ĐẶT VẤN ĐỀ Chitosan là chế phẩm sinh học, được hình thành từ quá trình deacetyl hóa chitin, có nhiều ở các loại giáp xác. Sản xuất chitosan không những góp phần làm giảm ảnh hưởng đến môi trường từ các phế liệu thủy sản mà còn tạo giá trị kinh tế lớn hơn. Chitosan có các tính chất quan trọng, như là chất phụ gia thực phẩm, tạo màng bao gói, khả năng kháng khuẩn, làm giảm quá trình thoát hơi nước của sản phẩm ở mọi điều kiện trong bảo quản và đặc biệt không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng, vì thế chitosan đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Bạc được biết đến như một trong những nguyên tố có khả năng khử trùng mạnh tồn tại trong tự nhiên.
Các đây 200 năm các nhà khoa học đã xem huyết thanh người như là một dịch keo, vì vậy keo bạc đã được sử dụng làm chất kháng khuẩn ngay trong cơ thể con người. Kể từ đó keo bạc được sử dụng rộng rãi để chữa các bệnh nấm trên da, điều trị các vết thương, vết bỏng, các bệnh răng miệng, làm thuốc nhỏ mắt. Tuy nhiên, sau khi thuốc kháng sinh được phát minh (giữa thế kỉ 20) với hiệu lực khử trùng mạnh hơn, keo bạc đã bị thay thế dần. Nhưng chỉ 30 năm sau đó người ta đã nhận ra rằng có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng chống lại những tác dụng của thuốc kháng sinh và vấn đề này ngày càng trở nên đáng lo ngại.
Lúc này tính năng kháng khuẩn của bạc lại được chú ý do có phổ tác dụng rộng và không bị hạn chế bởi hiệu ứng kháng thuốc [31, 23]. Ngày nay, việc tạo ra các vật thể kích thước nano đã trở nên phổ biến, ở kích thước này các hạt vật chất thể hiện nhiều tính chất lý-hóa khác thường so với khi vật chất đó ở trạng thái khối, khả năng kháng khuẩn của nó cao hơn 20-60 ngàn lần so với ion Ag+ [10]. Các hạt nano bạc với năng lượng bề mặt lớn có khả năng giải phóng từ từ các ion bạc vào trong dung dịch, nhờ vậy nano bạc có hiệu lực khử khuẩn mạnh hơn rất nhiều lần và kéo dài hơn so với các bạc ở dạng keo, dạng ion hay dạng rắn [31, 24]. Chính những tính chất lượng tử đặc biệt này nên nano bạc sẽ bị biến thể trong gian bảo quản, để ổn định được nó cần phải có một phương pháp chế tạo đặc biệt giúp cho khả năng sử dụng được triệt để hơn.
Dựa vào đặc tính quý giá trên, ý tưởng kết hợp hai loại vật liệu đã được hình thành. Chitosan loại chế phẩm có khả năng kháng khuẩn, không gây độc và có khả năng tạo thành lớp màng mỏng bao quanh thực phẩm. Nano bạc, là vật liệu có khả n 2 năng kháng khuẩn cực mạnh chỉ với nồng độ rất nhỏ, nhưng lại dễ bị oxi hóa. Khi sử dụng kết hợp với nhau sẽ cho ra 1 hỗn hợp dung dịch bền vững có hoạt tính mạnh để ứng dụng rộng rãi trong sản xuất.
Vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus đều là vi khuẩn Gram dương là hai loài vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên (Đất, nước, cơ thể người, động vật …), loài vi khuẩn tồn tại rất phổ biến trong nông sản và thực phẩm. Chúng là những tác nhân gây ra các vụ ngộ độc trong thực phẩm trên khắp cả nước trong thời gian qua. Chính vì sự phổ biến và tác hại nguy hiểm của nó đối với con người nên chúng tôi đã tập trung toàn bộ thời gian làm khóa luận của mình “Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Gram dương của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc”. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.
Mục đích - Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. - Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. - Nghiên cứu kết hợp được chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. Yêu cầu - Tìm ra sự kết hợp tối ưu kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.
- Đánh giá kết quả kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế. Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn.
Ý nghĩa thực tiễn - Hiện nay nano bạc và chitosan được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm, nông nghiệp, xử lí môi trường… - Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc ứng dụng trong bảo quản các loại thực phẩm. n 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN 2. Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan 2.
Lịch sử và nguồn gốc chitin/chitosan Về mặt lịch sự, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811, trong cặn dịch chiết từ một loài nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1923, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là “chitin” hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose.
Sự xuất hiện của nitơ trong chitin đã được Lassaige chứng minh vào năm 1843, từ đó nhân loại bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng lâu dài hợp chất này và các dẫn xuất của nó [25]. Ở động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn. Ở động vật bậc cao, monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo,…[6].
Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan – dẫn xuất của chitin được xem là polymer tự nhiên quan trọng, nhiều thứ hai sau cellulose, các nghiên cứu đã cho thấy chitosan có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm,… Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, không giống chất xơ thực vật, chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất cấu trúc quang học,… Chitosan còn là chất cao phân tử mang điện tích dương duy nhất trong tự nhiên, nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và axit. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm, các polymer có nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan được coi như một vật liệu mới có ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dược, y học, xử lý nước thải và trong công nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, ổn định hay tác nhân kháng khuẩn,… n 4 Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin – chitosan chiếm khá cao, dao động từ 14 – 34% so với trọng lượng khô [35].
Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan. Một số loài giáp xác chứa chitin 2. Cấu trúc hóa học của chitosan Công thức cấu tạo của chitin: Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Chitin Chitosan thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin, thay thế nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [3].
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitosan: n 5 C H 2O H C H 2O H O O H H H O H O OH H OH H H H H NH2 H N H C O C H3 Hình m n 2.3: Cấu trúc hóa học của Chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp [1]. Tính chất cơ bản của chitosan 2.
Tính chất vật lý a. Đặc tính bề ngoài: Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng ngà, không mùi, không vị, có thể xay nhỏ ở các kích thước khác nhau. Nhiệt độ nóng chảy: Nóng chảy ở 309 - 311oC tùy vào trọng lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa. Mức độ deacetyl hóa: Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao.
Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi nó ảnh hưởng đến tính chất lý hóa, khả năng ứng dụng của chitosan [6]. Mức độ deacetyl hóa vào khoảng 70 - 100% phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp sử dụng. Có nhiều phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan như: Thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ pH…. Trong đó phương pháp sử dụng hồng ngoại thường được sử dụng để thiết lập các giá trị mức độ deacetyl hóa của chitosan.
Khi ở mức độ deacetyl hóa thấp, chitosan có khả năng hút ẩm lớn do vậy trước khi phân tích chitosan cần phải sấy [26]. Trọng lượng phân tử: Chitosan là polyme sinh học có khối lượng phân tử cao khoảng 10000-1200000Da tùy theo điều kiện sản xuất. Thông thường khi nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan. Trọng lượng phân tử khác nhau dẫn đến đặc tính của từng loại chitosan là khác nhau, người ta thường phân loại chitosan dựa vào trọng lượng phân tử.
Trọng lượng phân tử có thể xác định bằng phương pháp sắc ký, phân tán ánh sáng hoặc đo độ nhớt [37, 29]. Độ nhớt: Độ nhớt là nhân tố quan trọng dể xác định khối lượng phân tử của chitosan [1, 36]. Chitosan có phân tử lượng lớn làm cho dung dịch có độ nhớt cao.