Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ lâm nghiệp với đề tài "Nghiên cứu cơ sở khoa học để tuyển chọn Thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) kháng sâu róm thông (Dendrolimus punctatus Walker) và có sản lượng nhựa cao" do nghiên cứu sinh Đào Ngọc Quang thực hiện trong khuôn khổ Chương trình đào tạo tiến sĩ khóa 22 (2010–2014) tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, bảo vệ năm 2015.
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Theo Quyết định số 3322/QĐ-BNN-TCLN ngày 28/7/2014 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tổng diện tích rừng cả nước tính đến ngày 31/12/2013 đạt 13,954 triệu ha (độ che phủ 41,0%), trong đó diện tích rừng trồng là 3,294 triệu ha với khoảng 400.000 ha rừng thông. Cây Thông nhựa (Pinus merkusii) là loài cây có biên độ sinh thái rộng, chịu được điều kiện lập địa cằn cỗi, khô hạn, được đưa vào các chương trình trồng rừng phòng hộ và sản xuất quy mô lớn (như Dự án 327, Dự án 5 triệu ha rừng). Thông nhựa là cây lấy nhựa chủ lực của Việt Nam với năng suất đạt 5–6 kg/cây/năm, chu kỳ khai thác đẽo máng kéo dài 40–50 năm, cung cấp nguồn nguyên liệu chính cho công nghiệp chế biến colophan và tinh dầu thông (turpentine oil).
Tuy nhiên, các lâm phần Thông nhựa thuần loài thường xuyên đối mặt với dịch hại từ côn trùng. Trong 45 loài sâu hại thông được ghi nhận tại Việt Nam (Lê Nam Hùng và Nguyễn Văn Độ, 1990), Sâu róm thông (SRT - Dendrolimus punctatus Walker, họ Lasiocampidae, bộ Lepidoptera) là loài gây hại nguy hiểm nhất. SRT phân bố phổ biến ở đồi thoai thoải có độ cao dưới 400 m (hiếm khi lên tới 600 m). Khi bùng phát dịch, SRT ăn trụi lá, làm giảm sinh trưởng, suy giảm nghiêm trọng sản lượng nhựa và khiến hoạt động chích nhựa phải ngừng trệ trong nhiều năm. Các biện pháp phòng trừ truyền thống (thủ công, hóa học với DDT, 666, Wofatox, hay sinh học đơn lẻ) chưa giải quyết triệt để dịch SRT tại các điểm nóng như Sơn Động (Bắc Giang), Hà Trung (Thanh Hóa), Quỳnh Lưu, Nghi Lộc, Nam Đàn (Nghệ An), Can Lộc, Hương Khê, Hương Sơn (Hà Tĩnh), Quảng Trạch (Quảng Bình).
Trên thực tế, trong cùng một điều kiện sinh thái lâm phần bị sâu hại, tồn tại những cá thể Thông nhựa hoàn toàn không bị ăn hoặc bị hại rất nhẹ, đồng thời có sản lượng nhựa vượt trội. Việc nghiên cứu cơ chế kháng sâu ở mức độ hình thái, cấu tạo giải phẫu, thành phần hóa sinh tinh dầu và hệ vi sinh vật nội sinh kết hợp với đặc tính di truyền nhằm phục vụ công tác chọn giống kháng sâu có sản lượng nhựa cao là một khoảng trống khoa học cần được giải quyết.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định các mục tiêu cụ thể:
- Xác định được cơ sở khoa học và lý luận thực tiễn cho việc tuyển chọn Thông nhựa kháng Sâu róm thông và sản lượng nhựa cao.
- Chọn được một số cá thể Thông nhựa kháng SRT và sản lượng nhựa cao.
- Bước đầu xác định được tính kháng SRT của các cá thể Thông nhựa kháng thông qua so sánh một số đặc điểm hình thái, đặc điểm cấu tạo lá, thành phần các hợp chất hóa học và thành phần các vi sinh vật nội sinh (VSVNS) của Thông nhựa kháng và mẫn cảm SRT.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Các lâm phần Thông nhựa (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) trên 30 năm tuổi và loài Sâu róm thông (Dendrolimus punctatus Walker). Luận án tập trung so sánh đặc điểm hình thái, cấu tạo lá, thành phần hóa học tinh dầu, thành phần vi sinh vật nội sinh và đa dạng di truyền giữa các cá thể kháng và mẫn cảm với SRT.
- Phạm vi không gian: Các vùng trọng điểm trồng Thông nhựa thường xuyên xảy ra dịch hại tại miền Trung, gồm: Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Lâm nghiệp Hà Trung (huyện Hà Trung, tỉnh Thanh Hóa); Công ty TNHH một thành viên Lâm nghiệp Quỳnh Lưu (huyện Quỳnh Lưu, tỉnh Nghệ An); Công ty TNHH một thành viên Cao Hà Tĩnh (huyện Can Lộc, tỉnh Hà Tĩnh); cùng các khu khảo nghiệm hậu thế và vườn vật liệu tại Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh và Vĩnh Phúc.
- Phạm vi thời gian: Các nội dung nghiên cứu thực nghiệm được triển khai chính từ năm 2007 đến 2013, kết hợp kế thừa dữ liệu quan sát hệ thống từ năm 2006.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trên thế giới
- Về Sâu róm thông và quy luật phát sinh: Nghiên cứu của Bassus (1974), Chen (1990), Cai (1995), Chen và cộng sự (1980), Jian (1984), Zhang và cộng sự (2001, 2003), Lu và cộng sự (2001) tại Trung Quốc chỉ ra loài Dendrolimus punctatus phân bố từ sông Hoàng Hà trở xuống phía Nam. Mỗi năm Trung Quốc có khoảng 3 triệu ha rừng thông bị hại, mất khoảng 5 triệu m³ gỗ; riêng năm 1991 tại huyện Đức Khánh (Quảng Đông), dịch SRT gây hại 40.000 ha, làm giảm 6.510 tấn nhựa. Số thế hệ SRT biến động từ 1–5 thế hệ/năm tùy thuộc tích ôn (Li, 1999: tích ôn 5.900°C có 2–3 thế hệ, tích ôn 7.694°C có 3–4 thế hệ). Zhang và cộng sự (2003) tại Quảng Tây xác định vòng đời SRT kéo dài 72–84 ngày (trứng: 6–8 ngày, sâu non: 46–54 ngày, nhộng: 13–17 ngày, trưởng thành: 7–8 ngày). Kong và cộng sự (2001) chứng minh con trưởng thành giao phối phải kéo dài trên 7 giờ thì trứng mới được thụ tinh hoàn toàn.
- Về phòng trừ SRT: Chuyển đổi từ thuốc hóa học gốc cúc tổng hợp pyrethroid (Kong và cs, 2001; Li và cs, 1997) sang biện pháp sinh học và IPM (Hsaio, 1981; McFadden và cs; Billings, 1991). Các thiên địch được ứng dụng gồm Nấm bạch cương (Beauveria bassiana), Ong mắt đỏ (Trichogramma dendrolimi) ký sinh trứng (Zhang và cs, 2000, 2003; xác định 250 loài thiên địch của SRT).
- Về tính kháng sâu hại ở thực vật: Painter (1958) và các tác giả Jayaraj & Uthamassamy (1990), Kenkel (2007), Leru & Calatayud (1994), Lowe & Russell (2008), Peshin & Dhawan (2009), Wiseman (1985), Yang (2008) hệ thống hóa 3 cơ chế kháng: Không ưa thích (antixenosis), Kháng sinh (antibiosis) và Chịu đựng (tolerance). Clancy (2002) phân tích 10 dạng tính kháng sâu hại ăn lá. Wagner & Zhang (1993) chứng minh độ cứng lá của Pinus ponderosa kháng ong ăn lá Neodiprion fulviceps. Nghiên cứu của Chen (1990) chỉ ra hàm lượng tannin, phenol và terpene trong lá thông ức chế SRT hại Thông đuôi ngựa. Gershenzon & Groteau (1991) khẳng định monoterpene là rào cản độc tính quan trọng; Litvack & Monson (1998) ghi nhận sâu Halisdota ingens chừa lại phần gốc lá chứa hàm lượng monoterpene cao; Cates & Redak (1998) phát hiện Pseudotsuga menziensii kháng sâu chồi Choristoneura occidentalis nhờ hàm lượng terpene cao duy trì qua nhiều năm.
- Về vi sinh vật nội sinh (VSVNS): Azevedo và cộng sự (2000), Roos & Hattingh (1983), Quispel (1992), Zinniel và cộng sự, Sturz và cộng sự (1996, 2000), Benhamou và cộng sự (1996), Hallmann và cộng sự chứng minh vi khuẩn và nấm nội sinh thúc đẩy sinh trưởng, kích kháng sinh học, tiết hợp chất độc ngăn chặn côn trùng và tuyến trùng. Carroll (1988), Clay (1988a, 1988b), Kari & Marjo (2011) xác định nấm nội sinh làm giảm tỷ lệ sống và biến đổi tập tính ăn của sâu hại.
Các hướng nghiên cứu trong nước
- Về sinh học và phòng trừ SRT: Đặng Văn Cẩn (1970), Lê Nam Hùng (1990), Lê Nam Hùng và Nguyễn Văn Độ (1990), Lê Thanh Hải (2001), Phùng Thị Hoa (2006), Phạm Thị Thùy (1996), Truong (1990), Nguyễn Như Bình (1974), Nguyễn Duy Thiệu (1975) theo dõi số lứa SRT (miền Bắc có 3–4 thế hệ, miền Trung như Nghệ An, Hà Tĩnh có 4–5 thế hệ/năm). Các thử nghiệm phòng trừ dùng hóa học (DDT, 666, Wofatox - Phạm Ngọc Anh, 1962; Xuân Hồng, 1974; Trần Kiểm, 1963; Đào Xuân Trường, 1976); chế phẩm Bôvêrin (Beauveria bassiana - Đặng Văn Cẩn, 1970; Nguyễn Hế Lộc, 1968; Lê Thanh Hải, 2001); virus NPV (Nguyễn Hậu Toàn, 1994 đạt hiệu lực 55,2–83,3%); nhặng ký sinh họ Tachinidae (Phạm Bình Quyền, 2004 phát hiện 6 loài ký sinh như Carcelia bombylans, Crossocosmia zebina, Exorista civilis). Phạm Bình Quyền (2004) chỉ ra việc thiếu nghiên cứu bảo tồn thiên địch và chưa phối hợp biện pháp chọn giống kháng là nguyên nhân khiến dịch sâu tái diễn.
- Về chọn giống cây rừng kháng sâu bệnh: Old và cộng sự (2003), Nguyễn Hoàng Nghĩa và cộng sự (2007) tuyển chọn 7 giống bạch đàn kháng nấm lá (Cylindrocladium quinqueseptatum, Cryptosporiopsis eucalypti); Nguyễn Đăng Đăng và Phạm Quang Thu (2008), Phạm Quang Thu và Nguyễn Đăng Đăng (2008) chọn loài bạch đàn kháng nấm Quambalaria eucalypti và ong tạo u (Leptocybe invasa); Nguyễn Văn Độ và Đào Ngọc Quang (2002) tuyển chọn 5 xuất xứ Lát hoa (Chukrasia tabularis) kháng sâu đục nõn (Hypsipyla robusta).
- Về vi sinh vật nội sinh cây rừng: Phạm Quang Thu (2002), Nguyễn Hoàng Nghĩa và Phạm Quang Thu (2006), Phạm Quang Thu và Trần Thanh Trăng (2002), Vũ Văn Định (2009, 2012, 2014) phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus subtilis (B03, P01, X02, LC) và Bacillus amyloliquefaciens (KPT) có vòng ức chế nấm bệnh hại keo trên 20 mm; Nguyễn Thị Thu Nga và Phạm Quang Thu (2006) phân lập 56 chủng vi khuẩn đối kháng nấm hại muồng đen.
Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết
Các công trình trước đây tại Việt Nam chủ yếu dừng lại ở mức độ khảo sát, thống kê cá thể hoặc phòng trừ ngắn hạn. Luận án này là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên xác định bản chất tính kháng SRT của Thông nhựa dựa trên sự kết hợp đồng bộ giữa đặc điểm hình thái - giải phẫu lá, phân tích sinh hóa tinh dầu (định lượng monoterpene), mật độ vi sinh vật nội sinh và đa dạng di truyền ADN, từ đó đề xuất tiêu chí khoa học phục vụ tuyển chọn cây trội kháng sâu kết hợp năng suất nhựa cao.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
Luận án vận dụng lý thuyết về 3 cơ chế kháng sâu hại của thực vật (Painter, 1958; Jayaraj & Uthamassamy, 1990) gồm: Không ưa thích/Không hấp dẫn (Antixenosis), Kháng sinh (Antibiosis) và Chịu đựng (Tolerance). Khung phân tích liên kết giữa các rào cản cơ học bên ngoài (hình thái cành, vỏ, độ dày cutin và mô đồng hóa của lá), rào cản hóa học thứ cấp (thành phần tinh dầu monoterpene), hệ vi sinh vật nội sinh (nấm và vi khuẩn cộng sinh trong mô lá) và sai khác chỉ thị di truyền ADN.
Phương pháp nghiên cứu thực tế
- Phương pháp điều tra lâm phần và phân cấp bị hại: Thiết lập 15 ô tiêu chuẩn (OTC) tại 3 vùng nghiên cứu (Hà Trung - Thanh Hóa, Quỳnh Lưu - Nghệ An, Can Lộc - Hà Tĩnh), mỗi địa điểm 5 OTC, diện tích 1.000 m²/OTC. Điều tra định kỳ 10 ngày/lần liên tục trong 3 tháng cao điểm phát dịch (tháng 6, 7, 8). Mức độ bị hại của từng cây được chia theo 5 cấp:
| Cấp bị hại | Tỷ lệ tán lá bị hại | Đánh giá tính kháng |
|---|---|---|
| Cấp 0 | Tán lá không bị hại | Cây kháng sâu |
| Cấp 1 | < 25% tán lá bị hại | Bị hại nhẹ |
| Cấp 2 | 25% đến < 50% tán lá bị hại | Bị hại trung bình |
| Cấp 3 | 50% đến < 75% tán lá bị hại | Bị hại nặng |
| Cấp 4 | $\ge$ 75% tán lá bị hại | Cây mẫn cảm |
Tỷ lệ cây bị hại ($P%$) và chỉ số bị hại bình quân ($R$) của ô tiêu chuẩn được tính toán: $$P% = \frac{n}{N} \times 100$$ $$R = \frac{\sum_{i=1}^{4} (n_i \times v_i)}{N}$$ Trong đó $n$ là số cây bị hại, $N$ là tổng số cây điều tra, $n_i$ là số cây bị hại ở cấp $i$, $v_i$ là trị số của cấp bị hại thứ $i$. Lâm phần được xếp loại: $R < 1$ (kháng sâu), $1 \le R \le 2$ (bị hại nhẹ), $R > 2$ (mẫn cảm).
- Phương pháp chọn cây trội: Cây được chọn phải có cấp bị hại bằng 0 trong các OTC có $R < 1$ và đáp ứng Tiêu chuẩn ngành 04 TCN 147-2006: vượt trị số trung bình lâm phần $\ge 25%$ về đường kính thân ($D_{1.3}$), $\ge 10%$ về chiều cao vút ngọn ($H_{vn}$) và $\ge 15%$ về sản lượng nhựa hứng trong 24 giờ bằng phương pháp đẽo máng (Hà Huy Thịnh và Trần Cước, 1997).
- Phương pháp giải phẫu và thử nghiệm sinh thái học côn trùng: Cắt lát mỏng tại vị trí 1/3 phía đầu lá để đo đếm kích thước lớp cutin, biểu bì, hạ bì và mô đồng hóa dưới kính hiển vi. Nuôi sinh học 30 sâu non/lồng riêng rẽ bằng lá cây kháng và cây mẫn cảm; theo dõi tập tính đẻ trứng của bướm trưởng thành và khả năng ăn của sâu non mới nở trong lồng kép (2 cành kháng + 2 cành mẫn cảm, lặp lại 3 lần).
- Phương pháp phân tích hóa sinh và sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS): Thử định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng thuốc thử đặc trưng:
| STT | Nhóm hợp chất | Phản ứng thử đặc trưng |
|---|---|---|
| 1 | Sterol, tecpen | Phản ứng Liebermann-Burchard |
| 2 | Hợp chất tạo kết tủa trên giấy lọc | NaOH, $\text{FeCl}_3$ |
| 3 | Flavonoid | Phản ứng Diazo, Shinoda |
| 4 | Saponin | Thử nghiệm tạo bọt |
| 5 | Alcaloid | Thuốc thử Dragendorff |
| 6 | Tanin | Thuốc thử $\text{FeCl}_3$ |
Chưng cất lôi cuốn hơi nước 400 g lá Thông nhựa bằng bộ định lượng Clevenger (lặp lại 2 lần/mẫu). Tinh dầu tách được phân tích thành phần trên hệ thống GC/MS Agilent 6890N ghép đầu dò khối phổ 5975N; cột mao quản HP5-MS (30 m $\times$ 0,25 mm $\times$ 0,25 µm), khí mang Heli, nhiệt độ buồng tiêm 260°C, tỷ lệ chia dòng 100:1, thể tích tiêm 1 µl, chương trình nhiệt 60–240°C (tăng 4°C/phút). Định danh hợp chất bằng thư viện phổ chuẩn NIST98, Wiley275 và HPCH1607.
- Phương pháp phân lập và định danh vi sinh vật nội sinh: Mẫu lá được khử trùng bề mặt bằng natri hypoclorit và cồn 70–75% (Miche & Balandreau, 2001), rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng. Cấy mô lá lên môi trường thạch PDA (khoai tây 200 g, D-glucose 20 g, agar 15–18 g, nước cất 1.000 ml) ủ ở 28°C để phân lập nấm; môi trường King’s B (pepton 20 g, agar 16 g, $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 1,5 g, $\text{MgSO}_4$ 1,5 g, nước cất 1.000 ml) và đệm PBS (pH 7,2) để phân lập vi khuẩn. Định lượng mật độ vi khuẩn theo đơn vị CFU/g. Định danh chủng VSV nội sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, giải trình tự gen).
- Phương pháp phân tích đa dạng di truyền ADN: Tách chiết ADN tổng số từ 45 mẫu lá Thông nhựa, đo độ hấp thụ quang học OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD với các mồi OPC2, OPC20, OPE11, OPE15 và kỹ thuật microsatellite SSR/cpSSR với cặp mồi Seq10E10; điện di trên gel polyacrylamide và agarose. Tính hệ số thông tin đa hình (PIC), số alen, tỷ lệ khuyết số liệu và lập sơ đồ quan hệ di truyền.
- Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm thống kê sinh học SPSS để phân tích phương sai, kiểm định Fpr, LSD và tính hệ số tương quan ($r$).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu
Chương 1 tổng hợp toàn diện bối cảnh dịch tễ học của Sâu róm thông (Dendrolimus punctatus) tại Trung Quốc và Việt Nam. Phân tích chi tiết quy luật phát sinh: tại miền Bắc (Quảng Ninh, Bắc Giang) sâu có 3–4 thế hệ/năm; tại miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh) sâu phát triển 4–5 thế hệ/năm với các đỉnh cao mật độ sâu non vào các tháng 3, 6, 8, 10 và 12. Chương này điểm luận các biện pháp phòng trừ từ hóa học sang sinh học (nấm Beauveria bassiana, ong Trichogramma dendrolimi, virus NPV, nhặng Tachinidae), chỉ ra hạn chế của các giải pháp cục bộ và khẳng định hướng tiếp cận chọn giống cây rừng kháng sâu bệnh kết hợp năng suất nhựa cao là giải pháp có tính bền vững.
Chương 2: Địa điểm - Thời gian - Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 trình bày chi tiết điều kiện tự nhiên tại 3 vùng nghiên cứu:
- Hà Trung (Thanh Hóa): Nhiệt độ bình quân 23°C (cao nhất 41°C, thấp nhất 6°C), tổng nhiệt năm 8.500–8.700°C; lượng mưa bình quân 1.600–1.800 mm/năm (tập trung tháng 8–10); diện tích đất lâm nghiệp 5.430,78 ha.
- Quỳnh Lưu (Nghệ An): Nhiệt độ bình quân 23,7°C; lượng mưa bình quân 1.605,5 mm/năm; rừng trồng gần 12.000 ha (Thông nhựa chiếm gần 3.000 ha).
- Can Lộc (Hà Tĩnh): Nhiệt độ bình quân 23,5°C (cao nhất 39,7°C, thấp nhất 7°C); lượng mưa bình quân 2.400 mm/năm; diện tích rừng 4.490,11 ha (rừng trồng 3.746,02 ha).
Chương 2 mô tả hệ thống phương pháp từ điều tra 15 OTC (1.000 m²/OTC), tiêu chuẩn chọn cây trội theo 04 TCN 147-2006, giải phẫu hiển vi lá, gây nuôi côn trùng đánh giá tập tính, chưng cất và phân tích GC/MS tinh dầu, phân lập định lượng VSV nội sinh trên môi trường PDA, King’s B, PBS, đến phân tích chỉ thị phân tử RAPD và SSR-PCR.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Chương 3 là phần thực nghiệm trọng tâm với các phát hiện chính:
- Kết quả tuyển chọn cây trội: Từ 15 OTC, tuyển chọn được 30 cá thể Thông nhựa kháng SRT (cấp bị hại = 0, chỉ số $R < 1$) có sản lượng nhựa vượt trội: vượt từ 16,87% đến 74,55% so với trung bình lâm phần kháng và vượt từ 122,29% đến 302,76% so với trung bình lâm phần mẫn cảm.
- Sai khác về hình thái và giải phẫu giữa cây kháng (KH) và mẫn cảm (MC):
- Hình thái thân và tán: Cây kháng có góc phân cành hẹp (35–60° so với thân chính), cành mọc chếch hướng lên hình chữ Y; cành thưa, ít lá, lá tập trung ở đầu cành; rất ít nón quả (thậm chí không có quả), quả ít hạt; vỏ thân nứt sâu, dày và màu xám đen. Cây mẫn cảm có góc phân cành lớn, tán rậm, nhiều cành ngang và nhiều nón quả.
- Hình thái và cấu tạo lá: Lá cây kháng có màu xanh đậm hơn, cứng hơn, chiều dài ngắn hơn lá cây mẫn cảm. Mặt cắt giải phẫu cho thấy tầng cutin, lớp tế bào biểu bì, hạ bì và mô đồng hóa ở lá cây kháng dày hơn rõ rệt so với lá cây mẫn cảm ở cả 3 giai đoạn lá non, lá bánh tẻ và lá già.
- Phản ứng sinh học của Sâu róm thông:
- Khi nuôi bằng lá cây kháng, sâu non có tỷ lệ sống thấp, thời gian phát triển kéo dài, nhộng thu được có khối lượng nhỏ hoặc chết trước khi hóa nhộng.
- Trong thí nghiệm lựa chọn thức ăn, sâu non mới nở không ưa thích lá cây kháng, có xu hướng bò tìm sang lá mẫn cảm hoặc nhả tơ phát tán.
- Bướm trưởng thành cái tập trung đẻ trứng trên lá cây mẫn cảm (hoặc thành lồng nuôi), rất ít khi đẻ trứng trên lá cây kháng.
- Phân tích hóa sinh tinh dầu lá:
- Kết quả GC/MS xác định thành phần monoterpene có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm cây:
| Nhóm hợp chất chính | Cây kháng sâu (KH) | Cây mẫn cảm (MC) |
|---|---|---|
| $\Delta$-3-Carene ($\text{Carene } \langle\text{D-3-}\rangle$) | Tỷ lệ rất cao | Tỷ lệ thấp |
| $\alpha$-Pinene ($\text{Pinene } \langle\text{a-}\rangle$) | Tỷ lệ thấp | Tỷ lệ cao |
- Đồ thị và phân tích tương quan chỉ ra mối tương quan thuận chặt chẽ ($r > 0$) giữa sản lượng nhựa thực tế và tỷ lệ phần trăm hợp chất $\Delta$-3-Carene trong tinh dầu lá Thông nhựa tại cả Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh.
- Thành phần và mật độ vi sinh vật nội sinh (VSVNS):
- Phân lập được số lượng chủng nấm và vi khuẩn nội sinh từ lá cây kháng cao hơn nhiều so với cây mẫn cảm.
- Mật độ bào tử vi khuẩn nội sinh ở lá cây kháng vượt trội so với lá cây mẫn cảm:
| Chủng vi khuẩn nội sinh | Mật độ ở lá cây kháng (CFU/g) | Chủng vi khuẩn nội sinh | Mật độ ở lá cây mẫn cảm (CFU/g) |
|---|---|---|---|
| Chủng KT17 (cao nhất) | $8,6 \times 10^8$ | Chủng KT11 (cao nhất) | $1,3 \times 10^5$ |
| Chủng KT14 (thấp nhất) | $3,7 \times 10^5$ | Chủng KT19 (thấp nhất) | $4,3 \times 10^4$ |
- Định danh sinh học phân tử xác định các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng và làm biến đổi tập tính ăn của sâu non mới nở.
- Đa dạng di truyền nguồn gen bằng chỉ thị phân tử:
- Tách chiết ADN tổng số từ 45 mẫu đạt độ tinh sạch chuẩn (đo quang bước sóng 260/280 nm).
- Phân tích đa hình với các cặp mồi RAPD (OPC2, OPC20, OPE11, OPE15) và SSR (Seq10E10) xác định hệ số PIC cao, tỷ lệ khuyết số liệu thấp.
- Sơ đồ quan hệ di truyền (dendrogram) phân chia 42 mẫu Thông nhựa thành 3 nhóm lớn:
- Nhóm I: Gồm 2 cây, có khoảng cách di truyền nội nhóm là 0,30 và khoảng cách so với 2 nhóm còn lại là 0,35.
- Nhóm II: Gồm 12 cây, được phân chia thành 2 phân nhóm.
- Nhóm III: Gồm 28 cây, có khoảng cách di truyền nội nhóm khoảng 0,49, được chia thành 5 phân nhóm.
- Đánh giá ở vườn vật liệu và khảo nghiệm hậu thế:
- Cây ghép vô tính tại vườn giống và các gia đình khảo nghiệm hạt tại Hà Trung (Thanh Hóa), Nam Đàn (Nghệ An), Can Lộc (Hà Tĩnh) và Vĩnh Phúc duy trì sinh trưởng tốt, giữ vững tính kháng sâu và tỷ lệ bị hại do SRT thấp hơn rõ rệt so với đối chứng đại trà.
Chương 4: Thảo luận - Tồn tại và kiến nghị
Chương 4 thảo luận, đối chiếu các phát hiện với y văn quốc tế; nêu các tồn tại về mặt thời gian khảo nghiệm chu kỳ dài của cây thân gỗ lâu năm và đưa ra các kiến nghị ứng dụng nguồn giống tuyển chọn vào thực tiễn sản xuất lâm nghiệp.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống, chi tiết đầu tiên tại Việt Nam làm sáng tỏ cơ sở khoa học về tính kháng Sâu róm thông của cây Thông nhựa (Pinus merkusii).
- Thiết lập cơ sở dữ liệu khoa học về mối liên hệ giữa tính kháng SRT với phức hợp các chỉ tiêu:
- Chỉ tiêu giải phẫu: Độ dày tầng cutin và mô đồng hóa lá.
- Chỉ tiêu sinh hóa: Tỷ lệ cao của hợp chất $\Delta$-3-Carene và tỷ lệ thấp của $\alpha$-Pinene trong tinh dầu lá.
- Chỉ tiêu vi sinh vật học: Mật độ bào tử vi khuẩn nội sinh cao (chủng KT17 đạt tới $8,6 \times 10^8$ CFU/g).
- Mối tương quan thuận chặt giữa sản lượng nhựa và hàm lượng chất $\Delta$-3-Carene.
- Xác lập cơ cấu phân nhóm di truyền của nguồn gen Thông nhựa kháng và mẫn cảm SRT tại khu vực Bắc Trung Bộ thông qua chỉ thị RAPD và SSR.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn
- Tuyển chọn được 30 cá thể Thông nhựa kháng SRT tại 3 tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh có sản lượng nhựa vượt trội từ 16,87% đến 74,55% so với trung bình lâm phần kháng, và vượt từ 122,29% đến 302,76% so với trung bình lâm phần mẫn cảm.
- Xây dựng thành công hệ thống vườn vật liệu nhân giống sinh dưỡng (cây ghép) và các khu khảo nghiệm hậu thế (gieo ươm từ hạt cây mẹ kháng sâu) tại Hà Trung, Nam Đàn, Can Lộc và Vĩnh Phúc, tạo nguồn vật liệu di truyền phục vụ trực tiếp cho các chương trình trồng rừng phòng hộ kết hợp khai thác nhựa.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất
- Sử dụng các đặc điểm hình thái (góc cành chữ Y 35–60°, lá ngắn cứng xanh đậm, vỏ nứt dày) và chỉ số sinh hóa ($\Delta$-3-Carene) làm tiêu chí sàng lọc sớm cây giống Thông nhựa kháng sâu.
- Khai thác 30 cây trội đã tuyển chọn để nhân giống phục vụ trồng rừng thay thế tại các vùng trọng điểm thường xuyên phát sinh dịch SRT ở miền Trung.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Theo nội dung văn bản luận án:
- Phạm vi thu thập vật liệu và khảo nghiệm tập trung chủ yếu tại 3 tỉnh Bắc Trung Bộ (Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh) và một điểm tại Vĩnh Phúc; chưa bao quát toàn bộ các vùng lập địa trồng Thông nhựa khác trên toàn quốc.
- Thời gian theo dõi khảo nghiệm hậu thế và vườn vật liệu mới ở giai đoạn đầu sinh trưởng; trong khi Thông nhựa có chu kỳ khai thác đẽo máng kéo dài 40–50 năm, đòi hỏi tiếp tục theo dõi độ ổn định về năng suất nhựa và tính kháng qua các cấp tuổi lớn hơn.
- Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về độc tính sinh học và cơ chế phân tử của từng chủng vi khuẩn nội sinh cụ thể (đặc biệt là chủng KT17) trong mối tương tác đa tầng: cây chủ – vi sinh vật nội sinh – sâu róm thông.
Giá trị tham khảo
Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Lâm sinh, Bảo vệ thực vật, Di truyền và Chọn giống cây rừng: Tham khảo phương pháp tiếp cận đa ngành kết hợp sinh thái côn trùng, giải phẫu thực vật, sắc ký khí GC/MS, vi sinh vật nội sinh và chỉ thị phân tử ADN (RAPD, SSR) trong chọn giống cây rừng kháng sinh vật gây hại.
- Cán bộ quản lý kỹ thuật lâm nghiệp, các Công ty TNHH lâm nghiệp, Ban quản lý rừng phòng hộ: Ứng dụng quy trình điều tra phân cấp bị hại theo 5 cấp, bảng tiêu chí nhận diện nhanh cây kháng sâu qua góc phân cành và hình thái lá, cùng kỹ thuật tuyển chọn cây trội nhựa cao theo Tiêu chuẩn ngành 04 TCN 147-2006.
Câu hỏi thường gặp
1. Chỉ số bị hại bình quân ($R$) được phân cấp như thế nào để xác định lâm phần kháng sâu?
Chỉ số bị hại bình quân ($R$) được tính theo công thức: $$R = \frac{\sum_{i=1}^{4} (n_i \times v_i)}{N}$$ Trong đó $n_i$ là số cây bị hại ở cấp $i$ ($v_i$ từ 1 đến 4), $N$ là tổng số cây điều tra. Lâm phần được phân loại theo 3 mức:
- $R < 1$: Kháng sâu (được lựa chọn để tuyển chọn cây trội).
- $1 \le R \le 2$: Bị hại nhẹ.
- $R > 2$: Mẫn cảm với sâu hại.
2. Cây Thông nhựa kháng SRT có đặc điểm hình thái và cấu tạo lá khác biệt gì so với cây mẫn cảm?
- Góc phân cành: Cây kháng có góc cành nhỏ (35–60° so với thân), cành mọc chếch hướng lên hình chữ Y, ít cành, ít lá, lá tập trung đầu cành, vỏ thân nứt dày xám đen, rất ít nón quả. Cây mẫn cảm có góc cành rộng, tán rậm rạp, nhiều cành ngang và nhiều quả.
- Cấu tạo lá: Lá cây kháng có màu xanh đậm hơn, cứng và ngắn hơn. Lớp cutin, biểu bì, hạ bì và mô đồng hóa ở lá cây kháng dày hơn rõ rệt so với lá cây mẫn cảm.
3. Sự khác biệt về thành phần hóa sinh tinh dầu lá giữa cây kháng và cây mẫn cảm là gì?
Phân tích GC/MS cho thấy lá cây kháng có tỷ lệ hợp chất $\Delta$-3-Carene ($\text{Carene } \langle\text{D-3-}\rangle$) cao vượt trội và tỷ lệ $\alpha$-Pinene ($\text{Pinene } \langle\text{a-}\rangle$) thấp hơn so với lá cây mẫn cảm. Luận án khẳng định mối tương quan giữa sản lượng nhựa và tỷ lệ chất $\Delta$-3-Carene là tương quan thuận chặt.
4. Mật độ vi khuẩn nội sinh trong lá cây kháng và cây mẫn cảm chênh lệch như thế nào?
Mật độ bào tử vi khuẩn nội sinh ở lá cây kháng cao hơn rất nhiều so với lá cây mẫn cảm:
- Ở lá cây kháng: Mật độ cao nhất đạt $8,6 \times 10^8$ CFU/g (chủng KT17) và thấp nhất đạt $3,7 \times 10^5$ CFU/g (chủng KT14).
- Ở lá cây mẫn cảm: Mật độ cao nhất chỉ đạt $1,3 \times 10^5$ CFU/g (chủng KT11) và thấp nhất là $4,3 \times 10^4$ CFU/g (chủng KT19).
5. Kết quả phân tích chỉ thị phân tử ADN chia các mẫu Thông nhựa thành mấy nhóm di truyền?
Phân tích đa hình ADN bằng chỉ thị RAPD (mồi OPC2, OPC20, OPE11, OPE15) và SSR (cặp mồi Seq10E10) trên 42 mẫu Thông nhựa đã chia nguồn gen thành 3 nhóm lớn:
- Nhóm I: Gồm 2 cây, khoảng cách di truyền nội nhóm là 0,30 và so với 2 nhóm còn lại là 0,35.
- Nhóm II: Gồm 12 cây, chia thành 2 phân nhóm.
- Nhóm III: Gồm 28 cây, khoảng cách di truyền nội nhóm khoảng 0,49, chia thành 5 phân nhóm.
Kết luận
Luận án của tác giả Đào Ngọc Quang đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xác định cơ sở khoa học về tính kháng Sâu róm thông (Dendrolimus punctatus) của cây Thông nhựa (Pinus merkusii) tại khu vực miền Trung Việt Nam. Công trình chứng minh tính kháng sâu gắn liền với cấu trúc cành chữ Y, tầng mô đồng hóa và lớp cutin dày, hàm lượng $\Delta$-3-Carene cao trong tinh dầu lá, cùng mật độ vi khuẩn nội sinh vượt trội. Việc tuyển chọn thành công 30 cá thể cây trội kháng sâu có sản lượng nhựa vượt 16,87–74,55% so với lâm phần kháng và xây dựng các mô hình khảo nghiệm hậu thế là đóng góp thực tiễn quan trọng cho công tác phát triển rừng Thông nhựa bền vững.