển và xếp hàng cạnh vùng tiếp xúc hai tiền nhân. Mỗi tiền nhân có khoảng 1 đến 9 hạt nhân. Tiền nhân nhỏ có ít hạt nhân hơn [4].
Phôi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh). * Sự phân chia bào tương (cytokinesis.) Sự phân chia của phôi bao gồm một loạt các chu kỳ phân bào của bào tương, mặc dù kích thước phôi thay đổi không đáng kể. Trung thể của tinh trùng kiểm soát sự phân chia đầu tiên sau thụ tinh [5]. Trong chu kỳ phân bào đầu tiên ở giai đoạn cuối, bào tương của hợp tử kéo dài ra và thắt lại dần ở giữa cho đến khi hợp tử phân chia thành hai phôi bào.
Quá trình này tiếp tục trong những chu kỳ phân bào tiếp theo và kích thước của phôi bào giảm khoảng 28,5% cho mỗi chu kỳ phân bào. Trong 3 chu kỳ phân bào đầu tiên, kích thước của phôi thường ít thay đổi. Phôi có 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 đến 8 phôi bào phụ thuộc chủ yếu vào sự dịch mã (translation) từ các chất liệu RNA của mẹ để phân chia [6]. * Hình thái bất thường của phôi xảy ra trong quá trình phát triển của phôi.
Đánh giá hình thái của phôi tạo ra trong ống nghiệm đóng vai trò quan trọng làm tăng tỷ lệ làm tổ và có thai trong điều trị thụ tinh trong ống nghiệm. Phôi tạo ra trong ống nghiệm có các hình thái khác nhau. Ở hầu hết các trung tâm hỗ trợ sinh sản, để đánh giá chất lượng của phôi thường dựa vào các chỉ số hình thái như số lượng mảnh vụn tế bào, kích thước đồng nhất của phôi bào, số lượng nhân tế bào. - Mảnh vụn tế bào.
Mảnh vụn được tạo ra là do các phôi bào luôn luôn thay đổi hình dạng, các phôi bào tiếp xúc hoặc không tiếp xúc với nhau trong quá trình phân chia, vì vậy tạo nên những mảnh vụn tế bào sau phân chia. Phôi có số lượng mảnh vụn nhiều thường làm tổ kém hơn có thể là do giảm lượng bào tương sau chu kỳ phân bào bình thường và dẫn đến giảm số lượng phôi bào ở phôi nang. Nhiều mảnh vụn cũng làm ảnh hưởng tới quá trình phôi kết đặc lại do giảm tiếp xúc giữa các phôi bào với nhau. Các mảnh vụn xuất hiện sớm sau chu kỳ phân bào đầu tiên thường ảnh hưởng nhiều hơn đến sự phát triển của phôi.
Mặt khác, những mảnh vụn nhỏ xuất hiện chậm sẽ ít hoặc không ảnh hưởng đến phôi. - Phôi bào đa nhân (multinucleated blastomeres/MNB). Phôi bào đa nhân có thể xuất hiện ở bất kỳ chu kỳ phân chia nào từ 2 phôi bào đến giai đoạn phôi nang, nhưng quan sát rõ ở giai đoạn 2 phôi bào. Ở các giai đoạn sau sẽ khó quan sát hơn do phôi có nhiều phôi bào và mảnh vụn.
Phôi bào đa nhân có khả năng làm tổ kém do đó giảm tỷ lệ có thai và tỷ lệ sống sót [7]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 - Kích thước phôi bào không đều. Một trong những nguyên nhân làm kích thước phôi bào không đều là do sự phân chia không đồng bộ và thiếu cân đối (asynchronous and asymmetrical) hoặc 1 hay nhiều phôi bào ngừng phân chia. Phôi có kích thước phôi bào to nhỏ không đồng đều cũng có khả năng làm tổ thấp hơn phôi có kích thước phôi bào đồng đều [8].
- Phôi có kích thước lớn bất thường. Phôi có kích thước lớn bất thường là kết quả của sự thụ tinh với noãn lớn bất thường (giant egg). Phôi hoặc noãn này có kích thước khoảng 200 µm (bao gồm cả màng trong suốt). Phôi loại này thường là tam bội hoặc tam bội thể khảm và có thể phát triển thành phôi nang [9].
- Phôi có một phôi bào to nổi trội. Phôi có một phôi bào to và xung quanh là các mảnh vụn tế bào có kích thước nhỏ hơn kích thước phôi bào thông thường và thường là đa bội hoàn toàn hoặc thể khảm. Phôi bào to nổi trội này thường là đa nhân [10] và không bao giờ được chọn để chuyển phôi. - Phôi có bào tương bất thường không đều (irregularities).
Bào tương của phôi loại này thường có chứa không bào (vaculoles) hoặc thể vùi tối màu (dark inclusions) và liên quan nhiều đến rối loạn về nhiễm sắc thể nên khả năng phát triển và làm tổ kém [10]. - Phôi có hình thon dài (elongated shape embryos). Phôi có hình thon dài thường phát triển và có khả năng làm tổ như phôi có hình dạng bình thường [10]. * Tốc độ phân chia của phôi.
Tốc độ phân chia có liên quan đến khả năng sống của phôi. Phôi phân chia chậm thường có khả năng làm tổ kém hơn. Tốc độ nhân đôi tế bào ở phôi người từ ngày 2 đến 6 sau thụ tinh là khoảng 31 giờ, tốc độ nhân đôi này càng nhanh hơn sau hai lần phân chia đầu [6]. Phôi tạo ra trong ống nghiệm thường LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 có tốc độ nhân đôi dưới 24 giờ.
Phôi khỏe mạnh có tốc độ phân chia vào khoảng 18-20 giờ (2 phôi bào sau 24 giờ thụ tinh, 4 phôi bào sau dưới 48 giờ và 8 phôi bào hoặc hơn trước 72 giờ). Phôi phân chia chậm thường có khả năng làm tổ và sinh sống thấp hơn phôi phát triển bình thường. Vì vậy khi đánh giá lựa chọn phôi, chúng ta thường kết hợp các yếu tố: tốc độ phát triển phôi, hình thái của phôi như số lượng mảnh vụn, độ dày mỏng của màng trong suốt, độ phát triển của phôi bào, và số lượng nhân tế bào. Trong thực tiễn, phôi có 2 phôi bào thường thấy ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (có khi sớm hơn vào khoảng 20 giờ) và tồn tại cho đến 42 giờ.
Phôi có 4 phôi bào ở thời điểm 36-60 giờ sau thụ tinh. Phôi có 8 phôi bào ở thời điểm sau 54 giờ và thường trước 72 giờ (hình 1. Ở người, còn thấy phôi có 3-5 và 7 phôi bào đó là do phôi được quan sát khi đang phân chia. Một số nghiên cứu thấy rằng phôi nam phát triển nhanh hơn phôi nữ [11],[12].
Đối với trứng thụ tinh bình thường, nếu không phân chia trong vòng 24 giờ thường dẫn đến giảm khả năng sống, nhưng nếu phân chia nhanh quá (phân chia trong vòng 12 giờ) cũng không phải là dấu hiệu phôi tốt [13]. Phôi có 3 tiền nhân có thể phân chia với tốc độ nhanh hơn cho đến giai đoạn phôi dâu và sau đó thường ngừng phát triển. Những hợp tử này có thoi phân bào có 3 cực phân chia thành 3 phôi bào ở giai đoạn phân chia đầu tiên dẫn đến phôi có nhiều phôi bào hơn sau phân chia chứ không phải là phôi phát triển nhanh hơn.1: Sự phát triển của phôi ngày 2 và 3 (từ trái qua phải: phôi có 2 phôi bào, 4 phôi bào, 6 phôi bào và 8 phôi bào) (Nguồn: RRFC) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Ở người phôi dâu bắt đầu hình thành khi phôi ở giai đoạn 8 phôi bào và bắt đầu quá trình kết đặc (compaction).
Quá trình phôi kết đặc là một quá trình hình thành các liên kết chặt chẽ giữa các phôi bào, phần phôi bào tiếp xúc với nhau tăng lên và dàn phẳng ra tạo thành một khối không nhìn rõ các ranh giới giữa các phôi bào, bề mặt của phôi được phủ một lớp vi nhung mao (microvilli). Các phôi bào hoặc mảnh vụn tế bào mà không hình thành liên kết với các phôi bào khác sẽ bị đẩy ra ngoài khối phôi nhưng vẫn ở phía trong màng trong suốt cho tới khi phôi thoát màng [14]. Khi phôi bắt đầu kết đặc lại, các phôi bào tương tác với nhau làm các phôi bào không còn đặc tính toàn năng (totipotency) nữa và đây là sự khởi đầu cho sự sao mã DNA của phôi. Dưới kính hiển vi, hình thái của phôi dâu được thể hiện bằng sự tăng tiếp xúc giữa các phôi bào, nhưng ranh giới giữa các phôi bào còn nhìn thấy.
Khi quá trình kết đặc tăng dần, ranh giới giữa các phôi bào trở nên khó phân biệt do các phôi bào dàn phẳng ra và kết liền với nhau. Phôi dâu lúc ở giai đoạn này hoàn toàn trông như một tế bào có nhiều nhân (hình 1. Phôi dâu ở người có thể xuất hiện sớm khoảng 65 giờ sau thụ tinh, nhưng thường xuất hiện giữa ngày thứ 3 và thứ 4 sau thụ tinh [15].2: Phôi dâu ngày 4 (từ trái qua phải: các phôi bào bắt đầu kết đặc ở vài điểm nhưng vẫn nhìn rõ ranh giới giữa các phôi bào; các phôi bào kết đặc nhưng thấy ranh giới ở góc 9-12 giờ, có nhiều nhân; kết đặc hoàn toàn không rõ ranh giới các phôi bào) (Nguồn: RRFC) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sau khi phôi kết đặc, phôi bắt đầu lớn dần và tạo nang dịch bên trong (hình 1.3) tạo điều kiện cho sự phát triển để phôi bào biệt hóa thành nguyên bào lá nuôi và mầm phôi.
Quá trình tạo nang bao gồm sự tích lũy dịch vận chuyển bởi các nguyên bào lá nuôi. Để hoàn thành quá trình này, nguyên bào lá nuôi đầu tiên phụ thuộc vào sự hoàn thành quá trình phân cực tế bào và hình thành mối liên kết chặt giữa các nguyên bào lá nuôi. Sự liên kết và vị trí các phôi bào trong phôi kiểm soát sự phân cực tế bào.3: Phôi giai đoạn tạo nang/ cavitation (từ trái qua phải: xuất hiện khe dịch ở góc 2 giờ; các khe dịch lớn dần, nhiều lên, khe dịch chiếm dưới 1/2 thể tích phôi) (Nguồn: RRFC) Sự hình thành và phát triển phôi nang phụ thuộc vào một số yếu tố liên quan đến bệnh nhân như: chất lượng tinh trùng, tuổi của mẹ cũng như các yếu tố khác liên quan đến sự phát triển của phôi ở giai đoạn trước đó.