Luận văn thạc sĩ: Khả năng kháng vi khuẩn gram dương của chế phẩm chitosan nano bạc

Chitosan là một polymer tự nhiên được chiết xuất từ chitin, có mặt chủ yếu trong vỏ của các loài giáp xác. 53 trang · Đại học Nông Lâm Thái Nguyên · 2014.

• Tác giả: Nguyễn Lâm Thái
• Người hướng dẫn: Lương Hùng Tiến
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Gram dương của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN
• 2.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan
• 2.1.2. Tính chất cơ bản của chitosan
• 2.1.3. Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động kháng khuẩn của chitosan
• 2.1.4. Các ứng dụng của chitosan trong cuộc sống
• 2.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NANO BẠC
• 2.2.1. Lịch sử hình thành của công nghệ nano
• 2.2.2. Cơ sở khoa học của công nghệ nano
• 2.2.3. Giới thiệu về hạt nano bạc
• 2.2.4. Ứng dụng của nano bạc trong cuộc sống
• 2.3. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN
• 2.3.1. Khái niệm chung về vi khuẩn
• 2.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
• 2.3.3. Vi khuẩn Bacillus cereus
• 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. Chủng vi sinh vật thí nghiệm
• 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị và môi trường sử dụng thí nghiệm
• 3.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.4.2. Phương pháp phân tích
• 3.4.3. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG
• 4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA CHITOSAN ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG
• 4.3. LỰA CHỌN CÔNG THỨC PHỐI TRỘN CHITOSAN VỚI NANO BẠC
• 4.4. Xác định khả năng kháng B. cereus của phức chất chitosan/nano bạc
• 4.5. Xác định khả năng kháng S. aureus của phức chất chitosan/nano bạc
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về chitosan

Chitosan là một polymer tự nhiên được chiết xuất từ chitin, có mặt chủ yếu trong vỏ của các loài giáp xác. Chitosan có nhiều tính chất đặc biệt, bao gồm khả năng kháng khuẩn, không độc hại và khả năng tạo màng. Những đặc tính này đã khiến chitosan trở thành một vật liệu quan trọng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và nông nghiệp. Nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn gram dương. Việc sử dụng chitosan trong các ứng dụng thực tiễn không chỉ giúp bảo quản thực phẩm mà còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ phế liệu thủy sản. Chitosan có thể được sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm, tạo màng bao gói, và có khả năng làm giảm quá trình thoát hơi nước của sản phẩm trong bảo quản.

1.1. Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan được hình thành từ quá trình deacetyl hóa chitin, một polysaccharide có mặt trong vỏ của nhiều loài giáp xác. Cấu trúc hóa học của chitosan bao gồm các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Đặc điểm này giúp chitosan có khả năng tạo màng và kết hợp với các chất khác, tạo ra nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Đặc biệt, chitosan có khả năng hấp thụ nước và chất béo cao, làm cho nó trở thành một vật liệu lý tưởng trong việc bảo quản thực phẩm và làm giảm cholesterol trong máu.

II. Giới thiệu về nano bạc

Nano bạc là một dạng của bạc có kích thước nano, được biết đến với khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ. Các hạt nano bạc có diện tích bề mặt lớn, cho phép chúng giải phóng ion bạc vào môi trường một cách từ từ, tạo ra hiệu quả khử khuẩn cao hơn so với bạc ở dạng keo hay ion. Nghiên cứu cho thấy nano bạc có khả năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus và Bacillus cereus. Việc sử dụng nano bạc trong các ứng dụng y tế và bảo quản thực phẩm đang ngày càng trở nên phổ biến, nhờ vào tính năng kháng khuẩn vượt trội và khả năng không gây kháng thuốc.

2.1. Ứng dụng của nano bạc trong cuộc sống

Nano bạc được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ y tế đến công nghiệp thực phẩm. Trong y tế, nano bạc được sử dụng để điều trị vết thương, ngăn ngừa nhiễm trùng và khử trùng thiết bị y tế. Trong ngành thực phẩm, nano bạc có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kéo dài thời gian sử dụng và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn gây hại. Sự kết hợp giữa chitosan và nano bạc tạo ra một chế phẩm có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các sản phẩm an toàn và hiệu quả cho sức khỏe con người.

III. Khả năng kháng vi khuẩn gram dương của chitosan nano bạc

Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn gram dương của chế phẩm phối hợp chitosan và nano bạc cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả cao trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn như Staphylococcus aureus và Bacillus cereus. Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan và nano bạc đối với các vi khuẩn này thấp hơn so với khi sử dụng từng thành phần riêng lẻ. Điều này chứng tỏ rằng sự kết hợp giữa chitosan và nano bạc không chỉ tăng cường khả năng kháng khuẩn mà còn tạo ra một sản phẩm an toàn cho sức khỏe con người.

3.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn gram dương là rất thấp, cho thấy tính hiệu quả cao của nano bạc trong việc tiêu diệt vi khuẩn. Tương tự, chitosan cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ. Sự kết hợp giữa hai thành phần này tạo ra một chế phẩm có khả năng kháng khuẩn vượt trội, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong y tế. Việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu là một bước quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của chế phẩm và khả năng ứng dụng thực tiễn của nó.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm, kiểm soát sự nhiễm khuẩn và ngộ độc thực phẩm là một trong những thách thức hàng đầu. Hai loài vi khuẩn Gram dương phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, cơ thể người và động vật) cũng như phổ biến trong thực phẩm là Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. Đây là những tác nhân thường xuyên gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng. Trong khi S. aureus sản sinh các ngoại độc tố và độc tố ruột (enterotoxin) chịu nhiệt gây viêm nhiễm và nhiễm độc thức ăn, thì B. cereus có khả năng sinh bào tử và tiết các độc tố gây nôn mửa, tiêu chảy nguy hiểm. Việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp trong thời gian dài đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở nhiều chủng vi sinh vật, thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất kháng khuẩn tự nhiên, an toàn và có khả năng phân hủy sinh học.

Chitosan là polymer sinh học thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin – thành phần dồi dào trong phế liệu thủy sản như vỏ tôm, cua, ghẹ. Hợp chất này sở hữu các đặc tính quý giá: không độc hại, tương thích sinh học, có khả năng tạo màng bao gói hạn chế thoát hơi nước và có hoạt tính kháng vi sinh vật. Song song đó, nano bạc là vật liệu có hoạt tính kháng khuẩn mạnh ngay ở nồng độ thấp nhờ diện tích bề mặt lớn và khả năng giải phóng ion bạc kéo dài, nhưng lại dễ bị oxy hóa hoặc mất tính ổn định theo thời gian nếu không có chất bao phủ phù hợp. Việc nghiên cứu kết hợp giữa chitosan (vừa có tính kháng khuẩn, vừa đóng vai trò chất mang/chất bảo vệ màng) và nano bạc được đặt ra nhằm tạo thành phức hệ ổn định, nâng cao hiệu quả ức chế vi khuẩn và tối ưu hóa lượng vật liệu sử dụng.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Lâm Thái (chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, năm 2014) được thực hiện với các mục tiêu và yêu cầu cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu:
  1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus.
  2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus.
  3. Nghiên cứu kết hợp chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus.
• Yêu cầu nghiên cứu:
  1. Tìm ra sự kết hợp tối ưu kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.
  2. Đánh giá kết quả kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: Dung dịch chitosan, dung dịch nano bạc 100 ppm, chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc; hai chủng vi khuẩn kiểm định gồm Staphylococcus aureus subsp. và Bacillus cereus ATCC®13061™.
  • Địa điểm thực hiện: Phòng Nghiên cứu Vi sinh vật, Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ sở khoa học

Khóa luận tổng quan và vận dụng các cơ sở lý thuyết chuyên ngành công nghệ sinh học và vật liệu nano:

• Cơ sở lý thuyết về Chitosan: Chitosan là polymer sinh học mạch thẳng cấu tạo từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-$\beta$-D-glucopyranose liên kết qua cầu nối $\beta$-(1-4) glucoside, thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin (khi độ deacetyl DD > 50%). Chitosan mang điện tích dương duy nhất trong tự nhiên ở môi trường acid loãng (pH < 6) do proton hóa nhóm amin ($-NH_3^+$). Cơ chế kháng khuẩn của chitosan chủ yếu dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các cation $-NH_3^+$ và điện tích âm trên màng tế bào vi khuẩn, làm thay đổi tính thấm, rò rỉ các thành phần nội bào và ức chế quá trình hấp thu dưỡng chất. Đồng thời, các nhóm chức chứa cặp electron tự do của oxy và nitơ trên mạch chitosan có khả năng tạo phức liên kết với ion kim loại.
• Cơ sở lý thuyết về Nano bạc: Hạt nano bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm, sở hữu tỷ số diện tích bề mặt trên thể tích rất lớn, đặc trưng bởi hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR) với đỉnh hấp thụ quang phổ UV-Vis nằm trong vùng 400 – 460 nm. Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc dựa trên việc giải phóng liên tục các ion $Ag^+$, tương tác mạnh với lớp peptidoglycan của thành tế bào, vô hiệu hóa các enzyme hô hấp/chuyển hóa oxy có chứa nhóm sunfhydryl ($-SH$) và gắn kết với gốc phosphat làm bất hoạt cấu trúc DNA.
• Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn kiểm định:
  • Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng): Vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,8 – 1,0 $\mu$m, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, sinh enzyme coagulase và độc tố ruột enterotoxin bền nhiệt.
  • Bacillus cereus: Trực khuẩn Gram dương kích thước 0,5 $\times$ 2 – 4 $\mu$m, hiếu khí, có khả năng hình thành nội bào tử (nha bào), chịu đựng tốt các điều kiện bất lợi và sản sinh độc tố gây nôn (emetic toxin) cùng độc tố gây tiêu chảy (diarrhoeal toxin).

Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm vi sinh vật học theo các quy trình chuẩn hóa:

• Vật liệu và hóa chất: Chitosan do Viện CNSH – CNTP (Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội) cung cấp; dung dịch nano bạc nồng độ gốc 100 ppm do Phòng Nghiên cứu Vi sinh vật (Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên) cung cấp.
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường MP lỏng (gồm 3g cao thịt, 10g pepton, 5g NaCl, 1000ml nước cất) và môi trường MP rắn bổ sung 20g agar (MP 2% agar), hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C. Giống vi sinh vật được cấy chuyền bảo quản trên thạch nghiêng ở 37°C định kỳ 2 tuần/lần.
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Nồng độ MIC được định nghĩa trong nghiên cứu là nồng độ nhỏ nhất của chất kháng khuẩn có thể ức chế sự phát triển của $10^4$ CFU/ml vi sinh vật so với đối chứng.
  • Thí nghiệm xác định MIC của nano bạc: Huyền dịch vi khuẩn sau khi hoạt hóa 24 giờ được pha loãng bằng dung dịch nước muối sinh lý 0,85% đến mật độ $10^5$ CFU/ml. Trộn 0,1 ml huyền dịch vi khuẩn với 0,4 ml dung dịch nano bạc ở các nồng độ pha loãng liên tiếp (sau khi trộn đạt các nồng độ: 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,78125 ppm) và 0,5 ml môi trường MP lỏng. Mẫu đối chứng sử dụng nước khử ion (DI). Nuôi cấy ở 37°C trong 24 giờ trước khi định lượng vi sinh vật sống sót.
  • Thí nghiệm xác định MIC của Chitosan: Thực hiện tương tự với các nồng độ dung dịch chitosan pha loãng (nồng độ thử nghiệm cuối cùng đạt: 3000, 2000, 1500, 1000, 500, 250 ppm). Mẫu đối chứng sử dụng dung dịch đệm acetate.
• Phương pháp phối trộn xác định hoạt tính chế phẩm kết hợp: Bố trí phối trộn chitosan và nano bạc ở các mức nồng độ MIC và MIC/2 theo 4 công thức (CT1: Chitosan MIC/2 + Nano Ag MIC/2; CT2: Chitosan MIC/2 + Nano Ag MIC; CT3: Chitosan MIC + Nano Ag MIC/2; CT4: Chitosan MIC + Nano Ag MIC).
• Phương pháp phân tích vi sinh: Nhuộm Gram quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học; định lượng mật độ tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU/ml) trên đĩa petri theo công thức tính tổng số khuẩn lạc trên các độ pha loãng lặp lại.

---

Nội dung chính theo từng chương

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

Phần này trình bày lý do lựa chọn đề tài xuất phát từ yêu cầu bảo quản an toàn thực phẩm và tình trạng ngộ độc thực phẩm do hai loài vi khuẩn Gram dương phổ biến là Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. Tác giả nêu bật tính ưu việt của chitosan (nguồn gốc phế liệu thủy sản, không độc, có tính tạo màng) và nano bạc (hiệu lực kháng khuẩn cao hơn ion $Ag^+$ từ 20.000 – 60.000 lần, giải phóng ion kéo dài). Việc kết hợp hai vật liệu nhằm tạo ra hệ kháng khuẩn vừa bền vững, vừa an toàn sinh học. Phần mở đầu cũng xác định rõ 3 mục tiêu, 2 yêu cầu cụ thể, ý nghĩa khoa học trong việc rèn luyện kỹ năng thực nghiệm và ý nghĩa thực tiễn hướng tới ứng dụng bảo quản nông sản, thực phẩm.

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương tổng quan hệ thống hóa tài liệu về ba đối tượng chính và tình hình nghiên cứu liên quan:

• Về Chitosan: Lịch sử phát hiện từ năm 1811 (Braconnot), cấu trúc hóa học phân tử lượng dao động 10.000 – 1.200.000 Da, nhiệt độ nóng chảy 309 – 311°C, độ deacetyl hóa (DD từ 70 – 100%), độ tan trong acid hữu cơ loãng. Tài liệu phân tích các cơ chế kháng vi sinh vật (tương tác tĩnh điện màng tế bào, tạo phức ion kim loại, ức chế enzyme) và các yếu tố ảnh hưởng gồm trọng lượng phân tử, độ pH (hoạt tính tốt nhất ở pH = 5,0, mất hoạt tính ở pH = 9,0), nhiệt độ (tăng hiệu lực ở $\ge 37^\circ\text{C}$), cùng các ứng dụng trong y sinh, mỹ phẩm, thực phẩm.
• Về Nano bạc: Cơ sở vật lý hạt nano (hiệu ứng bề mặt, chuyển tiếp lượng tử, hiện tượng cộng hưởng Plasmon), tính chất quang học, phổ hấp thụ UV-Vis 400 – 460 nm, cơ chế diệt khuẩn qua tương tác nhóm $-SH$ và phá hủy peptidoglycan. Bảng số liệu tổng quan của tác giả chỉ ra mối quan hệ giữa kích thước hạt và tỷ số nguyên tử bề mặt (hạt 10 nm có 20% nguyên tử bề mặt, hạt 1 nm có tới 90% nguyên tử bề mặt với năng lượng bề mặt đạt $9,23 \times 10^{12}\text{ erg/mol}$).
• Về Vi khuẩn kiểm định: Phân loại học, đặc điểm nuôi cấy, hình thái và cơ chế sinh độc tố của S. aureus (tụ cầu vàng, sinh enterotoxin) và B. cereus (trực khuẩn sinh nha bào, tiết độc tố nôn và độc tố tiêu chảy).
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Điểm lại các công trình nghiên cứu về màng chitosan bảo quản rau quả tại ĐH Nông Lâm TP.HCM, màng chitosan-PVA bảo quản thịt bò tại ĐH Thủy sản Nha Trang; các nghiên cứu tổng hợp nano bạc bằng phương pháp chiếu xạ, khử hóa học tại Việt Nam; các công bố quốc tế về phức hệ Chitosan/Nano Ag trên tạp chí ISI/Elsevier.

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này mô tả chi tiết danh mục thiết bị, chủng giống vi sinh vật và các bước triển khai thực nghiệm:

• Vật liệu và thiết bị: Sử dụng nồi hấp thanh trùng, tủ sấy, tủ nuôi cấy, tủ cấy vô trùng, máy lắc, máy ly tâm, cân điện tử, kính hiển vi và hệ dụng cụ thủy tinh tại phòng thí nghiệm vi sinh.
• Quy trình thực nghiệm: Trình bày chi tiết cách pha loãng dịch vi khuẩn đến mật độ chuẩn $10^5\text{ CFU/ml}$, các bước pha loãng hóa chất và bố trí môi trường MP.
• Phương pháp xác định: Nhuộm Gram (tím tinh thể 60s, lugol 60s, tẩy cồn 30s, nhuộm safranin/fuchsin 30s) và phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật sống sót ($N = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1n_2) \cdot v \cdot f_1}$).

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 4 cung cấp toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được từ 3 nội dung nghiên cứu chính:

1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc

Thử nghiệm trên dải nồng độ từ 0,78125 ppm đến 25 ppm cho thấy dung dịch nano bạc có khả năng ức chế hoàn toàn cả hai chủng vi khuẩn ở nồng độ 6,25 ppm. Ở nồng độ $\le 3,125\text{ ppm}$, khuẩn lạc vẫn phát triển.

Nồng độ nano bạc (ppm)	25 (C1)	12,5 (C2)	6,25 (C3)	3,125 (C4)	1,5625 (C5)	0,78125 (C6)	Đối chứng (Nước DI)	MIC xác định
Bacillus cereus	-	-	-	+	+	+	+	6,25 ppm
Staphylococcus aureus	-	-	-	+	+	+	+	6,25 ppm

(Ghi chú: "-" không xuất hiện khuẩn lạc; "+" xuất hiện khuẩn lạc)

2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Chitosan

Thử nghiệm trên dải nồng độ từ 250 ppm đến 3000 ppm cho thấy giá trị MIC của chitosan đối với hai chủng có sự khác biệt rõ rệt. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với B. cereus là 1000 ppm, trong khi đối với S. aureus là 500 ppm. Sự khác biệt này được giải thích do B. cereus có khả năng sinh bào tử và cấu trúc vỏ màng bảo vệ phức tạp hơn so với S. aureus.

Nồng độ Chitosan (ppm)	3000 (C1)	2000 (C2)	1500 (C3)	1000 (C4)	500 (C5)	250 (C6)	Đối chứng (Đệm acetate)	MIC xác định
Bacillus cereus	-	-	-	-	+	+	+	1000 ppm
Staphylococcus aureus	-	-	-	-	-	+	+	500 ppm

3. Kết quả lựa chọn công thức phối trộn Chitosan và Nano bạc

Tác giả tiến hành phối trộn 4 công thức kết hợp dựa trên các mức nồng độ MIC và MIC/2 của từng chất riêng lẻ:

Hiệu quả kháng vi khuẩn Bacillus cereus:

Công thức	Chitosan (ppm)	Nano bạc (ppm)	Xuất hiện khuẩn lạc	Đánh giá hiệu quả
CT1	500 (MIC/2)	3,125 (MIC/2)	+	Không ức chế hoàn toàn
CT2	500 (MIC/2)	6,25 (MIC)	-	Ức chế hoàn toàn (Tối ưu)
CT3	1000 (MIC)	3,125 (MIC/2)	+	Không ức chế hoàn toàn
CT4	1000 (MIC)	6,25 (MIC)	-	Ức chế hoàn toàn

Hiệu quả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus:

Công thức	Chitosan (ppm)	Nano bạc (ppm)	Xuất hiện khuẩn lạc	Đánh giá hiệu quả
CT1	250 (MIC/2)	3,125 (MIC/2)	+	Không ức chế hoàn toàn
CT2	250 (MIC/2)	6,25 (MIC)	-	Ức chế hoàn toàn (Tối ưu)
CT3	500 (MIC)	3,125 (MIC/2)	+	Không ức chế hoàn toàn
CT4	500 (MIC)	6,25 (MIC)	-	Ức chế hoàn toàn

Thảo luận của tác giả: Hiệu quả kháng khuẩn của chế phẩm phối hợp phụ thuộc chủ yếu vào sự duy trì nồng độ nano bạc ở mức 6,25 ppm. Khi giảm nồng độ nano bạc xuống 3,125 ppm (CT1, CT3), vi khuẩn vẫn mọc dù nồng độ chitosan ở mức MIC. Ngược lại, khi giữ nano bạc ở mức 6,25 ppm, nồng độ chitosan có thể giảm xuống một nửa (MIC/2) mà vẫn đảm bảo ức chế hoàn toàn vi khuẩn. Nguyên nhân được giải thích là do các mạch phân tử polymer chitosan tạo phức với các ion bạc giải phóng từ nano bạc, giúp hệ dung dịch phân tán ổn định; nồng độ nano bạc đóng vai trò tác nhân diệt khuẩn trực tiếp và quyết định, trong khi chitosan vừa tham gia ức chế màng tế bào vừa giảm lượng hoạt chất cần dùng. Để tiết kiệm chi phí hóa chất, công thức CT2 được lựa chọn là công thức phối trộn tối ưu cho cả hai đối tượng.

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Tổng kết các thông số thực nghiệm đã đạt được về giá trị MIC và tỷ lệ phối trộn tối ưu; đồng thời đề xuất hai kiến nghị nhằm hoàn thiện và mở rộng phạm vi nghiên cứu.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

1. Xác định chính xác giá trị MIC đơn chất:
   • Nano bạc có nồng độ ức chế tối thiểu đối với cả Bacillus cereus và Staphylococcus aureus là 6,25 ppm.
   • Chitosan có nồng độ ức chế tối thiểu đối với Bacillus cereus là 1000 ppm và đối với Staphylococcus aureus là 500 ppm.
2. Xác định công thức phối hợp tối ưu:
   • Đối với Bacillus cereus: Công thức phối hợp tối ưu gồm Chitosan 500 ppm + Nano bạc 6,25 ppm (giảm 50% nồng độ chitosan so với khi dùng đơn chất).
   • Đối với Staphylococcus aureus: Công thức phối hợp tối ưu gồm Chitosan 250 ppm + Nano bạc 6,25 ppm (giảm 50% nồng độ chitosan so với khi dùng đơn chất).
3. Làm sáng tỏ vai trò thành phần trong phức hợp: Nghiên cứu chứng minh nồng độ nano bạc giữ vai trò quyết định trong việc ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương khi phối hợp với chitosan, cho phép giảm nồng độ polymer sinh học mà vẫn duy trì hiệu quả kháng khuẩn tuyệt đối trong điều kiện thí nghiệm.

Giải pháp và đề xuất ứng dụng

• Ứng dụng công thức phối hợp chitosan – nano bạc nồng độ thấp để tạo màng bảo quản hoặc dung dịch xử lý bề mặt nông sản, thực phẩm, giúp ngăn ngừa các tác nhân gây ngộ độc thức ăn (B. cereus, S. aureus).
• Giảm thiểu chi phí vật liệu chitosan và tối ưu hóa lượng sử dụng nano bạc nhằm đảm bảo an toàn sinh học và hiệu quả kinh tế trong bảo quản.

Đóng góp về mặt học thuật và thực tiễn

• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm cụ thể về ngưỡng nồng độ ức chế của phức hệ chitosan – nano bạc đối với vi khuẩn Gram dương tại Việt Nam.
• Góp phần khẳng định tính khả thi của việc kết hợp polymer tự nhiên từ phụ phẩm thủy sản với vật liệu nano kim loại phục vụ công nghệ sau thu hoạch.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro) trên hai chủng vi khuẩn Gram dương chuẩn (Staphylococcus aureus subsp. và Bacillus cereus ATCC®13061™) trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo MP, chưa thử nghiệm trực tiếp trên các đối tượng nền thực phẩm hoặc nông sản thực tế.
• Chưa khảo sát sự biến thiên của kích thước hạt nano bạc trước và sau khi tạo phức với chitosan, cũng như chưa đánh giá độ bền của phức chất theo thời gian lưu trữ dài ngày.

Hướng nghiên cứu tiếp (Theo đề nghị của tác giả)

• Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện hơn các phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan, nano bạc và chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.
• Mở rộng nghiên cứu khả năng kháng các loài vi khuẩn khác (bao gồm cả vi khuẩn Gram âm và nấm gây bệnh thực vật).

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Bảo quản Nông sản: Tham khảo quy trình bố trí thí nghiệm vi sinh xác định giá trị MIC bằng phương pháp pha loãng liên tiếp; kỹ thuật phối trộn phức hợp kháng khuẩn; phương pháp đếm khuẩn lạc CFU và nhuộm Gram vi khuẩn.
• Người làm nghiên cứu về vật liệu nano sinh học: Cung cấp thông tin tổng quan có hệ thống về cơ chế kháng khuẩn của chitosan, các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền hạt nano bạc, cũng như tài liệu tham khảo trong nước và quốc tế liên quan đến màng composite kháng khuẩn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với Bacillus cereus và Staphylococcus aureus là bao nhiêu?
Theo kết quả thực nghiệm tại Phần 4 của khóa luận, nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với cả hai chủng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus đều là 6,25 ppm.

2. Tại sao giá trị MIC của chitosan đối với Bacillus cereus lại cao gấp đôi so với Staphylococcus aureus?
Nồng độ MIC của chitosan đối với B. cereus là 1000 ppm, cao hơn so với mức 500 ppm của S. aureus. Tác giả giải thích điều này xuất phát từ đặc tính cấu tạo của vi khuẩn: B. cereus có khả năng sinh nội bào tử (nha bào) và có cấu trúc màng ngoài/lớp nhầy bảo vệ vững chắc hơn, đòi hỏi nồng độ chất kháng khuẩn cao hơn để bị ức chế.

3. Công thức phối trộn tối ưu giữa chitosan và nano bạc được tác giả lựa chọn cho từng loài vi khuẩn là gì?
Công thức tối ưu được chọn là CT2:

• Đối với B. cereus: Chitosan 500 ppm phối hợp với Nano bạc 6,25 ppm.
• Đối với S. aureus: Chitosan 250 ppm phối hợp với Nano bạc 6,25 ppm.

4. Khi phối trộn hai thành phần, yếu tố nào đóng vai trò quyết định đến khả năng kháng khuẩn của chế phẩm?
Dữ liệu thực nghiệm từ các công thức CT1 đến CT4 chỉ ra rằng hiệu quả ức chế phụ thuộc chủ yếu vào sự hiện diện của nano bạc ở mức MIC (6,25 ppm). Khi giảm nano bạc xuống 3,125 ppm, vi khuẩn vẫn mọc dù chitosan ở mức MIC; trong khi nếu giữ nano bạc ở mức 6,25 ppm thì nồng độ chitosan có thể giảm 50% mà vi khuẩn vẫn bị ức chế hoàn toàn.

5. Nguồn gốc các vật liệu chính được sử dụng trong khóa luận từ đâu?
Dung dịch chitosan được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; dung dịch nano bạc nồng độ gốc 100 ppm được cung cấp bởi Phòng Nghiên cứu Vi sinh vật, Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Lâm Thái đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra khi xác định chính xác nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc (6,25 ppm cho cả hai chủng) và chitosan (1000 ppm đối với B. cereus, 500 ppm đối với S. aureus). Nghiên cứu đã xác lập được công thức phối hợp tối ưu (giảm 50% lượng chitosan cần dùng khi kết hợp cùng 6,25 ppm nano bạc) giúp ức chế hoàn toàn hai chủng vi khuẩn Gram dương thường gây ngộ độc thực phẩm. Đây là công trình thực nghiệm vi sinh học có giá trị tham khảo rõ ràng về mặt phương pháp và số liệu cho các định hướng nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học - nano trong bảo quản nông sản và an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Chitosan là chế phẩm sinh học, được hình thành từ quá trình deacetyl hóa chitin, có nhiều ở các loại giáp xác. Sản xuất chitosan không những góp phần làm giảm ảnh hưởng đến môi trường từ các phế liệu thủy sản mà còn tạo giá trị kinh tế lớn hơn. Chitosan có các tính chất quan trọng, như là chất phụ gia thực phẩm, tạo màng bao gói, khả năng kháng khuẩn, làm giảm quá trình thoát hơi nước của sản phẩm ở mọi điều kiện trong bảo quản và đặc biệt không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng, vì thế chitosan đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Bạc được biết đến như một trong những nguyên tố có khả năng khử trùng mạnh tồn tại trong tự nhiên.

Các đây 200 năm các nhà khoa học đã xem huyết thanh người như là một dịch keo, vì vậy keo bạc đã được sử dụng làm chất kháng khuẩn ngay trong cơ thể con người. Kể từ đó keo bạc được sử dụng rộng rãi để chữa các bệnh nấm trên da, điều trị các vết thương, vết bỏng, các bệnh răng miệng, làm thuốc nhỏ mắt. Tuy nhiên, sau khi thuốc kháng sinh được phát minh (giữa thế kỉ 20) với hiệu lực khử trùng mạnh hơn, keo bạc đã bị thay thế dần. Nhưng chỉ 30 năm sau đó người ta đã nhận ra rằng có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng chống lại những tác dụng của thuốc kháng sinh và vấn đề này ngày càng trở nên đáng lo ngại.

Lúc này tính năng kháng khuẩn của bạc lại được chú ý do có phổ tác dụng rộng và không bị hạn chế bởi hiệu ứng kháng thuốc [31, 23]. Ngày nay, việc tạo ra các vật thể kích thước nano đã trở nên phổ biến, ở kích thước này các hạt vật chất thể hiện nhiều tính chất lý-hóa khác thường so với khi vật chất đó ở trạng thái khối, khả năng kháng khuẩn của nó cao hơn 20-60 ngàn lần so với ion Ag+ [10]. Các hạt nano bạc với năng lượng bề mặt lớn có khả năng giải phóng từ từ các ion bạc vào trong dung dịch, nhờ vậy nano bạc có hiệu lực khử khuẩn mạnh hơn rất nhiều lần và kéo dài hơn so với các bạc ở dạng keo, dạng ion hay dạng rắn [31, 24]. Chính những tính chất lượng tử đặc biệt này nên nano bạc sẽ bị biến thể trong gian bảo quản, để ổn định được nó cần phải có một phương pháp chế tạo đặc biệt giúp cho khả năng sử dụng được triệt để hơn.

Dựa vào đặc tính quý giá trên, ý tưởng kết hợp hai loại vật liệu đã được hình thành. Chitosan loại chế phẩm có khả năng kháng khuẩn, không gây độc và có khả năng tạo thành lớp màng mỏng bao quanh thực phẩm. Nano bạc, là vật liệu có khả n 2 năng kháng khuẩn cực mạnh chỉ với nồng độ rất nhỏ, nhưng lại dễ bị oxi hóa. Khi sử dụng kết hợp với nhau sẽ cho ra 1 hỗn hợp dung dịch bền vững có hoạt tính mạnh để ứng dụng rộng rãi trong sản xuất.

Vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus đều là vi khuẩn Gram dương là hai loài vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên (Đất, nước, cơ thể người, động vật …), loài vi khuẩn tồn tại rất phổ biến trong nông sản và thực phẩm. Chúng là những tác nhân gây ra các vụ ngộ độc trong thực phẩm trên khắp cả nước trong thời gian qua. Chính vì sự phổ biến và tác hại nguy hiểm của nó đối với con người nên chúng tôi đã tập trung toàn bộ thời gian làm khóa luận của mình “Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Gram dương của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc”. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.

Mục đích - Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. - Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. - Nghiên cứu kết hợp được chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus. Yêu cầu - Tìm ra sự kết hợp tối ưu kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc.

- Đánh giá kết quả kháng vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1. Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế. Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu và cái nhìn tổng quát hơn.

Ý nghĩa thực tiễn - Hiện nay nano bạc và chitosan được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm, nông nghiệp, xử lí môi trường… - Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc ứng dụng trong bảo quản các loại thực phẩm. n 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN 2. Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan 2.

Lịch sử và nguồn gốc chitin/chitosan Về mặt lịch sự, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811, trong cặn dịch chiết từ một loài nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1923, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là “chitin” hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose.

Sự xuất hiện của nitơ trong chitin đã được Lassaige chứng minh vào năm 1843, từ đó nhân loại bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng lâu dài hợp chất này và các dẫn xuất của nó [25]. Ở động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn. Ở động vật bậc cao, monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo,…[6].

Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan – dẫn xuất của chitin được xem là polymer tự nhiên quan trọng, nhiều thứ hai sau cellulose, các nghiên cứu đã cho thấy chitosan có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm,… Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, không giống chất xơ thực vật, chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất cấu trúc quang học,… Chitosan còn là chất cao phân tử mang điện tích dương duy nhất trong tự nhiên, nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và axit. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm, các polymer có nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan được coi như một vật liệu mới có ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dược, y học, xử lý nước thải và trong công nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, ổn định hay tác nhân kháng khuẩn,… n 4 Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin – chitosan chiếm khá cao, dao động từ 14 – 34% so với trọng lượng khô [35].

Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan. Một số loài giáp xác chứa chitin 2. Cấu trúc hóa học của chitosan Công thức cấu tạo của chitin: Hình 2.2: Công thức cấu tạo của Chitin Chitosan thu được từ quá trình deacetyl hóa chitin, thay thế nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [3].

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitosan: n 5 C H 2O H C H 2O H O O H H H O H O OH H OH H H H H NH2 H N H C O C H3 Hình m n 2.3: Cấu trúc hóa học của Chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp [1]. Tính chất cơ bản của chitosan 2.

Tính chất vật lý a. Đặc tính bề ngoài: Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng ngà, không mùi, không vị, có thể xay nhỏ ở các kích thước khác nhau. Nhiệt độ nóng chảy: Nóng chảy ở 309 - 311oC tùy vào trọng lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa. Mức độ deacetyl hóa: Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao.

Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi nó ảnh hưởng đến tính chất lý hóa, khả năng ứng dụng của chitosan [6]. Mức độ deacetyl hóa vào khoảng 70 - 100% phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp sử dụng. Có nhiều phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan như: Thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ pH…. Trong đó phương pháp sử dụng hồng ngoại thường được sử dụng để thiết lập các giá trị mức độ deacetyl hóa của chitosan.

Khi ở mức độ deacetyl hóa thấp, chitosan có khả năng hút ẩm lớn do vậy trước khi phân tích chitosan cần phải sấy [26]. Trọng lượng phân tử: Chitosan là polyme sinh học có khối lượng phân tử cao khoảng 10000-1200000Da tùy theo điều kiện sản xuất. Thông thường khi nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan. Trọng lượng phân tử khác nhau dẫn đến đặc tính của từng loại chitosan là khác nhau, người ta thường phân loại chitosan dựa vào trọng lượng phân tử.

Trọng lượng phân tử có thể xác định bằng phương pháp sắc ký, phân tán ánh sáng hoặc đo độ nhớt [37, 29]. Độ nhớt: Độ nhớt là nhân tố quan trọng dể xác định khối lượng phân tử của chitosan [1, 36]. Chitosan có phân tử lượng lớn làm cho dung dịch có độ nhớt cao.