Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết và định lượng sappnin từ sâm lai châu panax vietnamensis var fuscidicua

Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết và định lượng saponin từ sâm Lai Châu Panax vietnamensis var fuscidicua, góp phần vào y học cổ truyền.

• Tác giả: Phạm Trung Thành
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Kim Dung
• Trường học: Trường Đại Học Lâm Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Kỹ Thuật Tách Chiết Và Định Lượng Saponin Từ Sâm Lai Châu
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về nhân sâm và saponin
• 1.1.1. Giới thiệu chung về nhân sâm
• 1.1.2. Tác dụng đặc trưng của nhân sâm
• 1.1.3. Cấu tạo nhóm hoạt chất ginsenosid
• 1.1.4. Giới thiệu chung về sâm Lai Châu và các tác dụng đặc trưng
• 1.2. Tách chiết và định lượng các saponin
• 1.2.1. Tách chiết saponin
• 1.2.2. Định lượng saponin
• 1.2.3. Giới thiệu về sắc ký lỏng hiệu năng cao - HLPC
• 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.4. Hóa chất, thiết bị
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Định lượng ginsenosid Rg1, Rd1, MR2 bằng HPLC
• 2.5.2. Xác định điều kiện tách chiết saponin tổng số từ mẫu củ và bột nhân sâm
• 2.5.3. Xác định điều kiện tách chiết saponin tổng số trong mẫu cao và viên nang
• 2.5.4. Xác định hàm lượng saponin tổng số
• 2.5.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký định lượng saponin
• 3.2. Xây dựng quy trình tách chiết saponin tổng số từ bột nhân sâm
• 3.3. Kết quả tách chiết và định lượng saponin từ sản phẩm chứa nhân sâm
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Sâm Lai Châu Nghiên Cứu Kỹ Thuật Chiết Xuất

Nhân sâm là dược liệu quý, sử dụng rộng rãi trên thế giới. Nhân sâm (Ginseng) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliacaea), hiện có 17 loài. Thành phần chính là saponin triterpen, quyết định tác dụng của nhân sâm. Sâm Lai Châu (sâm LC) là loại sâm đặc hữu của Việt Nam, có nhiều hoạt chất quý như sâm Ngọc Linh. Sâm Lai Châu có tác dụng dược lý như tăng lực, tăng trí nhớ, chống stress, bảo vệ hệ miễn dịch, chống viêm, chống lão hóa, tăng sức đề kháng, và điều trị tim mạch. Các nghiên cứu về sâm LC tập trung vào nhân giống và điều kiện sinh trưởng, trong khi ít nghiên cứu về điều kiện tách chiết và tối ưu hóa tách chiết saponin. Cần có nghiên cứu chuyên sâu về việc phát triển và khai thác tối đa tiềm năng của Sâm Lai Châu.

1.1. Giới Thiệu Về Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidicus

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidicus) là một loại sâm đặc hữu chỉ có ở Việt Nam, có nhiều hoạt chất quý tương tự như sâm Ngọc Linh. Sâm LC còn được gọi là Tam thất hoang Mường Tè, Tam thất đen. Sâm Lai Châu có vùng phân bố hẹp, được tìm thấy ở độ cao 1.200 m trên dãy núi Pu Si Lung và lân cận (Mường Tè và Tây Sìn Hồ, giáp biên giới với Trung Quốc) và dãy núi Pu Sam Cáp. Sâm Lai Châu có đặc điểm hình thái của sâm Ngọc Linh, củ có mắt đốt so le và có thể dùng tất cả bộ phận để làm dược liệu.

1.2. Tác Dụng Dược Lý Của Saponin Sâm Lai Châu

Sâm Lai Châu là một vị thuốc quý có các tác dụng dược lý như: tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ thể chống stress, bảo vệ và tác động lên hệ miễn dịch giúp chống viêm, bảo vệ tế bào chống lão hóa, tăng sức đề kháng cho cơ thể và điều trị bệnh tim mạch. Theo kết quả phân tích công bố (Đỗ Thị Hà, 2016) củ sâm Lai Châu có thành phần saponin phong phú với 52 loại hoạt chất quý hiếm tương tự như sâm Ngọc Linh [6]. Đáng chú ý nhất là hoạt chất Majonoside R2 - MR2, một hoạt chất mới đặc trưng, tạo ra giá trị lớn của các loài sâm Việt Nam cũng có trong sâm Lai Châu.

II. Vấn Đề Hiệu Quả Tách Chiết Saponin Sâm Lai Châu

Việc tách chiết saponin từ sâm Lai Châu hiện nay còn gặp nhiều thách thức. Các phương pháp tách chiết truyền thống như ngâm chiết và chiết Soxhlet tốn nhiều thời gian và dung môi. Các nghiên cứu hiện tại tập trung vào nhân giống và đánh giá điều kiện sinh trưởng, chưa có nhiều nghiên cứu về tối ưu hóa điều kiện tách chiết. Hơn nữa, chưa có tiêu chuẩn cụ thể để đánh giá chất lượng của sâm Lai Châu. Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu các điều kiện tách chiết và định lượng saponin để nâng cao hiệu quả và đảm bảo chất lượng sản phẩm từ sâm Lai Châu.

2.1. Các Phương Pháp Tách Chiết Saponin Truyền Thống

Các phương pháp tách chiết saponin truyền thống bao gồm ngâm chiết và chiết Soxhlet. Chiết Soxhlet là một kỹ thuật phổ biến để chiết xuất ginsenosides từ nhân sâm, mặc dù nó có nhược điểm là tốn thời gian và dung môi [67]. Wu và cộng sự đã nghiên cứu tác động của các yếu tố này trên P. Khảo sát các dung môi khác nhau MeOH, n-BuOH bão hòa nước và nước có 10% MeOH, kết quả cho thấy hiệu quả chiết xuất cao nhất của ginsenosides thu được khi sử dụng dung môi n-BuOH bão hòa nước.

2.2. Thiếu Nghiên Cứu Về Tối Ưu Hóa Tách Chiết Saponin Từ Sâm LC

Trong khi đó chưa có các đề tài nghiên cứu điều kiện tách chiết và tối ưu hoá điều kiện tách chiết saponin từ sâm LC, việc tách chiết cơ bản bằng methanol để tiến hành định lượng thành phần các hoạt chất. Các phương pháp tách chiết saponin chủ yếu là ngâm và chiết Soxhlet rất tốn thời gian đồng thời cần một lượng dung môi lớn. Các đề tài tài nghiên cứu về sâm LC tập trung vào việc nghiên cứu nhân giống và đánh giá điều kiện sinh trưởng và phát triển.

III. Kỹ Thuật Chiết Xuất Saponin Phương Pháp Siêu Âm Hồi Lưu

Nhiều kỹ thuật tiên tiến được áp dụng để chiết saponin từ sâm. Trong đó, phương pháp chiết xuất hồi lưu nhiệt sử dụng dung môi nóng và thu hồi bằng bay hơi. Chiết xuất siêu âm giúp tăng hiệu quả trích ly bằng cách phá vỡ tế bào thực vật. Tối ưu hóa các yếu tố như dung môi, nhiệt độ, thời gian, và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là chìa khóa để đạt hiệu suất cao nhất. Việc kết hợp các kỹ thuật hiện đại với tối ưu hóa quy trình có thể mang lại hiệu quả tách chiết saponin vượt trội, tiết kiệm thời gian và dung môi.

3.1. Ưu Điểm Của Chiết Xuất Hồi Lưu Nhiệt Để Tách Saponin

Chiết xuất hồi lưu nhiệt là một phương pháp chiết xuất rắn-lỏng, được coi là một phương pháp khả thi để chiết xuất saponin bằng cách sử dụng dung môi nóng. Trong quá trình hồi lưu nhiệt, quá trình chiết xuất saponin nhân sâm được thực hiện ở nhiệt độ cao và dung môi được thu hồi bằng cách bay hơi. Dung môi chiết xuất, thời gian và nhiệt độ là những yếu tố quan trọng trong phương pháp này ảnh hưởng đến hàm lượng saponin thu được từ nguyên liệu nhân sâm thô.

3.2. Ứng Dụng Chiết Xuất Siêu Âm Trong Tách Chiết Saponin

và cộng sự (2005) đã nghiên cứu quá trình chiết saponin từ mẫu bột nguyên liệu khô theo cách: cân 0,5 g mẫu bột khô cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 30 ml MeOH lắc đều trong 30 giây trước khi rung siêu âm 2 giờ tại nhiệt độ phòng, để trong bể siêu âm [63]. Sau khi ly tâm với tốc độ 2.000 vòng/5 phút, dung dịch được định mức vào bình 50 ml, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm trước khi đưa vào hệ thống HPLC.

IV. Tối Ưu Hóa Quy Trình Ảnh Hưởng Các Yếu Tố Tới Chiết Saponin

Hiệu quả chiết xuất saponin chịu ảnh hưởng lớn từ nhiều yếu tố. Nồng độ dung môi, kích thước nguyên liệu, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, và thời gian chiết đều đóng vai trò quan trọng. Nghiên cứu chỉ ra rằng ethanol 70% là dung môi tối ưu để chiết ginsenosides từ bột nhân sâm. Nhiệt độ cao (80°C) và thời gian chiết dài (6 giờ) cũng giúp tăng lượng ginsenoside thu được. Tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đạt hiệu suất chiết cao và thu được saponin chất lượng.

4.1. Ảnh Hưởng Của Dung Môi Đến Hiệu Suất Chiết Saponin

Kim và cộng sự đã nghiên cứu tác động của dung môi, thời gian và nhiệt độ của phương pháp đối với hàm lượng ginsenosides [43]. Trong nghiên cứu đó, các dung môi khác nhau (0%, 10%, 30%, 50%, 70% và 100% ethanol), nhiệt độ (40°C, 60°C và 80°C) và thời gian (2, 4, 6 và 8 giờ) đã được nghiên cứu để chiết xuất saponin nhân sâm. Kết quả chỉ ra rằng ethanol 70% là dung môi tối ưu để chiết xuất ginsenosides từ bột nhân sâm.

4.2. Vai Trò Của Nhiệt Độ Và Thời Gian Chiết Trong Tách Saponin

Ngoài ra, lượng ginsenoside trong chiết xuất tăng đáng kể sau 6 giờ khi nhiệt độ là 80°C. Nguyễn Đào Thanh Hương và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu điều kiện tách chiết saponin bằng phương pháp ngâm lạnh từ lá cây Costus pictus. Kết quả cho thấy các điều kiện tối ưu như sau: nồng độ dung môi ethanol 79%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/31 (g/ml) và thời gian chiết (60 giờ) cho kết quả đạt 7,62% saponin [12].

V. Ứng Dụng HPLC Định Lượng Saponin Sâm Lai Châu Chính Xác

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp quan trọng để định lượng saponin trong sâm Lai Châu. HPLC cho phép phân tích và định lượng chính xác các thành phần ginsenosid như Rg1, Rb1, và MR2, giúp đánh giá chất lượng sâm và các sản phẩm từ sâm. Việc xây dựng quy trình HPLC chuẩn hóa là cần thiết để đảm bảo độ tin cậy và so sánh kết quả giữa các nghiên cứu. Định lượng chính xác saponin giúp kiểm soát chất lượng và phát triển các sản phẩm có giá trị từ sâm Lai Châu.

5.1. Vai Trò Của HPLC Trong Phân Tích Saponin

Các chất Rb1, Rg1, MR2 là thành phần quan trọng của sâm LC, đặc biệt là MR2 là thành phần đặc hữu chỉ có ở sâm Việt Nam, giúp phân biệt sâm Việt Nam với các loài sâm khác trên thế giới. Bên cạnh đó hiện nay chưa có tiêu chuẩn cụ thể để đánh giá chất lượng của sâm Ngọc Linh. Vì vậy việc nghiên cứu các điều điện tách chiết và định lượng saponin trong sâm Ngọc Linh là vô cùng cần thiết

5.2. Xây Dựng Quy Trình HPLC Chuẩn Hóa Cho Sâm Lai Châu

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng được điều kiện định lượng ginsenosid Rg1, Rb1, MR2 từ sâm Lai Châu bằng HPLC. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất saponin từ sâm Lai Châu với các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết như: phương pháp chiết, thời gian, nhiệt độ, loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Đồng thời xây dựng điều kiện tách chiết và định lượng saponin từ thực phẩm bảo vệ sức khoẻ chứa nhân sâm dạng cao và viên nang.

VI. Triển Vọng Phát Triển Hướng Nghiên Cứu Kỹ Thuật Chiết Sâm LC

Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết saponin từ sâm Lai Châu mở ra nhiều triển vọng phát triển. Việc tối ưu hóa quy trình tách chiết và định lượng saponin giúp khai thác tối đa giá trị dược liệu quý của sâm. Cần có thêm các nghiên cứu về ứng dụng của saponin trong y học, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Phát triển các sản phẩm từ sâm Lai Châu có chất lượng cao và giá trị gia tăng là hướng đi tiềm năng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý của Việt Nam.

6.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Saponin Sâm Lai Châu

Sâm Lai Châu là một vị thuốc quý mà các tác dụng dược lý như: tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ thể chống stress, bảo vệ và tác động lên hệ miễn dịch giúp chống viêm, bảo vệ tế bào chống lão hóa, tăng sức đề kháng cho cơ thể và điều trị bệnh tim mạch… đã được nhiều nhà khoa học ngoài nước nghiên cứu [27, 32, 46, 50, 66]. Theo kết quả phân tích công bố (Đỗ Thị Hà, 2016) củ sâm Lai Châu có thành phần saponin phong phú với 52 loại hoạt chất quý hiếm tương tự như sâm Ngọc Linh [6].

6.2. Hướng Phát Triển Các Sản Phẩm Từ Sâm Lai Châu

Cần có thêm các nghiên cứu về ứng dụng của saponin trong y học, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Phát triển các sản phẩm từ sâm Lai Châu có chất lượng cao và giá trị gia tăng là hướng đi tiềm năng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý của Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhân sâm là một dược liệu quý giá được sử dụng rộng rãi trên thế giới, với 17 loài được ghi nhận trong chi Panax. Thành phần chính quyết định tác dụng của nhân sâm là các hợp chất saponin triterpen, đặc biệt là các ginsenosid như Rg1, Rb1 và MR2. Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidicus) là một loại sâm đặc hữu của Việt Nam, có nhiều hoạt chất quý hiếm tương tự như sâm Ngọc Linh, với hàm lượng saponin tổng số đạt khoảng 20-23% tùy theo tuổi cây và điều kiện sinh trưởng. Các hợp chất như Majonoside R2 (MR2) là đặc trưng chỉ có ở sâm Việt Nam, góp phần tạo nên giá trị dược lý cao của loại sâm này.

Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện tách chiết và định lượng saponin từ sâm Lai Châu một cách toàn diện. Các phương pháp truyền thống như chiết Soxhlet tốn nhiều thời gian và dung môi, chưa phù hợp với yêu cầu phân tích hiện đại. Do đó, nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình tách chiết và định lượng saponin tổng số, đồng thời xác định điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất các ginsenosid Rg1, Rb1 và MR2 từ sâm Lai Châu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu củ và bột sâm Lai Châu 5 năm tuổi, cùng các sản phẩm chứa nhân sâm như cao và viên nang, trong phạm vi thời gian năm 2023-2024 tại Hà Nội. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng và phát triển các sản phẩm dược liệu từ sâm Lai Châu, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về saponin triterpen và ginsenosid: Saponin trong nhân sâm gồm các loại có aglycon là protopanaxadiol, protopanaxatriol và acid oleanolic. Các ginsenosid như Rb1, Rg1, Rd và MR2 có cấu trúc hóa học đặc trưng, ảnh hưởng trực tiếp đến tác dụng dược lý của sâm.

• Mô hình chiết xuất saponin bằng siêu âm: Sóng siêu âm tạo ra các điểm tăng nhiệt độ cục bộ và bong bóng khí sinh nhiệt, phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng khả năng hòa tan và khuếch tán saponin vào dung môi.

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): HPLC pha đảo với cột C18 được sử dụng để phân tách và định lượng đồng thời các ginsenosid Rg1, Rb1 và MR2 dựa trên sự tương tác giữa pha tĩnh và pha động, với detector PDA quét bước sóng 203 nm.

Các khái niệm chính bao gồm: saponin tổng số, ginsenosid đặc trưng, chiết xuất siêu âm, gradient pha động trong HPLC, và tối ưu hóa quy trình bằng phương pháp thiết kế thực nghiệm Box-Behnken.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu nghiên cứu gồm củ sâm Lai Châu 5 năm tuổi, bột sâm, cao và viên nang chứa nhân sâm thu thập tại Hà Nội và do Viện Dược liệu cung cấp.

• Phương pháp phân tích:

  • Tách chiết saponin tổng số bằng phương pháp siêu âm với các biến số: loại dung môi, nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (DM/NL), kích thước nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian siêu âm.

  • Định lượng ginsenosid Rg1, Rb1 và MR2 bằng HPLC với cột Shimpack GIST C18 (250x4,6 mm, 5 μm), pha động acetonitrile - nước theo chương trình gradient, tốc độ dòng 1 mL/phút, detector PDA bước sóng 203 nm, nhiệt độ cột 30°C.

• Thiết kế thực nghiệm: Sử dụng phần mềm Design Expert 13 để thiết kế ma trận Box-Behnken gồm 17 thí nghiệm với 3 yếu tố chính (tỷ lệ DM/NL, nồng độ ethanol, thời gian siêu âm) ở 3 mức khác nhau nhằm tối ưu hóa hàm lượng saponin thu được.

• Xử lý số liệu: Kết quả được lặp lại 3 lần, xử lý bằng Excel và phân tích phương sai ANOVA để đánh giá độ phù hợp và ý nghĩa thống kê của mô hình.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất: Phương pháp chiết siêu âm cho hàm lượng saponin tổng số cao nhất đạt 14,05%, vượt trội so với các phương pháp đun hồi lưu (13,26%), ngâm lạnh (12,85%) và chiết nóng (13,78%).

2. Ảnh hưởng của dung môi: Ethanol 70% là dung môi tối ưu cho chiết xuất saponin với hàm lượng đạt 14,21%, cao hơn so với nước (11,38%) và các nồng độ ethanol khác (30%, 50%, 90%).

3. Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu: Kích thước hạt 0,5 - 1 mm cho hiệu quả chiết xuất cao nhất với 14,86%, so với 12,05% ở 2-5 mm và 10,36% ở 6-10 mm.

4. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (DM/NL): Tỷ lệ 20/1 (mL/g) cho hàm lượng saponin cao nhất 16,59%, trong khi tỷ lệ 10/1 và 40/1 lần lượt là 14,86% và 15,15%.

5. Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ 50°C tối ưu với hàm lượng saponin 16,62%, giảm xuống 14,98% khi tăng lên 60°C do phân hủy nhiệt.

6. Thời gian siêu âm: Thời gian 50 phút cho hàm lượng saponin 18,02%, tăng đáng kể so với 10 phút (13,86%), nhưng không tăng nhiều khi kéo dài đến 90 phút (18,11%).

7. Số lần chiết: Chiết 2 lần đạt 18,02%, không tăng đáng kể khi chiết thêm lần thứ 3 và 4.

8. Tối ưu hóa quy trình: Mô hình hồi quy cho thấy điều kiện tối ưu là tỷ lệ DM/NL 20,7/1 (mL/g), nồng độ ethanol 75,7% và thời gian siêu âm 46,5 phút, với hàm lượng saponin thu được thực nghiệm là 21,08 g/100 g, phù hợp với giá trị lý thuyết.

Thảo luận kết quả

Phương pháp chiết siêu âm được chứng minh là hiệu quả nhất nhờ tác động cơ học và nhiệt cục bộ làm phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng khả năng hòa tan saponin. Việc lựa chọn ethanol 70-75% làm dung môi phù hợp với tính phân cực của saponin, đồng thời giảm thiểu sự hòa tan các tạp chất không mong muốn. Kích thước nguyên liệu nhỏ giúp tăng diện tích tiếp xúc, nâng cao hiệu suất chiết.

Nhiệt độ và thời gian chiết được cân nhắc kỹ lưỡng để tránh phân hủy nhiệt các hợp chất hoạt tính. Kết quả tương đồng với các nghiên cứu trước đây về chiết xuất saponin từ các loài Panax khác và các dược liệu chứa saponin. Mô hình tối ưu hóa thực nghiệm cho phép xác định điều kiện chiết xuất hiệu quả nhất, tiết kiệm dung môi và thời gian, phù hợp cho ứng dụng công nghiệp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký HPLC thể hiện sự phân tách rõ ràng của các ginsenosid Rg1, Rb1 và MR2, cùng các bảng số liệu so sánh hàm lượng saponin theo từng điều kiện chiết xuất, giúp minh bạch và trực quan hóa kết quả.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng phương pháp chiết siêu âm với ethanol 75% để tách chiết saponin từ sâm Lai Châu nhằm nâng cao hiệu suất chiết và giảm thời gian, dung môi sử dụng. Thời gian chiết khoảng 45-50 phút, nhiệt độ 50°C, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20/1 (mL/g). Chủ thể thực hiện: các phòng thí nghiệm và nhà sản xuất dược liệu.

2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng saponin tổng số và các ginsenosid đặc trưng (Rg1, Rb1, MR2) cho sâm Lai Châu và các sản phẩm chứa nhân sâm, làm cơ sở kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm cuối cùng. Thời gian triển khai: 1-2 năm.

3. Phát triển quy trình định lượng saponin bằng HPLC với điều kiện sắc ký đã tối ưu, đảm bảo độ chính xác, độ lặp lại cao, phù hợp cho kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm dược liệu và thực phẩm chức năng.

4. Khuyến khích nghiên cứu mở rộng ứng dụng công nghệ siêu âm trong chiết xuất các hợp chất hoạt tính khác từ dược liệu quý, nhằm nâng cao hiệu quả và thân thiện môi trường.

5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ cho các cơ sở sản xuất dược liệu và thực phẩm chức năng để áp dụng quy trình chiết xuất và định lượng saponin, góp phần nâng cao giá trị sản phẩm và phát triển bền vững ngành dược liệu Việt Nam.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Dược học, Hóa dược: Nghiên cứu cung cấp cơ sở lý thuyết và thực nghiệm về chiết xuất, định lượng saponin từ sâm Lai Châu, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược liệu và thực phẩm chức năng: Áp dụng quy trình chiết xuất và kiểm soát chất lượng saponin để nâng cao chất lượng sản phẩm, đảm bảo tiêu chuẩn và tăng tính cạnh tranh trên thị trường.

3. Cơ quan quản lý chất lượng và tiêu chuẩn dược liệu: Tham khảo để xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật, quy trình kiểm nghiệm saponin trong nguyên liệu và sản phẩm chứa nhân sâm.

4. Các tổ chức bảo tồn và phát triển nguồn gen dược liệu quý hiếm: Hiểu rõ thành phần hoạt chất và phương pháp phân tích giúp đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu, từ đó có chiến lược bảo tồn và phát triển bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn phương pháp chiết siêu âm để tách saponin?
   Phương pháp chiết siêu âm giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng khả năng hòa tan saponin vào dung môi, rút ngắn thời gian chiết và giảm lượng dung môi cần thiết so với các phương pháp truyền thống như Soxhlet.

2. Dung môi ethanol 70-75% có ưu điểm gì trong chiết xuất saponin?
   Ethanol 70-75% có độ phân cực phù hợp để hòa tan saponin, đồng thời giảm hòa tan tạp chất không mong muốn, giúp tăng hiệu suất chiết và chất lượng dịch chiết.

3. Làm thế nào để định lượng chính xác các ginsenosid Rg1, Rb1 và MR2?
   Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột C18, pha động acetonitrile - nước theo chương trình gradient, detector PDA bước sóng 203 nm, cho phép phân tách và định lượng đồng thời các ginsenosid với độ chính xác cao.

4. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả chiết xuất như thế nào?
   Kích thước nguyên liệu nhỏ (0,5 - 1 mm) tăng diện tích tiếp xúc với dung môi, giúp chiết xuất saponin hiệu quả hơn so với kích thước lớn hơn do dung môi dễ thẩm thấu và hòa tan các hợp chất hơn.

5. Có thể áp dụng quy trình này cho các loại sâm khác không?
   Quy trình chiết xuất và định lượng có thể điều chỉnh phù hợp với các loại sâm khác có thành phần saponin tương tự, tuy nhiên cần tối ưu lại các điều kiện chiết xuất và sắc ký để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất saponin tổng số từ sâm Lai Châu bằng phương pháp siêu âm với dung môi ethanol 75%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20/1, thời gian 46,5 phút và nhiệt độ 50°C, đạt hàm lượng saponin 21,08 g/100 g.

• Phương pháp HPLC với cột C18 và chương trình gradient pha động acetonitrile - nước được tối ưu để định lượng đồng thời các ginsenosid Rg1, Rb1 và MR2 trong mẫu sâm và sản phẩm chứa nhân sâm.

• Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện cơ sở khoa học cho việc kiểm soát chất lượng và phát triển sản phẩm dược liệu từ sâm Lai Châu, đồng thời bảo tồn nguồn gen quý hiếm của Việt Nam.

• Các bước tiếp theo bao gồm ứng dụng quy trình vào sản xuất thực tế, xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật và đào tạo chuyển giao công nghệ cho các cơ sở sản xuất.

• Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp tiếp tục phát triển các phương pháp chiết xuất hiện đại, thân thiện môi trường nhằm nâng cao giá trị và hiệu quả sử dụng dược liệu quý.

Hành động ngay: Áp dụng quy trình chiết xuất và định lượng saponin đã được tối ưu để nâng cao chất lượng sản phẩm và thúc đẩy phát triển ngành dược liệu Việt Nam bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về nhân sâm và saponin 1. Giới thiệu chung về nhân sâm Nhân sâm (Ginseng) thuộc họ Ngũ gia bì (Araliacaea). Họ Ngũ gia bì bao gồm khoảng 700 loài thực vật, được chia thành 70 chi, một trong số đó là chi Panax, cho đến nay các nhà khoa học đã cập nhật 17 loài sâm trên thế giới (bảng 1.

Theo tác giả Sharma, S. K (2009) [55] trong số các loài thuộc chi Panax, ba loài P. quinquefolius, được trồng rộng rãi để sản xuất thương mại. Môi trường sống của các loài Panax được phân loại thành ba khu vực: Đông Bắc Á, Tây Trung Quốc và Đông Bắc Mỹ.

Panax ginseng sống ở bán đảo Triều Tiên và Đông Bắc Trung Quốc. Panax japonicus và P. notoginseng được tìm thấy ở Nhật Bản và Tây Trung Quốc, tương ứng. quinquefolius mọc tự nhiên ở miền đông Bắc Mỹ.

Bộ phận thường sử dụng là rễ củ đã được phơi hay sấy khô của Nhân sâm. Hầu như tất cả các loài trong chi nhân sâm đều được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền ở nhiều nước Á-Âu; đặc biệt là ở các nước Đông - Bắc Á. Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thành phần khác nhau, tuy nhiên saponin (ginsenosid), chính là thành phần quyết định tác dụng của nhân sâm, cũng là chất có khả năng tạo ra những ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe. Danh sách các loài sâm trên thế giới STT Tên loài Tên thường gọi 1 P.

ginseng Korean ginseng (Sâm Hàn Quốc) 2 P. quinquefolius American ginseng (Sâm Mỹ) 3 P. notoginseng Chinese ginseng (Sâm Trung Quốc) 4 P. japonicas Japanese ginseng (Sâm Nhật Bản) 5 P.

vietnamensis Vietnamese ginseng (Sâm Ngọc Linh) 6 P. bipinnatifidus Feather-leaf bamboo ginseng 7 P. stipuleanatus Pingpien ginseng 8 P. omeiensis Omei ginseng 9 P.

pseudoginseng Himalayan ginseng 10 P. trifolius Dwarf ginseng 14 P. wangianus Narrow-leaved pseudoginseng 16 P. zingiberensis Ginger ginseng (Nguồn: Byong - Kyu Shin và cộng sự, 2015) [25] Hình 1.

Thân rễ của sâm Ngọc Linh (phải), sâm Trung Quốc, sâm Hàn Quốc (trái) 5 1. Tác dụng đặc trưng của nhân sâm Bên cạnh các loại dược liệu quý như: Cam thảo, bình vôi, nấm lim xanh, đông trùng hạ thảo… chứa hàm lượng các hợp chất có giá trị [5, 30, 38]. Nhân sâm (Ginseng) là một vị thuốc quý mà các tác dụng dược lý tốt cho sức khỏe con người. Thành phần hoạt chất của ginsenosid trong nhân sâm có tác dụng đặc trưng khác nhau được tóm tắt trong bảng 1.

Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid Ginsenosid Tác dụng đặc trưng Ro Phân giải rượu, chống viêm gan và phục hồi hư tổn gan Là saponin có thể kiềm chế hệ thống thần kinh trung ương Rb1 làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đường, phòng chống xơ cứng Rb2 gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan Làm dịu cơn đau, tăng tốc độ tổng hợp protein Rc Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư, ngăn cản hoặc hạn chế sự phát triển của ung thư vú Rd Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thượng thận Re Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy Rf Làm dịu cơn đau trong các tế bào não Khả năng gây hưng phấn thần kinh trung ương, chống và phục Rg1 hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt protease Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng khả Rg2 năng lưu thông máu lên não, kéo dài thời gian sống của tế bào Rh1 Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu Rh2 Ức chế các tế bào ung thư, hạn chế khối u phát triển 6 1. Cấu tạo nhóm hoạt chất ginsenosid Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen. Khi thuỷ phân các saponin này thu được 3 loại sapogenin là: acid oleanolic, protopanaxadiol và protopanaxatriol. Các saponin trong nhân sâm gọi là ginsenosid (là từ ghép của Nhân sâm (ginseng) + glicozit (glycosid)).

Các ginsenosid được phân loại dựa vào cấu trúc của ba sapogenin trên. Hầu hết các ginsenosid có cấu trúc với bộ khung gồm bốn vòng steroid cố định. Nhiều gốc đường khác nhau (ví dụ như glucose, rhamnose, xylose và arabinose) gắn ở vị trí C-3, C-6 hoặc C-20. Cấu trúc các Saponin được minh họa trong hình 1.

Cấu trúc saponin có aglycon là protopanaxadiol (A) và protopanaxatriol (B) [26] Bảng 1. Các saponin có aglycon là protopanaxadiol R1= R2 = H: 20(S) - protopanaxadiol Tên R1 R2 Ginsenosid-Rb1 G1c2-G1c G1c6-G1c Ginsenosid-Rb2 G1c2-G1c Glc6-Ara(p) Ginsenosid-Rb3 G1c2-G1c Glc6-Xyl Ginsenosid-Rc G1c2-G1c Glc6-Ara(f) Ginsenosid-Rd G1c2-G1c Glc Ginsenosid Rh1 Glc2-Rha Glc glc = glucose; ara(p) = arabinose trong dạng pyranose; ara(f) = arabinose trong dạng furanose 7 Bảng 1. Các saponin có aglycon là protopanaxatriol R1 = R2 = H: 20(S) - protopanaxatriol Tên R1 R2 Ginsenosid-Re Glc2-Rha G1c Ginsenosid-Rf G1c2-G1c H Ginsenosid Rgl Glc Glc Ginsenosid-Rh1 G1c H Ginsenosid-Rg1 G1c2-G1c Glc6-Xyl rha = rhamnose Hình 1. Cấu trúc saponin với aglycon là acid oleanolic [26] Bảng 1.

Saponin với aglycon là acid oleanolic Tên R1 R2 Ginsenosid R0 Glc A2- Glc G1c glc = glucose 1. Giới thiệu chung về sâm Lai Châu và các tác dụng đặc trưng Sâm Lai Châu (sâm LC - Panax vietnamensis var. fuscidicus) - là một loại sâm đặc hữu mà Việt Nam hiện đang là quốc gia duy nhất trên thế giới sở hữu, có nhiều hoạt chất và tác dụng quý như sâm Ngọc Linh (P. Đây là một thứ (bậc phân loại dưới loài) của sâm Ngọc Linh, còn được gọi là Tam thất hoang Mường Tè, Tam thất đen.

Chúng có vùng phân bố hẹp, được tìm thấy ở độ cao 1.200 m trên dãy núi Pu Si Lung và lân cận (Mường Tè và Tây Sìn Hồ, giáp biên giới với Trung Quốc) và dãy núi Pu Sam Cáp 8 nằm giữa các huyện Sìn Hồ và Tam Đường với thành phố Lai Châu, nhiệt độ trung bình từ 18 - 20C [21]. Sâm Lai Châu có đặc điểm hình thái của sâm Ngọc Linh, củ có mắt đốt so le. Tất cả các bộ phận của cây đều có thể sử dụng làm thuốc dược liệu. Sâm Lai Châu là một vị thuốc quý mà các tác dụng dược lý như: tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ thể chống stress, bảo vệ và tác động lên hệ miễn dịch giúp chống viêm, bảo vệ tế bào chống lão hóa, tăng sức đề kháng cho cơ thể và điều trị bệnh tim mạch… đã được nhiều nhà khoa học ngoài nước nghiên cứu [27, 32, 46, 50, 66].

Theo kết quả phân tích công bố (Đỗ Thị Hà, 2016) củ sâm Lai Châu có thành phần saponin phong phú với 52 loại hoạt chất quý hiếm tương tự như sâm Ngọc Linh [6]. Đáng chú ý nhất là hoạt chất Majonoside R2 - MR2, một hoạt chất mới đặc trưng, tạo ra giá trị lớn của các loài sâm Việt Nam cũng có trong sâm Lai Châu. Hiện nay, đã phân lập và xác định cấu trúc 06 saponin đặc trưng từ thân rễ sâm Lai Châu. Các hợp chất này đều là các saponin triterpenoid có cấu trúc hóa học đặc trưng cho chi Panax như: khung ocotillol (majonosid R2), khung protopanaxadiol (ginsenoside Rd và ginsenosid Rb1), khung protopanaxatriol (ginsenoside Re và ginsenosid Rg1), và khung oleanolic (silphiosid E).

Nhóm tác giả Trần Thị Kim Hương và cộng sự, (2019) đã tiến hành định lượng saponin bằng phương pháp cân cho thấy hàm lượng saponin tổng số trong các mẫu sâm Lai Châu đạt khoảng 20% [21]. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng saponin tổng số của sâm LC tăng dần khi tăng số tuổi, đồng thời mẫu thu được ở tự nhiên có hàm lượng saponin tổng số (trung bình khoảng 23%) cao hơn mẫu trồng (trung bình khoảng 18,47%). Các kết quả này có giá trị hàm lượng tương đương với kết quả công bố của sâm Ngọc Linh (Đỗ Thị Hà và cộng sự, 2016) [6]. Hình ảnh thân rễ của sâm Lai Châu 1.

Tách chiết và định lượng các saponin 1. Tách chiết saponin Hiện nay các phương pháp chiết xuất Soxhlet, chiết xuất hồi lưu nhiệt, chiết xuất siêu âm, chiết pha rắn, chiết xuất có hỗ trợ vi sóng, chiết xuất có hỗ trợ enzyme. đã được sử dụng để tách chiết saponin từ các loài Panax (P. ginseng…) ở cả dạng nguyên gốc (củ, lá, hoa) lẫn các chế phẩm chứa nhân sâm (Wan và cộng sự, 2012; Yang và cộng sự, 2021) [64, 69].

Năm 1879, Franz von Soxhlet đã phát triển một hệ thống chiết xuất mới cho phép chiết xuất các hợp chất từ vật liệu rắn bằng cách thẩm thấu nhiều lần với dung môi hữu cơ trong quá trình hồi lưu [36]. Chiết xuất Soxhlet đã trở thành một kỹ thuật phổ biến để chiết xuất ginsenosides từ nhân sâm, mặc dù nó có nhược điểm là tốn thời gian và dung môi [67]. Các yếu tố dung môi, thời gian chiết xuất và quá trình xử lý mẫu có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng ginsenoside. Wu và cộng sự đã nghiên cứu tác động của các yếu tố này trên P.

Khảo sát các dung môi khác nhau MeOH, n-BuOH bão hòa 10 nước và nước có 10% MeOH, kết quả cho thấy hiệu quả chiết xuất cao nhất của ginsenosides thu được khi sử dụng dung môi n-BuOH bão hòa nước. Về thời gian chiết xuất, tổng lượng saponin nhân sâm tăng tỷ lệ thuận với thời gian chiết xuất tăng (1, 2 và 8 giờ). Sự khác biệt trong quá trình xử lý mẫu cũng ảnh hưởng đến hàm lượng saponin. Wang và cộng sự đã nghiên cứu rễ nhân sâm Mỹ tươi và đã hấp (xử lý nhiệt ở 120°C trong 1 giờ) bằng phương pháp chiết Soxhlet.

Tổng hàm lượng ginsenoside trong nhân sâm Mỹ thu được từ nguyên liệu tươi (8,0%) cao hơn hàm lượng thu được từ nguyên liệu đã hấp (5,9 %) [65]. Chiết xuất hồi lưu nhiệt là một phương pháp chiết xuất rắn-lỏng, được coi là một phương pháp khả thi để chiết xuất saponin bằng cách sử dụng dung môi nóng. Trong quá trình hồi lưu nhiệt, quá trình chiết xuất saponin nhân sâm được thực hiện ở nhiệt độ cao và dung môi được thu hồi bằng cách bay hơi. Dung môi chiết xuất, thời gian và nhiệt độ là những yếu tố quan trọng trong phương pháp này ảnh hưởng đến hàm lượng saponin thu được từ nguyên liệu nhân sâm thô.

Kim và cộng sự đã nghiên cứu tác động của dung môi, thời gian và nhiệt độ của phương pháp đối với hàm lượng ginsenosides [43]. Trong nghiên cứu đó, các dung môi khác nhau (0%, 10%, 30%, 50%, 70% và 100% ethanol), nhiệt độ (40°C, 60°C và 80°C) và thời gian (2, 4, 6 và 8 giờ) đã được nghiên cứu để chiết xuất saponin nhân sâm. Kết quả chỉ ra rằng ethanol 70% là dung môi tối ưu để chiết xuất ginsenosides từ bột nhân sâm. Ngoài ra, lượng ginsenoside trong chiết xuất tăng đáng kể sau 6 giờ khi nhiệt độ là 80°C.