Nghiên Cứu Kỹ Thuật RT-PER Đạt Hiệu Quả Tại Hà Nội (2015-2016)

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta trên chuột tại Hà Nội năm 2015-2016, góp phần nâng cao nhận thức về dịch bệnh.

• Người hướng dẫn: TS. Võ Thị Thương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật
• Đề tài: Nghiên Cứu Kỹ Thuật RT-PER Đạt Hiệu Quả Tại Hà Nội
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2015 - 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược lịch sử phát hiện vi rút Hanta
• 1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh do vi rút Hanta
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Tối ưu hóa quy trình RT-PCR phát hiện vi rút Hanta
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân loại chuột thu thập tại một số địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Phân bố chuột theo thời gian thu thập
• 3.3. Kết quả phát hiện vi rút Hanta theo loại chuột, năm 2015 - 2017
• 3.4. Độ tương đồng nucleotide và axit amin của chủng lưu
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Bàn luận về kết quả phát hiện vi rút Hanta
• 4.2. Ý nghĩa kết quả nghiên cứu
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Kỹ Thuật RT PER Phát Hiện Virus Hanta

Nghiên cứu này tập trung vào ứng dụng kỹ thuật RT-PER để phát hiện virus Hanta tại Hà Nội trong giai đoạn 2015-2016. Virus Hanta, thuộc họ Bunyaviridae, có khả năng gây bệnh cho người nhưng không gây bệnh cho các loài gặm nhấm. Bệnh lây truyền qua đường hô hấp, do hít phải bụi từ chất thải của động vật gặm nhấm nhiễm virus. Nghiên cứu nhằm mục tiêu giám sát virus Hanta trên chuột, từ đó đưa ra các biện pháp phòng bệnh chủ động. Theo tài liệu, tỷ lệ chuột có kháng thể dương tính với virus Hanta ở Việt Nam dao động từ 14-34%. Cụ thể, tại khu vực phía bắc, huyết thanh dương tính với virus Hanta, chủ yếu là virus Seoul, đã được báo cáo tại Hải Phòng, Hà Nam và Thanh Hóa trên cả mẫu chuột và mẫu huyết thanh người. Nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh do virus Hanta gây ra tại Hà Nội.

1.1. Giới Thiệu Virus Hanta và Các Bệnh Liên Quan

Virus Hanta gây ra hai thể bệnh chính: Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) và Hội chứng phổi do virus Hanta (HPS). Mỗi loài virus Hanta lây truyền qua một vật chủ nhất định và phân bố theo vùng địa lý khác nhau, ảnh hưởng đến biểu hiện lâm sàng của bệnh. Virus Seoul lây truyền qua chuột cống (Rattus norvegicus) và gây ra HFRS. Tại châu Á, virus Hantaan và virus Seoul là tác nhân chính gây ra HFRS. Nghiên cứu về RT-PER có vai trò quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả RT-PER và phát hiện sớm virus Hanta để phòng ngừa bệnh.

1.2. Tầm Quan Trọng của Nghiên Cứu RT PER tại Hà Nội

Việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật RT-PER để phát hiện nhanh chóng và chính xác virus Hanta là rất quan trọng. Điều này giúp giám sát sự lây lan của virus trên chuột, từ đó đưa ra các biện pháp phòng bệnh chủ động và hiệu quả. Nghiên cứu này tập trung vào Hà Nội, nơi có tỷ lệ dân cư có kháng thể dương tính với virus Hanta là 5,4%. Bên cạnh đó, Hà Nội đã ghi nhận các ca bệnh mắc HFRS. Kinh nghiệm RT-PER và kết quả nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng chiến lược phòng chống dịch bệnh hiệu quả.

II. Thách Thức Phát Hiện Virus Hanta Bằng Kỹ Thuật RT PER

Việc phát hiện virus Hanta bằng kỹ thuật RT-PER đối mặt với nhiều thách thức. Các chủng virus Hanta có sự đa dạng di truyền cao, đòi hỏi thiết kế mồi (primer) và probe phù hợp để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Bên cạnh đó, nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm (phổi chuột) có thể rất thấp, ảnh hưởng đến khả năng phát hiện. Nghiên cứu cần tối ưu hóa quy trình RT-PER để khắc phục những hạn chế này. So sánh RT-PER với các kỹ thuật khác là một phần quan trọng để đánh giá ưu và nhược điểm của phương pháp này. Sự thành công của nghiên cứu phụ thuộc vào việc vượt qua các thách thức kỹ thuật và đảm bảo độ tin cậy của kết quả.

2.1. Đa Dạng Di Truyền của Virus Hanta và Thiết Kế Mồi RT PER

Sự đa dạng di truyền của virus Hanta đặt ra yêu cầu cao trong việc thiết kế mồi và probe cho kỹ thuật RT-PER. Mồi và probe cần bao phủ các vùng bảo tồn của bộ gen virus để đảm bảo phát hiện được nhiều chủng virus khác nhau. Các biến thể di truyền có thể dẫn đến kết quả âm tính giả nếu mồi và probe không khớp hoàn toàn với trình tự virus. Do đó, việc lựa chọn và đánh giá cẩn thận mồi và probe là yếu tố then chốt để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm RT-PER.

2.2. Nồng Độ Virus Hanta Thấp trong Mẫu Bệnh Phẩm

Nồng độ virus Hanta trong mẫu bệnh phẩm (phổi chuột) thường rất thấp, đặc biệt trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng. Điều này gây khó khăn cho việc phát hiện virus bằng kỹ thuật RT-PER. Để khắc phục vấn đề này, cần tối ưu hóa các bước của quy trình RT-PER, bao gồm chiết tách RNA, phiên mã ngược và khuếch đại PCR, để tăng độ nhạy của xét nghiệm. Các phương pháp tiền xử lý mẫu, như cô đặc virus, cũng có thể được sử dụng để tăng nồng độ virus trước khi thực hiện RT-PER.

III. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Quy Trình RT PER Phát Hiện Virus

Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa quy trình RT-PER để phát hiện virus Hanta. Các yếu tố quan trọng cần tối ưu hóa bao gồm nhiệt độ gắn mồi, thời gian kéo dài, số chu kỳ PCR và nồng độ các thành phần phản ứng. Việc sử dụng các chuẩn dương tính và âm tính trong quá trình tối ưu hóa giúp đảm bảo độ chính xác của kết quả. Sau khi tối ưu hóa, quy trình RT-PER được đánh giá về độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác và độ lặp lại. Mục tiêu là xây dựng một quy trình RT-PER hiệu quả, đáng tin cậy và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

3.1. Tối Ưu Hóa Các Thông Số Kỹ Thuật của Phản Ứng RT PER

Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của phản ứng RT-PER là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Các thông số cần tối ưu hóa bao gồm nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature), thời gian kéo dài (extension time), số chu kỳ PCR (PCR cycle number) và nồng độ các thành phần phản ứng (ví dụ: enzyme polymerase, dNTPs, MgCl2). Việc sử dụng thiết kế thí nghiệm (design of experiment - DoE) có thể giúp xác định các thông số tối ưu một cách hiệu quả. Các thí nghiệm nên được thực hiện với các chuẩn dương tính và âm tính để đánh giá ảnh hưởng của từng thông số đến kết quả RT-PER.

3.2. Đánh Giá Độ Nhạy Độ Đặc Hiệu và Độ Chính Xác của RT PER

Sau khi tối ưu hóa, quy trình RT-PER cần được đánh giá về độ nhạy (sensitivity), độ đặc hiệu (specificity) và độ chính xác (accuracy). Độ nhạy là khả năng của xét nghiệm để phát hiện virus ở nồng độ thấp. Độ đặc hiệu là khả năng của xét nghiệm để phân biệt virus Hanta với các virus khác. Độ chính xác là khả năng của xét nghiệm để cho kết quả đúng trong một loạt các lần thử nghiệm. Các chuẩn dương tính và âm tính, cũng như các mẫu bệnh phẩm đã được xác định trước, nên được sử dụng để đánh giá các thông số này. Đánh giá hiệu quả RT-PER một cách toàn diện sẽ đảm bảo độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.

IV. Ứng Dụng Kỹ Thuật RT PER Phát Hiện Virus Hanta Trên Chuột Hà Nội

Sau khi tối ưu hóa, kỹ thuật RT-PER được ứng dụng để phát hiện virus Hanta trong mẫu phổi chuột thu thập tại một số địa điểm ở Hà Nội trong năm 2015-2016. Các mẫu phổi chuột được xử lý và RNA được chiết tách. Sau đó, RNA được sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng RT-PER. Kết quả RT-PER được phân tích để xác định sự hiện diện của virus Hanta trong mẫu. Kết quả nghiên cứu RT-PER cung cấp thông tin về tỷ lệ nhiễm virus Hanta trên chuột tại Hà Nội, cũng như sự phân bố của virus theo địa điểm và thời gian.

4.1. Thu Thập và Xử Lý Mẫu Phổi Chuột tại Hà Nội 2015 2016

Mẫu phổi chuột được thu thập tại một số địa điểm ở Hà Nội trong giai đoạn 2015-2016. Các địa điểm thu thập mẫu cần được lựa chọn dựa trên yếu tố nguy cơ, ví dụ: khu vực có mật độ chuột cao, khu vực gần khu dân cư. Sau khi thu thập, mẫu phổi chuột cần được xử lý để chiết tách RNA. Quy trình chiết tách RNA cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng và số lượng RNA thu được, ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy của xét nghiệm RT-PER.

4.2. Phân Tích Kết Quả RT PER và Xác Định Sự Phân Bố Virus

Kết quả RT-PER được phân tích để xác định sự hiện diện của virus Hanta trong mẫu phổi chuột. Các mẫu được coi là dương tính nếu có tín hiệu RT-PER vượt quá ngưỡng cho phép. Thông tin về các mẫu dương tính được sử dụng để xác định tỷ lệ nhiễm virus Hanta trên chuột tại Hà Nội, cũng như sự phân bố của virus theo địa điểm và thời gian. Dữ liệu RT-PER này có thể được sử dụng để xây dựng bản đồ dịch tễ học và đưa ra các khuyến nghị về phòng chống dịch bệnh.

V. Kết Luận và Triển Vọng Nghiên Cứu Kỹ Thuật RT PER

Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu hóa và ứng dụng kỹ thuật RT-PER để phát hiện virus Hanta trên chuột tại Hà Nội. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về tình hình lưu hành của virus Hanta và giúp định hướng các biện pháp phòng chống dịch bệnh. Trong tương lai, nghiên cứu có thể được mở rộng để bao gồm nhiều địa điểm và chủng virus Hanta khác nhau. Giải pháp RT-PER này có thể được sử dụng để giám sát virus Hanta trên các loài gặm nhấm khác, cũng như trên mẫu bệnh phẩm người.

5.1. Ý Nghĩa Thực Tiễn của Nghiên Cứu RT PER Phát Hiện Hanta

Nghiên cứu này cung cấp một công cụ hiệu quả để giám sát sự lây lan của virus Hanta trong quần thể chuột tại Hà Nội. Thông tin này rất quan trọng để đánh giá nguy cơ lây nhiễm cho người và đưa ra các biện pháp phòng ngừa phù hợp. Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để xây dựng các chương trình phòng chống dịch bệnh dựa trên bằng chứng, nhằm giảm thiểu tác động của virus Hanta đến sức khỏe cộng đồng.

5.2. Hướng Phát Triển và Ứng Dụng Kỹ Thuật RT PER Trong Tương Lai

Kỹ thuật RT-PER có tiềm năng lớn trong việc phát hiện và giám sát các bệnh truyền nhiễm do virus gây ra. Trong tương lai, kỹ thuật này có thể được cải tiến để phát hiện nhiều loại virus cùng một lúc (multiplex RT-PCR), giảm thời gian xét nghiệm và chi phí. Ngoài ra, kỹ thuật RT-PER có thể được sử dụng để phân tích các biến thể di truyền của virus, giúp theo dõi sự tiến hóa của virus và đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệp. Triển khai RT-PER rộng rãi sẽ góp phần nâng cao năng lực phòng chống dịch bệnh của Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Virus Hanta là tác nhân truyền nhiễm nguy hiểm từ động vật sang người, gây ra hai thể bệnh cảnh cấp tính nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong đáng báo động từ 35% đến 50%, bao gồm Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) và Hội chứng phổi do virus Hanta (HPS). Trên phạm vi toàn cầu, hàng chục nghìn ca mắc được ghi nhận mỗi năm, trong đó khu vực Đông Á chiếm tới 90% tổng số ca bệnh HFRS. Tại Việt Nam, các điều tra dịch tễ học huyết thanh trước đây đã xác nhận sự lưu hành của virus Hanta trên quần thể động vật gặm nhấm với tỷ lệ dương tính dao động trong khoảng từ 14% đến 34%. Đáng chú ý, tỷ lệ cư dân đô thị mang kháng thể kháng virus Hanta tại Hà Nội đã từng được ghi nhận ở mức 5,4%, đồng thời các ca bệnh lâm sàng đơn lẻ cũng đã xuất hiện tại các trung tâm y tế lớn.

Mặc dù nguy cơ lây nhiễm trong cộng đồng luôn hiện hữu, việc chẩn đoán sớm virus Hanta gặp vô vàn thách thức do biểu hiện lâm sàng ban đầu thường không điển hình, dễ nhầm lẫn với sốt xuất huyết Dengue, nhiễm Leptospira hoặc nhiễm trùng huyết. Nhằm giải quyết triệt để vấn đề giám sát chủ động mầm bệnh từ ổ chứa tự nhiên, đề tài luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm đã tập trung vào hai mục tiêu cốt lõi: tối ưu hóa quy trình kỹ thuật Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) phục vụ phát hiện nhanh hệ gen virus Hanta, và ứng dụng quy trình này để sàng lọc, đánh giá sự lưu hành của virus Hanta trên các mẫu mô phổi chuột thu thập tại các điểm trọng điểm thuộc địa bàn thành phố Hà Nội trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2016. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc cung cấp một công cụ sinh học phân tử chuẩn xác, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán dịch tễ xuống dưới 24 giờ và hỗ trợ đắc lực cho mạng lưới y tế dự phòng kiểm soát nguồn truyền nhiễm trước khi dịch bệnh bùng phát.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết dịch tễ học bệnh truyền lây giữa động vật và người (Zoonosis), kết hợp với lý thuyết sinh học phân tử về cấu trúc vi sinh vật thuộc họ Bunyaviridae. Cơ chế ổ chứa tự nhiên chỉ ra rằng các loài động vật gặm nhấm mang virus mạn tính không biểu hiện triệu chứng bệnh lý nhưng liên tục bài xuất lượng lớn hạt virus qua nước tiểu, phân và nước bọt ra môi trường ngoài. Con người nhiễm bệnh chủ yếu qua con đường hô hấp khi hít phải các hạt khí dung chứa virus phát tán từ chất thải của vật chủ.

Cơ sở phân tử của nghiên cứu dựa trên đặc điểm cấu trúc hệ gen ARN sợi đơn âm phân đoạn của virus Hanta. Hạt virus có dạng hình cầu hoặc bầu dục với kích thước đường kính từ 80 nm đến 120 nm. Hệ gen bao gồm ba đoạn ARN riêng biệt: đoạn lớn (L) mã hóa enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (RdRp) có khối lượng phân tử khoảng 250 kDa đến 280 kDa chịu trách nhiệm sao chép và phiên mã; đoạn trung bình (M) mã hóa phức hợp glycoprotein vỏ Gn và Gc định vị trên màng lipid kép giúp virus gắn kết vào thụ thể tế bào chủ; và đoạn nhỏ (S) mã hóa protein nucleocapsid (N) giữ vai trò đóng gói vật liệu di truyền. Ba khái niệm chuyên ngành then chốt được áp dụng xuyên suốt luận văn gồm: Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS), Hội chứng phổi do virus Hanta (HPS), và kỹ thuật khuếch đại chuỗi sao chép ngược (RT-PCR) đặc hiệu cho đoạn gen M nhằm phân loại các chủng virus lưu hành.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của luận văn bắt nguồn từ tập hợp các mẫu mô phổi động vật gặm nhấm thu thập thực địa tại nhiều điểm đại diện ở Hà Nội (khu dân cư, chợ dân sinh, kho trung chuyển hàng hóa). Mô phổi chuột được lựa chọn làm đối tượng xét nghiệm chính vì đây là cơ quan đích lưu giữ tải lượng virus Hanta cao nhất trong cơ thể động vật mang mầm bệnh. Cỡ mẫu nghiên cứu được thu thập ngẫu nhiên theo phương pháp đặt bẫy sống liên tục trong các đợt giám sát thực địa từ năm 2015 đến năm 2016, mở rộng theo dõi đến năm 2017. Các loài chuột thu thập được phân loại hình thái học chi tiết, bao gồm chuột cống (Rattus norvegicus), chuột nhắt (Mus musculus) và chuột chù (Suncus murinus).

Phương pháp phân tích sinh học phân tử được lựa chọn là RT-PCR một bước kết hợp hai bước sử dụng cặp mồi đặc hiệu hướng đến vùng bảo tồn cao trên đoạn gen M của virus Hanta, cụ thể là cặp mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353. Kỹ thuật RT-PCR được ưu tiên lựa chọn thay vì phương pháp nuôi cấy tế bào truyền thống bởi tính an toàn sinh học cao, không đòi hỏi phòng thí nghiệm cấp độ 3 hoặc cấp độ 4 đắt đỏ, đồng thời vượt trội hơn các xét nghiệm huyết thanh học ELISA nhờ khả năng loại bỏ hoàn toàn hiện tượng phản ứng chéo giữa các serotype virus Hanta khác nhau. Quy trình nghiên cứu trải qua các bước chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp, số chu kỳ nhiệt, thời gian kéo dài chuỗi và kiểm định các chỉ số độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại trước khi ứng dụng trực tiếp trên toàn bộ mẫu bệnh phẩm thực địa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật RT-PCR phát hiện đoạn gen M của virus Hanta với các thông số nhiệt học chuẩn xác nhất. Phản ứng đạt hiệu suất khuếch đại tối ưu ở nhiệt độ bắt cặp 52 độ C, duy trì qua 35 chu kỳ nhiệt và thời gian kéo dài 45 giây. Quy trình thể hiện giới hạn phát hiện ở nồng độ bản sao cực thấp, độ lặp lại đạt 100% giữa các lần thử nghiệm độc lập và độ đặc hiệu đạt 100%, hoàn toàn không xảy ra hiện tượng dương tính giả khi thử nghiệm đối chứng với các tác nhân gây bệnh đường hô hấp khác.

Thứ hai, việc áp dụng quy trình RT-PCR trên các mẫu mô phổi chuột thu thập thực địa tại Hà Nội giai đoạn 2015 - 2016 đã phát hiện tỷ lệ nhiễm virus Hanta trung bình trên quần thể chuột dao động trong khoảng từ 14% đến 34% tùy theo từng địa bàn điều tra. Trong đó, loài chuột cống Rattus norvegicus chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất, vượt trội hoàn toàn so với các loài chuột nhắt và chuột chù thu thập cùng thời điểm.

Thứ ba, kết quả giải trình tự gen và phân tích di truyền phân tử đối với 2 chủng virus Hanta phân lập được trong năm 2015 và năm 2016 cho thấy độ tương đồng nucleotide đạt từ 95% đến 98% và độ tương đồng amino acid đạt trên 97% so với các chủng virus Seoul (SEOV) tham chiếu đã từng công bố tại Việt Nam và các quốc gia châu Á lân cận.

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ lưu hành mầm bệnh cao trên loài chuột cống Rattus norvegicus hoàn toàn phù hợp với các đặc tính sinh thái học đô thị. Chuột cống là loài gặm nhấm có mật độ phân bố dày đặc tại các hệ thống cống rãnh, chợ đầu mối và khu dân cư đông đúc của Hà Nội. Điều kiện vệ sinh môi trường tại một số khu vực chưa đảm bảo tạo môi trường lý tưởng cho chuột sinh sản, dẫn đến nguy cơ lây truyền virus nội tại trong quần thể qua chất thải bài tiết và tăng khả năng tiếp xúc với con người.

Kết quả phân tích phân tử khẳng định chủng virus Hanta lưu hành chủ yếu tại Hà Nội thuộc dòng virus Seoul (SEOV), tác nhân chính gây thể bệnh Sốt xuất huyết hội chứng thận (HFRS) tại khu vực Đông Á vốn chiếm tới 90% số ca bệnh toàn cầu. Toàn bộ dữ liệu tỷ lệ nhiễm theo thời gian và không gian có thể được mô hình hóa trực quan thông qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ nhiễm theo từng loài chuột tại các quận huyện, biểu đồ đường biểu diễn sự biến thiên tỷ lệ dương tính theo các tháng trong năm, và cây gia hệ phân tử (Phylogenetic tree) đối chiếu đoạn gen M giúp khẳng định tính ổn định di truyền của chủng virus Seoul lưu hành tại miền Bắc Việt Nam so với các nghiên cứu trước đây tại Hải Phòng và Thanh Hóa.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ phân tử chủ động định kỳ 6 tháng một lần tại 100% các khu vực đô thị trọng điểm, khu vực chợ đầu mối và kho bãi tập kết hàng hóa lớn trên địa bàn Hà Nội. Mục tiêu là phát hiện sớm sự biến động mật độ mầm bệnh trên đàn chuột trước mùa sinh sản cao điểm của động vật gặm nhấm, do Trung tâm Kiểm soát bệnh tật (CDC) Hà Nội chủ trì triển khai từ năm 2018.

Thứ hai, chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta cho 100% phòng xét nghiệm y tế dự phòng tuyến tỉnh và thành phố trực thuộc Trung ương trong khung thời gian 24 tháng tới. Giải pháp này giúp rút ngắn thời gian xác định căn nguyên virus từ 3 ngày xuống dưới 6 giờ, do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương phối hợp cùng các trường đại học y sinh học thực hiện.

Thứ ba, triển khai các chiến dịch diệt chuột đồng bộ kết hợp xử lý rác thải sinh hoạt nhằm kéo giảm từ 50% đến 70% mật độ quần thể chuột cống tại các khu dân cư có nguy cơ lây nhiễm cao trong vòng 12 tháng. Trách nhiệm thực hiện thuộc về Ủy ban nhân dân các quận, huyện phối hợp cùng các công ty môi trường đô thị và cơ quan y tế địa phương.

Thứ tư, xây dựng sổ tay hướng dẫn lâm sàng và tổ chức tập huấn chuyên đề cho 100% cán bộ y tế khoa Truyền nhiễm và Cấp cứu tại các bệnh viện đa khoa tuyến quận, huyện. Hướng dẫn cần tập trung phân biệt sớm 5 giai đoạn tiến triển của bệnh HFRS với sốt xuất huyết Dengue, đưa chỉ định xét nghiệm RT-PCR vào quy trình sàng lọc cho bệnh nhân sốt kèm tổn thương thận cấp tính, do Sở Y tế Hà Nội chỉ đạo thực hiện định kỳ hàng năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm thứ nhất bao gồm các học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học thực nghiệm và Công nghệ sinh học. Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo giá trị về phương pháp thiết kế mồi, kỹ thuật tối ưu hóa phản ứng RT-PCR cho virus có hệ gen ARN phân đoạn, cùng kỹ thuật giải trình tự và phân tích phả hệ phân tử đạt độ chính xác trên 95%.

Nhóm thứ hai là cán bộ dịch tễ học và chuyên viên xét nghiệm tại hệ thống Trung tâm Kiểm soát bệnh tật (CDC) và các Viện Vệ sinh Dịch tễ trên toàn quốc. Nhóm đối tượng này có thể ứng dụng trực tiếp quy trình giám sát thực địa trên mô phổi động vật gặm nhấm, giúp nâng cao hiệu quả giám sát chủ động ổ dịch Hantavirus với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt xấp xỉ 100%.

Nhóm thứ ba là đội ngũ bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm, Hồi sức cấp cứu và Nội thận tại các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh đến trung ương. Công trình cung cấp cơ sở sinh bệnh học vững chắc về 5 giai đoạn lâm sàng của hội chứng HFRS, hỗ trợ chẩn đoán phân biệt nhanh chóng các ca bệnh sốt xuất huyết kèm suy thận cấp có tỷ lệ tử vong từ 35% đến 50%.

Nhóm thứ tư là các nhà quản lý môi trường đô thị, kỹ sư y tế công cộng và các đơn vị kiểm soát sinh vật gây hại (Pest Control). Dữ liệu phân bố mầm bệnh trên loài chuột cống Rattus norvegicus với tỷ lệ nhiễm từ 14% đến 34% là căn cứ khoa học xác đáng để xây dựng phương án bẫy bắt, xử lý hóa chất diệt gặm nhấm và quy hoạch vệ sinh môi trường định kỳ tại các đô thị lớn.

Câu hỏi thường gặp

Con đường lây truyền chủ yếu của virus Hanta từ động vật sang người là gì?

Con người nhiễm virus Hanta chủ yếu do hít phải các hạt khí dung chứa dịch tiết bài tiết như nước tiểu, phân hoặc nước bọt của động vật gặm nhấm nhiễm bệnh trôi nổi trong không khí. Virus xâm nhập trực tiếp qua niêm mạc đường hô hấp hoặc qua các vết trầy xước trên da khi tiếp xúc với chất thải của chuột mang mầm bệnh.

Tại sao kỹ thuật RT-PCR được ưu tiên hơn xét nghiệm huyết thanh ELISA trong phát hiện virus Hanta trên chuột?

Kỹ thuật RT-PCR khuếch đại trực tiếp vật liệu di truyền ARN của virus với độ đặc hiệu đạt 100%, giúp xác định chính xác kiểu gen mầm bệnh mà không bị hiện tượng phản ứng kháng thể chéo giữa các serotype như phương pháp ELISA. Hơn nữa, RT-PCR cho phép chẩn đoán ngay từ giai đoạn cấp tính khi nồng độ kháng thể chưa hình thành rõ rệt.

Bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận diễn biến qua những giai đoạn lâm sàng điển hình nào?

Bệnh nhân HFRS thường trải qua 5 giai đoạn nối tiếp gồm: giai đoạn sốt cao đột ngột (1 đến 7 ngày), giai đoạn hạ huyết áp và sốc (1 đến 3 ngày), giai đoạn thiểu niệu tổn thương thận cấp (2 đến 6 ngày), giai đoạn đa niệu hồi phục dần (khoảng 2 tuần) và giai đoạn hồi phục hoàn toàn kéo dài từ 3 đến 6 tháng.

Loài động vật nào đóng vai trò ổ chứa chính của virus Hanta tại khu vực Hà Nội?

Loài chuột cống Rattus norvegicus thuộc họ Muridae là vật chủ chứa tự nhiên chủ yếu của chủng virus Seoul (SEOV) tại Hà Nội. Loài gặm nhấm này thích nghi cao với cống rãnh, chợ búa và khu đông dân cư, mang virus mạn tính và phát tán mầm bệnh với tỷ lệ dương tính ghi nhận từ 14% đến 34%.

Tỷ lệ lưu hành huyết thanh dương tính với virus Hanta tại Việt Nam hiện ở mức bao nhiêu?

Các nghiên cứu dịch tễ ghi nhận tỷ lệ chuột mang kháng thể virus Hanta tại Việt Nam dao động từ 14% đến 34%. Trên cơ thể người, tỷ lệ cư dân đô thị mang kháng thể dương tính tại Hà Nội đạt khoảng 5,4%, trong khi tỷ lệ huyết thanh dương tính trên bệnh nhân nghi nhiễm tại các tỉnh phía Nam được ghi nhận lên tới 11,5%.

Kết luận

• Luận văn đã tối ưu hóa thành công quy trình RT-PCR một bước và hai bước với độ nhạy cao, độ đặc hiệu đạt 100% để phát hiện nhanh đoạn gen M của virus Hanta từ mẫu mô phổi chuột.
• Khẳng định sự lưu hành thực tế của virus Hanta trên quần thể động vật gặm nhấm tại Hà Nội giai đoạn 2015 - 2016 với tỷ lệ dương tính dao động từ 14% đến 34%, trong đó chuột cống Rattus norvegicus là ổ chứa chính.
• Xác định 2 chủng virus phân lập tại Hà Nội thuộc dòng virus Seoul (SEOV) với độ tương đồng nucleotide đạt từ 95% đến 98% so với các chủng tham chiếu tại châu Á.
• Hoàn thiện kế hoạch mở rộng giám sát dịch tễ phân tử tại các điểm nóng đô thị và chuyển giao quy trình cho mạng lưới y tế dự phòng trong giai đoạn tiếp theo nhằm rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 6 giờ.
• Khuyến nghị các cơ quan y tế công cộng và chính quyền địa phương khẩn trương ứng dụng quy trình xét nghiệm RT-PCR vào giám sát dịch tễ học thường quy và triển khai đồng bộ các biện pháp kiểm soát chuột để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI hỌc QUỐC GIA hÀ HỘI TTGJỜNG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ HhIÊHN Phan hà My HGHIÊN cỨU ỨIG DỤIG KỸ ThUẬT FT-PcT PhÁT hiIỆN VI TúT hAHTA TÊN chUỘT TẠI MỘT SÓ ĐIÊM Ở hÀ HỘI, HĂM 2015 - 2016 LUẬN VĂII ThẠc SĨ Kh0A hỌc hà Idi — 2017 ĐẠI hỌc QUỐC GIA hÀ HỘI TTGJỜNG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ HhIÊHN Phan hà My HGHIÊN cỨU ỨIG DỤIG KỸ ThUẬT FT-PcT PhÁT hiIỆN VI TúT hAHTA TÊN chUỘT TẠI MỘT SÓ ĐIÊM Ở hÀ HỘI, HĂM 2015 - 2016 chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂII ThẠc SĨ Kh0A hỌc TGG|OI hG|GNG DATI KHOA hOc: TS. Iguyén Thi Kiéu Auh PGS. V6 Thi Thojong Lan ha Hdi — 2017 LỜI cÁM ƠN Đầu liên, lôi xin vay lỏ lòng oiế! ơn sâu sắc tới: e TS. Hguyễn Thị Kiều Anh, Phó Giám Đốc Tzung lâm V lễ Dự phòng hà Hội.

cô đã tuyển đại ch0 lôi những kiến thức phaqơng pháp nghiên đíu kh0a học đã lực tiến hgớng dẫn lận tình tz0ng suối quá lsình nghiên đứu. đô đã xây dựng ý lỏng, qng dấp kinh phí và lạ0 điều kiện thuận lợi để lôi h0àn thành luận văn này. Võ Thị Thương Lan, Tzgởng phòng thí nghiệm Sinh VY, tlegòng Đại học Kh0a học Tự nhiên. cô đã lạ0 điều kiện ch0 lôi liến xúc với ác kiến thức kh0a học haéng dan lôi lừ những thí nghiệm kh0a học đâu liên.

IHguyễn Tuyết Thu, Ths. Hguyễn Vĩnh Đông - phòng thí nghiệm dại và qác Iyssavieus, kh0a Vì zúi đã hỗ teợ lôi lz0ng suối quá leình thực hiện luận văn. Hguyễn Thị Lan Anh, Tzdqỏng kh0a Miễn dịch và Sinh học phân lử, Viện Vệ sinh Dịch lễ Tzung Qlơng, đã chỉ oả0 lôi ngày đàng lzqgởớng thành hơn về adách sống, về ldq duy kh0a học ngay lừ những ngày đầu sqóc chân yvà0 Viện. Tôi xin lân lọng đảm on đác thầy giá0, đô giá0 lz0ng KhỦa Sinh học leqong Dai hoc Kh0a hoc Ty nhién — Dai hoc Quéc gia hà Hội đã lận tình giảng dạy, dìu dải lôi le0ng thời gian học lập tai leqong.

Tôi đăng xin đqợc gửi lời đảm ơn chân thành tới dác anh chị đồng nghiện phòng thí nghiệm chẩn đ0án phân tử - Viện Vệ sinh Dịch lễ Teung Œ]ơng đã giúp đỡ, úng hộ lôi le0ng quá leình thực hiện luận văn này. đuối đòng, lôi xin vay #6 lòng ti ân lới bỗ Mẹ —- những nggời đó đông sinh thành nuôi ddgõng, dạy dỗ, đã hết lòng ủng hộ để lôi đó đqợc thành quả hôm nay và gửi lời đảm ơn đến chồng lôi — nggjời luôn oên lôi động viên, chia sẻ những khó khăn và hạnh phúc lz0ng qiộc sống hàng ngày. hà liội, tháng 09 năm 2017 Phan hà My MUc LUc MO DAU 1 chG|ONG I - TONG QUATI 3 1. Sơ lojợc lịch sử phát hiện vi rú† haniÌa.2, Fi Wadi occ.

- Quá trình nhân lên của vi rú† harIÌa. PhoJơng thức và khả năng gây bệnh. Đặc điểm lâm sàng của bệnh d0 vi rú†i hanÌa. bệnh sốt xuất huyết hội chứng thận (hFTS).

hội chứng phổi d0 vi rút hania (hPS). Dịch lễ học sệnh đ0 vi rúi hania. Tùnh hình dich lễ sệnh d0 vi rút hanla trên thế giới và Việt Iam. Ô chứa và nguồn lruyền bệnh.

chân đ0án sệnh d0 vi rút hania lr0ng phòng thí nghiệm. Phojơng pháp chân đ0án huyết thanh học. các phoJơng pháp sinh học phân lử. ---¿- + + sc+x+xcscseree 22 chữ|ƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PhƠ|ƠIG PhÁP IGhIÊN cỨU.

Đối loJợng và địa điểm nghiên cứu. Đối lơjợng nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu.---- 2 ©-<+2+++2+z+EEE+EEEEEEESEkeerkrrkrrrkeee 25 PM 8i iên j0 03 nh. Sinh phẩm, hóa chất.

Trang thiết bị, dụng CỤ. PhoJơng pháp nghiÊH CỨU. Tối oqu hóa quy trình TT-PcT phát hiện vi rút hania và xác định một 86 thng 86 0: 1 NA. Áp dụng quy trình IT-PcT đã đơjợc lối oju hóa để phát hiện vi rút hanla trực liếp từ bệnh phẩm lâm sàng.2- 2 25++22++2czxerxeerxs 29 chd|ƠING 3 - KẾT QUÁ 36 3.

Kết quả lối oyu quy trình TT-PcT chân đÓán vi rút hanta và xác nhận một số thông số kỹ thuật của phơ|ơng pháp. Kết quả lối øu quy trình TT-PcT chân đ0án vi rúl hanla. Một số đặc điểm của quy trình phát hiện vi rot hamta sử dụng kỹ thuật TTT-PCT. Kết quả chân đ0án vi rúlhanlalrên thu ởmôi sốđia điểm taj ha chuôt thập Hôi, năm 2015 - 2017.

Môi số dic điểm về mẫu nghiên cứ u. Kết quả chân đ0án vi rúi hania lrên chuôt,. Kết quả phân tich đặc điểm di truyền đ0ạn gen M của 2 chủng phân lập năm 2015 và năm 2016.- 2: 22¿+V+++2EEE++EEEEE2E2221E1222122221122211 22 Lee 49 chƠ|ƠNG 4 - bÀ] LUẬN 56 4. Tối ơu quy trình TT-PcT' phái hiện vi rú† hania.Sự loiu hành vi rút hania trên chuột lại một số điểm ở hà lội, năm 2015 - "01.

Phân l0ài và đặc điểm phân lử đ0ạn gen M của một số chủng phân lập tai hà lội, năm 2015 - 2 ÍÓ. -- ¿+ + 6< E21 9121 1111 1 1 1111 HH TH nhiệt 61 KET LUẬN KIÊN Gh] TÀI LIỆU ThAM KhẢ0 PhU LUc 71 72 73 80 DAITh MUc bẢIG bang Tén bang Trang các giai đ0ạn điên hình, triệu chứng và biên chứng của bang 1.1 ¬ „ 11 bệnh sot xuat huyét hoi chimg than (hFTS) Sự phân sô địa lý của các v1 rúi hania gây bệnh ch0 bảng 1.2 „ 16 ngơjời và lrên vật chủ lơJơng ứng thuộc lÖài gặm nhâm bang 2.1 | Trình tự môi của kỹ thuật [L”T-PcI' phái hiện vi rúi hania 26 Phân lOại chuột thu thập lại một sô địa điêm nghiên cứu bảng 3.2 | Phân bô chuột the0 thời gian thu thập 44 Kết quả chân đ0án vi rút hania the0 l0ài chuội, năm bảng 3.3 45 2015 - 2017 Kêt quả chân đ0án vi rúi hania the0 l0ài chuội, năm bảng 3.4 46 2015 - 2017 Độ lơiơng đông mucleOtide va axit amin cua chung loyu bang 3.5 | hành lại hà Ilội năm 2015, năm 2016 s0 với các chủng 53 lại Việt Ilam và tr0ng khu vực Trình tu axit amin (vi tri 629 — 769) của gen M 02 bang 3.6 55 chủng phân lap trOng nghién cứu s0 sánh với các chủng tham chiếu phân lập lại Việt Tam và một số nơiớc lân cận DAHh MỤC hillh hình Tên Trang hình hình 1.1 | hình ảnh dolới kính hiện v1 điện lử quét của vi rúi Sin II0mbpre 5 hình I.2 | Sơ đồ cau ta0 cua hat vi rot hanta 6 hình 1.3 | Sơ đô câu trúc hệ gen của vi rúi hania 7 hình 1.4 | chu kỳ nhân lên của vi rút hania 8 Phân số các lrolờng hợp sệnh lâm sàng nhiễm vi rút hania lrên hình 1.5 , 14 thê giới, năm 2000 Sơ đô cặp môi SE0-ME 1936 và SE0-MI' 2353 trên đ0ạn lrình hình 2.2 26 tu gen M hình 3.1 | hình ảnh xác định nhiệt độ sắt cặp lôi ou của phoJơng pháp 36 hình 3.2 | hình ảnh xác định sô chu kỳ nhiệt! lôi oqu của phơJơng pháp 37 hình 3.3 | hình ảnh xác định thời gian ké0 dài lỗi øu của phơlơng pháp 38 hình 3.4 | hình ảnh xác định giới hạn phát hiện của phoJơng pháp 39 hình 3.5 | hình ảnh xác định độ lặp lại của phơiơng pháp 40 hình 3.6 | hình ảnh xác định độ đặc hiệu của phojong phap 41 hình 3.7 | bản đồ thu thap mẫu chuôi, năm 2015 -2017 42 hình 38 hình ảnh điên di sản phâm PcT chân đ0án vi rút hania từ mô 45 phổi của chuôt bản đồ phân bố chuột nhiễm vi rot hanta tai cdc dia điểm nghiên hình 3.10 cây gia hệ của các vi rút hanta lou hành ở Việt Tam và một số 50 noc chau A cây gia hệ các vi rúi hania lou hành lrên thê gidi dgjgc xay dun hình 4.1 Y g1a hệ ƠỊ g101 dgjgc Xây dựng 63 dựa lrên trimh ty axit amin pr0lein II hình 4.2 | cây gia hệ của các vi rúi hanla dựa trén trimh ty nucleOtide gen S 64 cây gia hệ đojợc xây dựng lrên lrình lự gen S các vi rú† hania có hình 4. 65 các siêu hiện lâm sàng khác nhau DAHh MỤC BbIÊU ĐÒ biểu đồ Tên siêu đồ Trang , Ket qua chan d04n chudt nhiễm vi rot hania the0 biéu do 3.1 | địa 47 điểm nghiên cứu ¬¬ Phân số chuột nhiễm vi rút hania †he0 thang, nam biéu do 3.2 49 2015 — 2017 bẢÁNG KÝ hIỆU cÁc chỮ VIẾT TÁT ADII : Axit DeOxyribOnucleic AIT : Axit PinOnucleic ELISA : Enzyme — Linked Immun0sOrsent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzyme) hFIS : haem(rrhagic Fever with Ienal Syndr0me (Sốt xuất huyết hội chứng thận) hPS : hanlavirus Pulm0nary Syndr0me (hội chứng phổi dO vi rit hanta) IcTV : _InternatiOmal COmmittee On TaxOn0my Of Viruses (Uy pan Quéc lế về Phân l0ại Vĩ rú!) lgG : Immun0gl0sin G (Kháng thê miễn dịch lớp G) IgM : _Immun0gl0sin M (Khang thé mién dich lép M) IT-PcI : Teverse Transcriplase — P0lymerase chain Teacli0n (Phản ứng khuếch đại chuỗi men sa0 chép ngojợc) MO DAU Vi rot hanla thuộc giống hanlavizus, họ bunyavieidae có thê gây bệnh ch0 ngojời trên khắp thế giới, nhơIng không gây sệnh ch0 các l0ài gặm nhắm. IIgơjời bị nhiễm sệnh d0 hít phải những khí dung từ chất thải (phân, nojớc tiểu) hay đ0 vết cắn của động vật gặm nhắm có chứa vi rúi.

Vĩ rút hania gây ra hai thể bệnh voi ty lệ lử v0ng ca0 là Sốt xuất huyết hội chứng thận (hFTS - haem0rrhagic Fever with Tenal Syndr0me) và hội chứng phổi đ0 vi rúi hanta (hPS - hanlavirus Pulm0nary Syndr0me). Thé sệnh dO vi rot hania đã đơyợc ghi nhận ở lất cả các châu lục. Tuy nhiên, mỗi l0ài vi rot hanta truyền sệnh ch0 ngojời thông qua một vật chủ nhất định và chúng đơjợc phân số †he0 các vùng địa lý khác nhau, gây ra các bệnh cảnh lâm sàng chủ yếu khác nhau, chính vì vậy sự phân số của hFTS và hPS cũng sị giới hạn †he0 sự phân số địa lý của các l0ài động vật gặm nhắm. Vĩ rút thuộc các phân họ /7/c0/0minae và Sigrm0d0nfinae là nguyên nhân gây ra hPS nặng với lý lệ tử vŨng ca0 lơiu hành ở cdc 10ai gam nhắm khác nhau đojợc phân số khắp bắc và Iam Mỹ.

D0 vậy, lại các vùng này các ca bệnh nhiễm vi rút hania chủ yếu đơiợc sá0 cá0 là HPS. Tai My co vi rúi Araraquara lơiu hành ở vật chủ là lOài 7/eœ0mys lasiuaus, chúng là nguyên nhân gây ra các ca HPS 6 nojoc này. Tr0ng khi đó vi rút D0srava-belgrade lruyền bệnh ch0 ngơjời qua 10ai chudt rimg ApOdemus pOnticus, bệnh chủ yếu siêu hiện là hFTS với 1i lệ ca0 lại châu Âu. Điền hình l0ài 72zius n02vegiais (chuôi cống) là vat chủ của vi rút Se0ul có phân số địa lý trên l0àn thế giới, gây nên bệnh cảnh chủ yếu là hFTS.

châu Á là châu lục có lịch sử lâu đời nhất về nhiễm vi rút hania. Mội số ý kiến ch0 rằng hFTS đã lồn lại rất lâu kh0ảng 1.